Name: Wykrywanie i kwantyfikacja nanorurek tunelowych za pomocą obrazów 3D w widoku objętości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Poznaj metodę wykrywania nanorurek tunelowych w komórkach przy użyciu obrazowania 3D z konfokalnej mikroskopii laserowej. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę struktur F-actin odpowiedzialnych za komunikację międzykomórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.K.V i A.R dziękują Manipal Academy of Higher Education za stypendium TMA Pai. Dziękujemy Indyjskiej Radzie ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych za SERB-SRG (#SRG/2021/001315), a także Indyjskiej Radzie Badań Medycznych Indii (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) oraz funduszowi Intramural Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Indie. Dziękujemy ośrodku konfokalnym JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Indie) oraz firmie B. Suma za mikroskopię konfokalną w JNCASR.

UWAGA: Komórki SH-SY5Y hodowane w pożywkach DMEM/F-12 różnicowano za pomocą 10 μM kwasu retinowego przez 7 dni i traktowano oligomerami 1 μM oAβ przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (5% CO2). Po leczeniu komórki utrwalano roztworem utrwalającym Karnovsky'ego i podwójnie barwiono immunologicznie przeciwciałem fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) i falloidyną wiążącą F-aktynę. Później konfokalne obrazy stosu z użyciem konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. TNT określono ilościowo za pomocą ręcznego liczenia i odróżniono od innych neurytów/wypukłości komórkowych poprzez konstruowanie obrazów 3D widoku objętościowego i identyfikowanie struktur na podstawie ich charakterystyki unoszenia się między dwiema komórkami bez dotykania podłoża (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
1. Hodowla komórkowa i różnicowanie
<ol>
	<li>Hodowla komórek neuronalnych SH-SY5Y w pożywce DMEM/F12 (Hama) w stosunku 1:1 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% mieszaniną penicyliny, streptomycyny i neomycyny (PSN). Zasiej komórki w naczyniu do obrazowania o średnicy 35 mm z 14-milimetrowym dołkiem utworzonym z szkiełka nakrywkowego #1.5 pośrodku naczynia przymocowanego do dna. Zasiaj komórki na czaszy obrazowania w stężeniu 12 000 komórek/cm2 i przeprowadź eksperymenty przy zbiegu 60%-70%.</li>
	<li>Częściowo różnicować komórki za pomocą 10 μM kwasu retinowego (RA) ze 100 mM roztworu podstawowego (5 mg RA w 15 ml dimetylosulfotlenku [DMSO]). Następnie inkubować komórki przez 7 dni w temperaturze 37 °C (5% CO2 ) w celu różnicowania ze zmianą pożywki co 2 dni. 
	UWAGA: Uważaj na utrzymanie zbiegu (60%-70%) komórek (zarówno komórek niezróżnicowanych, jak i częściowo zróżnicowanych). Gęstość komórek może wpływać na tworzenie się TNT między komórkami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie oligomerów β amyloidu1-42 (oAβ) do leczenia komórek nerwowych
<ol>
	<li>Rozpuścić Aβ 1-42 (1 mg) w 200 μl 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu i podzielić roztwór na 20 podwielokrotności, z których każda zawiera 0,05 mg peptydów. Liofilizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy (5 mM) liofilizowanego Aβ 1-42 w DMSO, dodając 2,2 μl DMSO do 0,05 mg liofilizowanego peptydu. Aby ostrożnie rozpuścić peptydy, należy zwirować roztwór i sonikować przez 2 minuty w sonikatorze łaźni wodnej.</li>
	Rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia 100 μM w DMEM, pH 7,4 i zawirować w celu przekształcenia peptydów w monomery, a następnie przeprowadzić inkubację w temperaturze 4 °C przez 24 godziny w celu uzyskania oligomerów Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.<li></li>
	<li>Scharakteryzuj oAβ przed eksperymentami, jak opisano wcześniej21,22 za pomocą obrazowania w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.</li>
	<li>Częściowo zróżnicowane komórki SH-SY5Y należy potraktować 1 μM oAβ. Usuń pożywkę przed zabiegami i dodaj świeży DMEM wolny od FBS. Po zmianie pożywki dodać wcześniej przygotowane oAβ (100 μM) do pożywki do końcowego stężenia 1 μM. Inkubować komórki z 1 μM oAβ przez 2 godziny w temperaturze 37 °C (5 % CO2 ). Uwzględnij kontrolę negatywną w postaci nieleczonych komórek.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne F-aktyny i aktywowanego PAK1 w celu scharakteryzowania TNT
<ol>
	<li>Wykonaj różnicowe barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciała fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) i falloidyny wiążącej fallotynę F-aktyny.</li>
	<li>Przemyć komórki kontrolne i poddane działaniu oAβ 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) przez 2 x 2 minuty przed utrwaleniem. Przygotować roztwór utrwalający Karnovsky'ego, używając 2% utrwalacza formaliny i 2,5% aldehydu glutarowego rozpuszczonego w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,2. Następnie utrwal komórki w naczyniu do obrazowania, dodając roztwór utrwalający Karnovsky'ego (tylko tyle, aby pokryć komórki) przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć utrwalone komórki 2 x 2 minuty przy użyciu buforu do inkubacji. Przygotować bufor inkubacyjny (20x) rozpuszczając 0,1 g saponiny w 5 ml FBS i rozcieńczyć do 1x, dodając 95 ml 1x PBS.</li>
	<li>Po utrwaleniu dodać pierwsze przeciwciało przeciwko phopho-PAK1 w rozcieńczeniu 1:250 do buforu inkubacyjnego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemnej, wilgotnej komorze.</li>
	<li>Następnego dnia, po 24 godzinach inkubacji, przemyć komórki 2 x 2 minuty buforem do inkubacji, a następnie dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1000) i falloidyną 555 (rozcieńczenie 1:1000). Inkubować komórki w ciemnej, wilgotnej komorze przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki 2 x 2 minuty buforem do inkubacji. Wybarwić jądro, dodając 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) w rozcieńczeniu 1:2,000 i inkubować przez 5 minut do 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przygotuj podłoże montażowe DABCO, używając 25 mg DABCO w 90% glicerolu i 10% 1x PBS. Aby prawidłowo się rozpuścić, dostosuj pH do 8,6 za pomocą klasy spektrofotometrycznej, rozcieńczyć HCl (rozcieńczony wodą w stosunku 1:20) i trzymaj roztwór na kołysce do wymieszania.</li>
	<li>Jako środek przeciwwybielający dodaj podłoże montażowe DABCO bezpośrednio na naczynie obrazowe zawierające szkiełko nakrywkowe na dole. Odczekaj co najmniej 1-2 godziny i bezpośrednio przystąp do wykonywania obrazowania konfokalnego. 
	UWAGA: Do mocowania szkiełek nakrywkowych nie są wymagane żadne kleje.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne F-aktyny i tubuliny β-III w celu odróżnienia TNT od neurytów
<ol>
	<li>Wykonaj różnicowe barwienie immunologiczne za pomocą przeciwciała tubuliny β-III i falloidyny wiążącej F-aktynę fallotoksyny.</li>
	<li>Przemyj komórki poddane działaniu oAβ 2x 1x PBS przed dodaniem roztworu utrwalającego Karnovsky'ego. Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze pokojowej i przemywać komórki 2 x 2 minuty buforem do inkubacji.</li>
	<li>Po utrwaleniu dodać przeciwciało przeciwko tubulinie β-III (TUBb3) w rozcieńczeniu 1:250 w buforze inkubacyjnym i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w ciemnej, wilgotnej komorze.</li>
	<li>Następnego dnia umyj komórki buforem do inkubacji (2 x 2 min) i dodaj do tego samego naczynia przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1,000) i Phalloidyną 555 (rozcieńczenie 1:1,000). Następnie inkubuj komórki przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemnej, wilgotnej komorze.</li>
	<li>Przemyć komórki 2x buforem do inkubacji i dodać DAPI barwiące jądrowo w rozcieńczeniu 1:2,000 przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Dodaj środek wybielający DABCO do podłoża montażowego, jak wspomniano powyżej, i odczekaj 2 godziny przed obrazowaniem.</li>
</ol>
5. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Aby zidentyfikować TNT, należy uchwycić obrazy stosu z komórek barwionych immunologicznie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Zdjęcia można wykonać przy użyciu obiektywu DIC 40x/1,40 Oil z zestawami filtrów DAPI, izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i tetrametylorodaminy (TRITC).</li>
	<li>Najpierw wybierz kanały, klikając kolejno wymagane lasery w oknach Ścieżka 1, Ścieżka 2 i Ścieżka 3 w oprogramowaniu konfokalnym. Kliknij opcję T-PMT poniżej okna Ścieżka 1, aby wykonać obrazy kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) z kanałami fluorescencji. 
	UWAGA: Obrazy DIC są rejestrowane przez inny detektor oznaczony jako T-PMT.</li>
	<li>Wybierz zakładkę pobierania oprogramowania, kliknij kartę Z-stack i poczekaj, aż otworzy się okno. Następnie kliknij skanowanie na żywo, aby ustawić ostrość komórek na dole naczynia. Wybierz ten skoncentrowany obraz jako pierwszy stos. Następnie ustaw ostrość w górę, aby zobaczyć najwyższą część komórki i wybierz ją jako ostatni stos. Zatrzymaj skanowanie na żywo i kliknij liczbę obok optymalnej zakładki, aby ustalić rozmiar kroku stosów. Rozmiar kroku określa liczbę wycinków i interwały na podstawie grubości komórek. 
	UWAGA: Rozmiar kroku zostanie wybrany na podstawie próbkowania Nyquist, aby pobrać wystarczającą liczbę wycinków i upewnić się, że nie ma przerw między dwoma stosami. Próbkowanie Nyquist jest określane na podstawie celu i długości fal lights23.</li>
	<li>Wykonaj sekwencyjne obrazy trzech kanałów DAPI, FITC i TRITC za pomocą laserów 405 nm, 488 nm i 561 nm i uchwyć z czasem przebywania piksela 1,02 μs. Przechwytuj obrazy w kanale DIC z kanałami fluorescencyjnymi, aby obserwować granicę komórki.</li>
	<li>Uchwyć stos obrazów o wymiarach x: 224,92 μm i y: 224,92 μm, z każdym pikselem o rozmiarze 220 nm2 i skalowaniem z 415 nm.</li>
	<li>Zrób zdjęcia przedstawiające kilka stosów z (15-22 stosów) od dołu do góry komórek. Zdobądź co najmniej 10 obrazów z losowego pola naczynia hodowlanego, aby uzyskać w sumie ~200-300 komórek.</li>
	<li>Analizuj przechwycone obrazy w trybie offline, aby zidentyfikować TNT za pomocą analizy widoku objętościowego 3D</li>
</ol>
6. Analiza obrazów konfokalnych stosów z w celu identyfikacji i ilościowego określenia TNT
<ol>
	<li>Otwórz obrazy konfokalne zapisane w formacie danych .czi w oprogramowaniu Fiji w celu analizy.</li>
	<li>Wybierz opcję Hyperstack, aby wyświetlić każdy stos z i kanał obrazu. Poszukaj hiperstosów z-stacków i kanałów, które otwierają się w jednym oknie, jak pokazano na Rysunek 2. Przewiń paski przewijania kanału (oznaczone czerwonymi i zielonymi strzałkami) i z-stack (oznaczone niebieskimi strzałkami), aby wybrać dokładny stos określonego interesującego Cię kanału. 
	UWAGA: W komórkach stałych, ponieważ unoszące się TNT lub kanały membranowe pozostają nad powierzchnią, struktury nie są widoczne w dolnych częściach stosów z. Jednak w komórkach stałych neuryty leżą na powierzchni i są wykrywalne w dolnych częściach stosów z (z = 0 do 2). Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z krokami identyfikacji.</li>
	<li>Jak pokazano w Rysunek 2, najpierw wybierz kanał zabarwiony F-aktyną (oznaczony czerwonymi strzałkami), przewijając pasek kanału. Następnie ręcznie przewiń stosy z (oznaczone niebieskimi strzałkami), aby zobaczyć każdy stos jeden po drugim. Zidentyfikuj struktury zabarwione F-aktyną, które wydają się łączyć komórki, są widoczne w dolnych częściach stosów z i znajdują się blisko powierzchni naczynia obrazowania (z = 2) jako neuryty (oznaczone białymi strzałkami). 
	UWAGA: Większość neurytów jest łatwa do zidentyfikowania, ponieważ wyglądają jak wydłużone wypukłości (oznaczone różowymi strzałkami).</li>
	<li>Zidentyfikuj TNT, F-aktyno-dodatnie, unoszące się kanały międzykomórkowe, przewijając stosy z w kierunku góry (od z = 4 w <silna klasa = "xfig">Rysunek 2; oznaczone żółtymi strzałkami). Szukaj neurytów w pobliżu dolnych części z-stosów w kierunku powierzchni i obserwuj, że zaczynają one znikać wraz z przewijaniem z-stosów w kierunku góry (przy z = 6 w <silna klasa="xfig">Rysunek 2; neuryty nie są wyraźnie widoczne).</li>
	<li>Zidentyfikuj fosfo-PAK1-dodatnie TNT, podobnie jak F-aktyno-dodatnie TNT, analizując unoszący się charakter przewodów od z-stosów. Ponieważ barwienie fosfo-PAK1 jest słabsze niż barwienie F-aktyną, należy szukać TNT barwionych fosfo-PAK1 przy z = 4 (słabo widoczne) i przy z = 6 (wyraźne).</li>
	<li>Następnie obserwuj obrazy DIC, aby sprawdzić, czy struktury TNT barwione F-aktyną i fosfo-PAK1 są kanałami błonowymi między komórkami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Ponadto połącz kanały F-aktyny (czerwone) i fosfo-PAK1 (zielone), aby sprawdzić, czy zidentyfikowane TNT są współbarwionymi strukturami F-aktyny i fosfo-PAK1 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Aby określić ilościowo TNT, należy ręcznie policzyć całkowitą liczbę komórek i zidentyfikowane TNT i przedstawić liczby w procentach.</li>
	<li>Aby odróżnić F-aktynowo-dodatnie TNT i β-III tubuliny (TUBb3), podobne do TNT kanały unoszące się na tle TNT od obrazów stosu z, połącz kanały F-aktyny (czerwony) i TUBb3 (zielony) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4). Następnie przeanalizuj stosy z scalonych obrazów.
	<ol>
		<li>Szukaj wyłącznie TNT barwionych F-aktyną, które są słabo widoczne przy z = 3 i widoczne przy z = 6 i z = 9 (żółte strzałki). Podobnie zidentyfikuj podwójnie dodatnie, przypominające TNT rurki F-aktyny i tubulinę β-III (TUBb3) przy z = 6 i z = 9 (cyjanowe strzałki). Zidentyfikuj inne barwione tubuliną F-aktyną i β-III, nie unoszące się wypukłości z dolnych części stosów z (białe strzałki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz średnicę trotylu za pomocą narzędzia do linii na Fidżi. Sprawdź skalę pomiaru, klikając przycisk Analizuj | Ustaw skalę tak, aby "odległość w pikselach" była ustawiana automatycznie z obrazów .czi. Zmierz średnice trotylu w płaszczyźnie xy. 
	UWAGA: Większość średnic mieści się w zakresie od 1 piksela do 4 pikseli (tj. 220-880 nm); Każdy piksel ma długość fali 220 nm. Zobacz Rysunek 5 zawiera podsumowanie protokołu analizy obrazów konfokalnych z-stack</li>.
</ol>
7. 3D rekonstrukcja obrazów z-stack w celu scharakteryzowania TNT
<ol>
	<li>Użyj wtyczki przeglądarki woluminów na Fidżi, która umożliwia ponowne cięcie 3D i wizualizację 3D z obsługą progów (Rysunek 6).</li>
	<li>Podziel obrazy z-stack na poszczególne kanały. Następnie przytnij jednokanałowe (kanał F-aktyny) obrazy z-stack, aby użyć widoku rekonstrukcji 3D do podświetlenia jednego lub dwóch TNT lub neurytów na raz. Włącz wtyczkę widoku woluminu, aby wizualizować widoki xy, yz i xz.</li>
	<li>Przypnij pojedynczy TNT lub neuryt w płaszczyźnie xy (białe strzałki reprezentują neuryty w <silna klasa="xfig">Rysunek 6A; żółte strzałki reprezentują TNT w <silna klasa="xfig">Rysunek 6B) i zaznacz przekroje osi xz (czerwony) i yz (zielony). Obserwuj neuryty na dole płaszczyzny xz w płaszczyznach xz i yz (białe strzałki, <silna klasa="xfig">Rysunek 6A) i TNT w górnych stosach z (żółte strzałki, <silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
	<li>Wybierz pojedynczy TNT lub neuryt, aby zrekonstruować widok objętości 3D w płaszczyźnie xz (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C, D). W rekonstrukcji 3D obserwuj neuryty na dole płaszczyzny z (białe strzałki, <silna klasa="xfig">Rysunek 6C) oraz TNT pojawiające się jako unoszące się struktury łączące dwie komórki bez dotykania dolnej płaszczyzny z (żółte strzałki, <silna klasa = "xfig">Rysunek 6D).</li>
</ol>

<ol><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li>
<li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484(2018).</li>
<li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789(2021).</li>
<li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984(2017).</li>
<li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798(2021).</li>
<li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+communication+by+tunneling+nanotubes%3A+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li>
<li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li>
<li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090(2018).</li>
<li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes%3A+Diversity+in+morphology+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934(2014).</li>
<li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research%3A+How+far+from+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306(2021).</li>
<li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotubes%3A+Reshaping+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li>
<li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246(2021).</li>
<li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li>
<li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+block+of+tunneling+nanotube+%28TNT%29+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li>
<li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547(2017).</li>
<li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes%3A+Implications+in+disease+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36(2021).</li>
<li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li>
<li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li>
<li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429(2012).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li>
<li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li>
<li>Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).</li>
<li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li>
<li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li>
<li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li>
<li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711(2021).</li>
<li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Kilku badaczy w ciągu ostatnich 2 dekad próbowało zrozumieć i scharakteryzować strukturę trotylu18. Brak specyficznych markerów hamuje postęp i rośnie zapotrzebowanie na wygodną, ustandaryzowaną metodę, którą można wykorzystać do identyfikacji, scharakteryzowania i ilościowego określenia TNT. TNT definiuje się jako przewody błonowe oparte na F-aktynie, które unoszą się między dwiema komórkami. Badania wykazały, że β-tubulino-dodatnie, zamknięte, rozwijające się neuryty unoszą się między dwiema odl...

Tunelujące nanorurki (TNT) są oparte na F-aktynie, głównie otwartymi kanałami błonowymi i odgrywają istotną rolę w międzykomórkowym transporcie ładunku i organelli1. Unikalną cechą trotylu jest to, że łączą sąsiednie komórki bez kontaktu z podłożem; Mają ponad 10-300 μm długości, a ich średnice wahają się od 50 nm do 1 μm2,3. TNT są strukturami przejściowymi, a ich żywotność trwa od kilku minut do kilku godzin. TNT po raz pierwszy zademonstrowano w komórkach neuronalnych PC121; Później liczne badania wykazały ich istnienie w kilku typach komórek in vitro i in vivo4,5. Kilka badań ujawniło patologiczne znaczenie trotylu w różnych modelach chorób, takich jak choroby neurodegeneracyjne, nowotwory i infekcje wirusowe6,7,8.
Strukturalne niejednorodności TNT zostały wykazane w kilku badaniach w różnych systemach komórkowych9. Różnice wynikają ze składu cytoszkieletu, mechanizmu powstawania i typów przenoszonych ładunków10. Przede wszystkim uważa się, że otwarta, F-aktynowo-dodatnia ciągłość błony, która unosi się między dwiema sąsiednimi komórkami i przenosi organelle, składa się z TNTs11. Jednak brak jasności lub różnorodności obserwowany w tworzeniu TNT zwiększa trudności w opracowywaniu markerów specyficznych dla TNT. W związku z tym trudno jest zidentyfikować struktury TNT za pomocą konwencjonalnych metod wykrywania i rozróżnić nanorurki membranowe pod względem wypukłości otwartych i zamkniętych12. Jednak cecha TNT polegająca na unoszeniu się jako wypukłości błony F-aktyny między dwiema komórkami jest stosunkowo łatwiejsza i bardziej wykonalna do zidentyfikowania przy użyciu konwencjonalnych technik obrazowania. Inne wypukłości komórkowe oparte na aktynie, takie jak filopodia i filopodia grzbietowe, nie mogą unosić się między dwiema odległymi komórkami, szczególnie gdy komórki są unieruchomione. Warto zauważyć, że zamknięte, elektrycznie sprzężone, rozwijające się neuryty są często określane jako struktury podobne do TNT13.
Wiadomo, że F-aktyna odgrywa ważną rolę w tworzeniu TNT, a kilka badań wykazało, że inhibitor F-aktyny cytochalazyna D hamuje powstawanie TNTs14,15. W przeciwieństwie do tego, inhibitory mikrotubul nie mają żadnego wpływu na tworzenie TNT16. W ciągu ostatnich 2 dekad pojawiło się kilka doniesień na temat znaczącej roli, jaką TNT odgrywają w rozprzestrzenianiu się patologii i oporności nowotworów oraz terapii17. W związku z tym istnieje niekończące się zapotrzebowanie na lepsze techniki charakteryzacji trotylu.
Brak specyficznych markerów TNT oraz różnorodność morfologii i składu cytoszkieletu utrudniają opracowanie unikalnej metody charakterystyki. W niektórych badaniach wykorzystano techniki automatycznego wykrywania obrazów i kwantyfikacji TNT18,19. Istnieje jednak kilka zalet obecnej metody ręcznej analizy objętości 3D w porównaniu z automatyczną analizą obrazu w celu wykrywania i kwantyfikacji trotylu. Często wyszkolone ludzkie oczy mogą dostrzec te unoszące się w powietrzu nanostruktury łatwiej niż automatyczna metoda wykrywania obrazu. Co więcej, metody automatycznego wykrywania mogą być trudne do wdrożenia w laboratoriach, w których brakuje wiedzy specjalistycznej w zakresie algorytmów. Obecna metoda może być szeroko stosowana przez naukowców ze względu na swoją precyzję i powtarzalność.
W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że oAβ promuje biogenezę TNT w komórkach neuronalnych poprzez zależny od aktu mechanizm endocytozy za pośrednictwem PAK112. TNT indukowane przez oAβ również wyrażają aktywowany PAK1 (lub phospho-PAK1). Opracowaliśmy metodę rekonstrukcji obrazu 3D w widoku objętościowym, aby odróżnić TNT indukowane oAβ, F-aktyną i fosfo-PAK1 immunostainowane. β-III tubulino-dodatnie, rozwijające się neuryty często przypominają unoszące się struktury podobne do TNT20. W związku z tym dodatkowo odróżniliśmy TNT na bazie F-aktyny od neurytów β-III tubulinowo-dodatnich i innych wypukłości podobnych do TNT. Obrazy 3D w widoku objętościowym zostały wykorzystane do identyfikacji TNT na podstawie ich cech unoszenia się nad podłożem i pozostawania połączonym między dwiema sąsiednimi komórkami. W artykule opisano identyfikację i detekcję przewodów błonowych zawierających aktynę lub TNT za pomocą konfokalnych obrazów stosu Z i wreszcie ręczną kwantyfikację zidentyfikowanych struktur na podstawie obrazów rekonstrukcji 3D w widoku objętości. Przedstawiona metoda nie jest w stanie odróżnić otwartych właściwych TNT od zamkniętych struktur podobnych do TNT; metoda ta pomaga zidentyfikować TNT w hodowli komórkowej 2D in vitro na płaskim podłożu. Metoda ta jest jednak łatwa do wdrożenia i odtworzenia i może być szeroko stosowana do precyzyjnego oznaczania ilościowego tylko TNT na bazie aktyny oraz do odróżniania ich od neurytów i struktur podobnych do TNT dodatnich β-tubuliny.

<table><tbody><tr><td>Naczynie 35 mm z dołkiem 14 mm wykonane z #1,5 szkiełka nakrywkowego</td><td>Cellvis</td><td>D35-14-1,5-N</td><td>Naczynie do obrazowania używane do wysiewu komórek do eksperymentów barwiących</td></tr><tr><td>A&beta; (1-42) 1 mg</td><td>AnaSpec</td><td>#64129</td><td>Oligomery beta amyloidu w leczeniu komórek</td></tr><tr><td>Mąka Alexa 488 Koza Anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla phospho-PAK1</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td><td>51025411</td><td>Zapewnij odpowiednie warunki do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator Thermo</td><td>Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td><td>51026556</td><td>Do hodowli komórek w temperaturze ciała lub w jej pobliżu</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>ZEISS (Carl Zeiss)</td><td>LSM 880</td><td>Potrafi generować trójwymiarowe obrazy dużych próbek w superrozdzielczości</td></tr><tr><td>DABCO [1,4-diazobicyclo-(2,2,2) oktan]</td><td>Merck</td><td>8034560100</td><td>Odczynnik przeciwwybielający</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenyloindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Neuclear stainer</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>media Gibco</td><td>11965092</td><td>Służy do przygotowania 100uM A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM/F12 (mieszanina DMEM i szynki w stosunku 1:1) s F12)</td> <td>Gibco</td><td>12500062</td><td>Pożywka hodowlana dla SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO (siarczek dimetylu) Klasa hodowli komórkowej</td><td>Cryopur</td><td>CP-100</td><td>Klasa hodowli komórkowej stosowana jako środek rozpuszczający kwas retinowy</td></tr><tr><td>DMSO (siarczek dimetylu) Klasa molekularna</td><td>Himedia</td><td>MB058</td><td>Stosowany jako jeden ze środków rozpuszczających liofilizowany A &beta; (1-42)</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>&nbsp; Główny suplement do pożywek hodowlanych (pochodzenie z USA)</td></tr><tr><td>Utrwalacz formaliny (neutralny buforowany 10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td>Składnik w roztworze utrwalającym Karnovsky'ego</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (stopień I, 25% w H2O)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>Składnik w roztworze utrwalającym Karnovsky'ego</td></tr><tr><td>HFIP (1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol) roztwór</td><td>TCI</td><td>H024</td><td>Służy do rozpuszczania A&beta; (1-42) 1 mg</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania/analizy obrazu: FIJI (ImageJ)</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia (NIH)</td><td></td><td>Służy do przetwarzania/analizy obrazów i odróżniania TNT od neurytów za pomocą wtyczki o nazwie "przeglądarka woluminów".</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Chrystus, Alpha</td><td>2,4 LDplus</td><td>0,05 mg porcje A&beta; (1-42) może być przechowywany w -20 &deg; C tylko po liofilizacji</td></tr><tr><td>Mieszanina penicyliny, streptomycyny i neomycyny</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>15640055</td><td>Mieszanina antybiotyków</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlor 555</td><td>Abcam</td><td>ab176756</td><td>Barwnik wiążący F-aktynę</td></tr><tr><td>Phospho-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) [Królik]</td><td>CST</td><td>#2601</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne przeciwko tubulinie Beta 3 (TUBb3)</td> <td>Klon chmury</td><td>PAE711Hu01</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Odczynnik różnicujący</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Merck</td><td>8047-15-2</td><td>Detergent stosowany w buforze inkubacyjnym w barwieniu immunologicznym</td></tr><tr><td>Sonikator kąpieli wodnej (kwarta, grzałka zaworu spustowego)</td><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>3.0 L/3.2</td><td>Sonikator używany do rozpuszczania A&beta; (1-42) bulion, po dodaniu do niego DMSO podczas przygotowywania 100 &mikro; M A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikroskopii ZEN</td><td>ZEISS (Carl Zeiss)</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania do pozyskiwania obrazów mikroskopii konfokalnej z inteligentną automatyzacją</td></tr></tbody></table>

wykrywanie i kwantyfikacja nanorurek tunelowych za pomocą obrazów 3d w widoku objętości

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Ostatnie odkrycia ujawniły, że komórki wykonują bezpośredni, daleki, międzykomórkowy transfer za pomocą nano-skalowych kanałów aktynowo-błonowych, a konkretnie "tunelujących nanorurek" (TNT). TNT definiuje się jako otwarte, dwuwarstwowe przedłużenia błony otoczone lipidami, które pośredniczą w ciągłości między sąsiednimi komórkami o średnicach od 50 nm do 1 μm. TNT wykazano początkowo w komórkach neuronalnych, ale kolejne badania wykazały istnienie TNT w kilku typach komórek i chorobach, takich jak choroby neurodegeneracyjne, infekcje wirusowe i nowotwory. Kilka badań odnosiło się do zamkniętych, elektrycznie sprzężonych nanostruktur błonowych między sąsiednimi komórkami jako TNT lub struktur podobnych do TNT.
Wyjaśnienie ultrastruktury w kategoriach ciągłości membrany na końcu jest technicznie trudne. Ponadto badania nad komunikacją komórka-komórka są trudne pod względem charakterystyki TNT przy użyciu konwencjonalnych metod ze względu na brak specyficznych markerów. TNT są przede wszystkim definiowane jako otwarte wypukłości błonowe na bazie F-aktyny. Jednak jednym z głównych ograniczeń jest to, że F-aktyna jest obecna we wszystkich rodzajach wypukłości, co utrudnia odróżnienie trotylu od innych występów. Jedną z godnych uwagi cech TNT opartych na F-aktynie jest to, że struktury te unoszą się między dwiema komórkami bez dotykania podłoża. Dlatego wyraźne TNT barwione F-aktyną można wygodnie odróżnić od innych występów, takich jak filopodia i neuryty, na podstawie ich unoszenia się między komórkami.
Ostatnio wykazaliśmy, że internalizacja oligomerycznego β amyloidu1-42 (oAβ) poprzez endocytozę zależną od aktyny stymuluje aktywowaną kinazę p21-1 (PAK1), która pośredniczy w tworzeniu TNT zawierających F-aktynę koeksprymowanych z fosfo-PAK1 między komórkami neuronalnymi SH-SY5Y. Protokół ten przedstawia metodę analizy objętościowej 3D w celu identyfikacji i scharakteryzowania TNT na podstawie przechwyconych obrazów stosu z wypukłości błon barwników immunologicznych F-aktyny i fosfo-PAK1 w komórkach neuronalnych traktowanych oAβ. Ponadto TNT odróżnia się od rozwijających się neurytów i wyrostków neuronalnych opartych na przewodach błonowych barwionych immunologicznie tubuliną F-aktyną i β-III.

W niniejszej pracy identyfikujemy i charakteryzujemy TNT indukowane przez oAβ w neuronalnych komórkach SH-SY5Y poprzez tworzenie trójwymiarowych obrazów wolumetrycznych z obrazów confocal z-stack (Rysunek 1). Komórki poddano podwójnemu barwieniu immunologicznemu na F-aktynę oraz fosfo-PAK1. Przeanalizowano obrazy confocal z-stack zabarwionych komórek w celu identyfikacji TNT (Rysunek 2). Następnie przeanalizowano obrazy DIC, aby potwierdzić, że struktury TNT zab...

Nanorurki tunelowe (TNT) to przede wszystkim otwarte nanorurki z membraną F-aktyny, które łączą sąsiednie komórki, ułatwiając komunikację międzykomórkową. Godną uwagi cechą, która odróżnia TNT od innych wypukłości komórek, jest unosząca się natura nanorurek między komórkami. W tym miejscu scharakteryzujemy TNT, konstruując widok objętościowy 3D konfokalnych obrazów z-stack.

Wykrywanie i kwantyfikacja nanorurek tunelowych za pomocą obrazów 3D w widoku objętości

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Brak markerów specyficznych dla nanorurek tunelowych ogranicza postęp w tej dziedzinie i rośnie zapotrzebowanie na metodę identyfikacji, charakterystyki i ilościowego oznaczania nanorurek tunelowych. Metody automatycznego wykrywania są trudne do wdrożenia bez wiedzy specjalistycznej potrzebnej do opracowania algorytmu i/lub zmiany istniejącego algorytmu, ale nasza metoda ręczna jest łatwa do wdrożenia z większą precyzją. Transfer międzykomórkowy dalekiego zasięgu za pomocą nanorurek tunelowych jest realizowany na kilka sposobów w różnych modelach chorób, w tym w patologii neurodegeneracyjnej, rozprzestrzenianiu się wirusów i raku.Dlatego ważne są badania nad tunelowaniem nanorurek, aby zrozumieć ich rolę w patogenezie. Możliwe jest, że nanorurki tunelowe mogą pęknąć podczas procesu barwienia. Unikaj używania szkiełek nakrywkowych i montażu na szkiełkach, zamiast tego używając naczyń do obrazowania ze szklanym dnem.Zmodyfikowany protokół mocowania pomaga utrzymać nanorurki tunelowe w stanie nienaruszonym. Procedurę zademonstruje Deepak KV, doktorant z laboratorium Sangeeta NAF. Na początek umyj kontrolne i oligomeryczne komórki potraktowane A-beta dwukrotnie PBS przez dwie minuty przed utrwaleniem.Przygotować roztwór utrwalający Karnovsky'ego, używając 2% utrwalacza formaliny i 2,5% aldehydu glutarowego rozpuszczonego w 0,1-molowym buforze fosforanowym o pH 7,2. Następnie utrwal komórki w naczyniu do obrazowania, dodając roztwór utrwalający Karnovsky'ego przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować bufor inkubacyjny, rozpuszczając 0,1 grama saponiny w pięciu mililitrach FBS i rozcieńczając przez dodanie 95 mililitrów PBS.Następnie umyj utrwalone komórki dwukrotnie za pomocą buforu inkubacyjnego przez dwie minuty. Po utrwaleniu dodać pierwsze przeciwciało przeciwko fosfo-PAK1, dodać rozcieńczenie od 1 do 250 do buforu inkubacyjnego i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemnej, wilgotnej komorze. Następnego dnia, po 24 godzinach inkubacji, przemyć komórki dwukrotnie buforem inkubacyjnym przez dwie minuty.Następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 i Phalloidin 555. Inkubuj komórki w ciemnej, wilgotnej komorze przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie buforem inkubacyjnym przez dwie minuty.Zabarwić jądro, dodając DAPI w rozcieńczeniu jeden do 2000 i inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przygotuj podłoże montażowe DABCO, używając 25 miligramów DABCO w 90% glicerolu i 10% PBS. Aby prawidłowo się rozpuścić, dostosuj pH do 8,6 za pomocą spektrofotometrycznego rozcieńczonego kwasu solnego i trzymaj roztwór na kołysce do wymieszania.Jako środek przeciwwybielający dodaj podłoże montażowe DABCO bezpośrednio na naczynie obrazowe zawierające szkiełko nakrywkowe na dole. Odczekaj co najmniej jedną do dwóch godzin i bezpośrednio przystąp do wykonywania obrazowania konfokalnego. Aby zidentyfikować nanorurki tunelowe, przechwyć obrazy stosu Z komórek barwionych immunologicznie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, najpierw wybierając kanały i klikając kolejno wymagane lasery na ścieżce pierwszej, drugiej i trzeciej okna w oprogramowaniu konfokalnym.Kliknij opcję TPMT poniżej okna ścieżki pierwszej, aby wykonać obrazy kontrastu interferencji różnicowej z kanałami fluorescencji. Wybierz zakładkę Pobieranie oprogramowania, kliknij kartę Z-stack i poczekaj, aż otworzy się okno. Następnie kliknij Live Scan aby ustawić ostrość komórek na dole naczynia.Zaznacz ten skoncentrowany obraz jako pierwszy stos, a następnie ustaw ostrość w górę, aby zobaczyć najwyższą część komórki, i wybierz go jako ostatni stos. Zatrzymaj skanowanie na żywo i kliknij liczbę obok karty Optymalny, aby ustalić rozmiar kroku stosów, który określa liczbę wycinków i interwały na podstawie grubości komórek. Wykonaj sekwencyjne obrazy trzech kanałów DAPI, FITC i TRITC za pomocą laserów 405 nanometrów, 488 nanometrów i 561 nanometrów i uchwyć je z czasem przebywania pikseli 1,02 mikrosekundy.Przechwytuj obrazy w kanale DIC z kanałami fluorescencyjnymi, aby obserwować granicę komórki. Otwórz obrazy konfokalne zapisane w formacie danych czi w oprogramowaniu Fiji w celu analizy. Wybierz opcję Hyperstack, aby wyświetlić każdy stos Z i kanał obrazu.Przewiń paski przewijania kanału i stosu Z, aby wybrać dokładny stos określonego interesującego Cię kanału. Następnie najpierw wybierz kanał barwiony F-aktyną, przewijając pasek kanałów i ręcznie przewijaj stosy Z, aby zobaczyć każdy stos jeden po drugim. Zidentyfikuj struktury barwione F-aktyną, które wydają się łączyć komórki, które są widoczne w dolnych częściach stosów Z i znajdują się blisko powierzchni naczynia do obrazowania z Z równym dwóm jako neuryty.Zidentyfikuj tunelujące nanorurki, dodatnia komórka F-aktyny unosząca się do przewodów komórkowych, przewijając stosy Z w kierunku góry od Z równa się czterem. Szukaj neurytów w pobliżu dolnych części stosów Z w kierunku powierzchni i obserwuj, że zaczynają one znikać wraz z przewijaniem stosów Z w kierunku góry przy Z równym sześciu. Zidentyfikuj dodatnie nanorurki tunelujące fosfo-PAK1, podobnie jak nanorurki tunelujące dodatnie w alfabecie, analizując unoszącą się naturę przewodów od stosów Z.Ponieważ barwienie fosfo-PAK1 jest słabsze niż barwienie F-aktyną, należy szukać barwionych fosfo-PAK1 nanorurek tunelowych przy Z równym czterem i przy Z równym sześciu. Następnie obserwuj obrazy DIC, aby sprawdzić, czy struktury nanorurek tunelowych barwionych F-aktyną i fosfo-PAK1 są kanałami błonowymi między komórkami. Ponadto połącz kanały F-aktyny i fosfo-PAK1, aby sprawdzić, czy zidentyfikowane nanorurki tunelujące są współbarwionymi strukturami F-aktyny i fosfo-PAK1.Aby określić ilościowo nanorurki tunelowe, należy ręcznie policzyć całkowitą liczbę komórek i zidentyfikowane nanorurki tunelowe i przedstawić liczby w procentach. Aby odróżnić dodatnie nanorurki tunelujące tubulinę F-aktyny i beta III, takie jak unoszące się przewody, od obrazów stosu Z, połącz kanały tubuliny F-aktyny i beta III, a następnie przeanalizuj stosy Z połączonych obrazów. Szukaj wyłącznie narurki tunelowych barwionych F-aktyną, które są słabo widoczne w Z równej trzy i widoczne w Z równej sześć i Z równej dziewięciu.Podobnie zidentyfikuj tubulinę F-aktynę i tubulinę beta III. podwójnie dodatnie nanorurki tunelujące, takie jak unoszące się przewody w Z równe sześć i Z równe dziewięciu. Zidentyfikuj inne nieunoszące się wypukłości rurki F-aktyny i beta III barwione w dolnych częściach stosów Z.Zmierz średnicę nanorurek tunelowych za pomocą narzędzia Linia na Fidżi. Sprawdź skalę pomiaru, klikając przycisk Analizuj, a następnie ustaw skalę tak, aby odległość w pikselach była ustawiana automatycznie od obrazów czi. Zmierz średnice nanorurek tunelowych w płaszczyźnie XY.Korzystając z wtyczki Volume Viewer na Fidżi, która umożliwia ponowne krojenie 3D i wizualizację 3D z obsługą progów, podziel obrazy Z-stack na poszczególne kanały. Następnie przytnij jednokanałowe obrazy stosu Z, aby użyć widoku rekonstrukcji 3D, aby podkreślić jedną lub dwie tunelujące nanorurki lub neuryty jednocześnie. Przypnij pojedynczą nanorurkę tunelową lub neuryt w płaszczyźnie XY i oznacz przekroje dostępowe XZ i YZ.Obserwuj neuryty na dole płaszczyzny XZ, w płaszczyznach XZ i YZ oraz nanorurki tunelujące w górnych stosach Z. Wybierz poszczególne nanorurki tunelowe lub neuryt, aby zrekonstruować widok objętości 3D w płaszczyźnie XZ. W rekonstrukcji 3D obserwuj neuryty na dole płaszczyzny Z i tunelujące nanorurki wyglądające jak unoszące się struktury łączące dwie komórki bez dotykania dolnej płaszczyzny Z.Przeanalizowano konfokalne obrazy stosu Z komórek barwionych immunologicznie za pomocą F-aktyny i fosfo-PAK1 w celu identyfikacji nanorurek tunelowych. Ponadto przeanalizowano obrazy DIC w celu sprawdzenia, czy struktury nanorurek tunelowych barwionych F-aktyną i fosfo-PAK1 były kanałami błonowymi między komórkami. Komórki zostały podwójnie wybarwione immunologicznie F-aktyną i tubuliną beta III, a tunelujące nanorurkopodobne F-aktyny i tunelujące podwójnie dodatnie przewody błonowe F-aktyny F-aktyny i tubuliny beta III zostały odróżnione od tylko dodatnich nanorurek tunelowych F-aktyny.Tunelujące nanorurki ulegające jednoczesnej ekspresji z fosfo-PAK1 i F-aktyną odróżniono od wypukłości komórek innych neurytów, konstruując obrazy 3D w widoku objętościowym w oparciu o ich charakterystykę unoszenia się między dwiema komórkami bez dotykania podłoża. Zastosowanie odpowiedniego utrwalacza jest ważne, ponieważ niedoskonałe utrwalenie próbki może prowadzić do szybkiej degradacji proteolitycznej docelowych białek i zmniejszenia swoistej immunoreaktywności.

detection-quantification-tunneling-nanotubes-using-3d-volume-view

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykorzystaliśmy synchrotronową tomografię rentgenowską w Europejskiej Instalacji Promieniowania Synchrotronowego (ESRF), aby nieinwazyjnie uzyskać trójwymiarowe zbiory danych tomograficznych o rozdzielczości piksela 0.7µm. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do renderowania objętościowego możliwe jest zrekonstruowanie struktur wewnętrznych w ich stanie naturalnym, bez artefaktów powstających podczas sekcjonowania histologicznego.

Nieinwazyjna wizualizacja 3D z rozdzielczością submikronową z wykorzystaniem synchrotronowej tomografii rentgenowskiej

Przedstawiamy metody wytwarzania wzorowanych mikrostruktur z pionowo wyrównanych nanorurek węglowych (CNTs) oraz ich zastosowanie jako form macierzystych do produkcji polimerowych mikrostruktur z uporządkowaną nanostrukturą powierzchni. Las nanorurek CNT jest zagęszczany poprzez kondensację rozpuszczalnika na podłożu, co znacznie zwiększa ich gęstość upakowania i umożliwia samokierowane tworzenie kształtów 3D.

Wytwarzanie, zagęszczanie i odlewanie replik trójwymiarowych mikrostruktur z nanorurek węglowych

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Przedstawiono metodologię uzyskiwania wizualnych i ilościowych informacji o strukturze korzeni z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej uzyskanych w glebie.

Wyodrębnianie metryk dla trójwymiarowych systemów korzeniowych: analiza objętości i powierzchni z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej w glebie

Przedstawiono protokół do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkanek za pomocą metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego, przeznaczonej do rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej

Przedstawiono tutaj ustandaryzowany protokół wizualizacji tunelujących nanorurek między ludzkimi keratynocytami naskórnymi a fibroblastami dermalnymi za pomocą znakowania błonowego i F-aktynowego za pomocą obrazowania konfokalnego stosu z, z opcjonalnym współbarwieniem α-tubuliny, umożliwiającym powtarzalne wykrywanie i charakteryzację cytoszkieletu dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Standaryzowana metoda wykrywania tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry do zastosowań inżynierii tkankowej

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Niniejszy komunikat przedstawia dane dotyczące dokładności i powtarzalności spektrofotometru UV-VIS BioSpec-nano w oznaczaniu ilościowym dsDNA oraz białek. Nawet przy ultra małych objętościach (1 do 2 µL) powtarzalność jest doskonała, natomiast zautomatyzowana funkcja przecierania zwiększa wydajność i minimalizuje zjawisko przeniesienia próbki, co pozwala na uzyskanie bardziej precyzyjnych wyników.

Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych i białek przy użyciu mikroobjętościowego spektrofotometru Bio-spec Nano

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Poznaj metodę wykrywania nanorurek tunelowych w komórkach przy użyciu obrazowania 3D z konfokalnej mikroskopii laserowej. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę struktur F-actin odpowiedzialnych za komunikację międzykomórkową.

Wykrywanie i kwantyfikacja nanorurek tunelowych za pomocą obrazów 3D w widoku objętości

Przeglądaj więcej filmów