Wykrywanie i kwantyfikacja nanorurek tunelowych za pomocą obrazów 3D w widoku objętości

Brak markerów specyficznych dla nanorurek tunelowych ogranicza postęp w tej dziedzinie i rośnie zapotrzebowanie na metodę identyfikacji, charakterystyki i ilościowego oznaczania nanorurek tunelowych. Metody automatycznego wykrywania są trudne do wdrożenia bez wiedzy specjalistycznej potrzebnej do opracowania algorytmu i/lub zmiany istniejącego algorytmu, ale nasza metoda ręczna jest łatwa do wdrożenia z większą precyzją. Transfer międzykomórkowy dalekiego zasięgu za pomocą nanorurek tunelowych jest realizowany na kilka sposobów w różnych modelach chorób, w tym w patologii neurodegeneracyjnej, rozprzestrzenianiu się wirusów i raku.

Dlatego ważne są badania nad tunelowaniem nanorurek, aby zrozumieć ich rolę w patogenezie. Możliwe jest, że nanorurki tunelowe mogą pęknąć podczas procesu barwienia. Unikaj używania szkiełek nakrywkowych i montażu na szkiełkach, zamiast tego używając naczyń do obrazowania ze szklanym dnem.

Zmodyfikowany protokół mocowania pomaga utrzymać nanorurki tunelowe w stanie nienaruszonym. Procedurę zademonstruje Deepak KV, doktorant z laboratorium Sangeeta NAF. Na początek umyj kontrolne i oligomeryczne komórki potraktowane A-beta dwukrotnie PBS przez dwie minuty przed utrwaleniem.

Przygotować roztwór utrwalający Karnovsky'ego, używając 2% utrwalacza formaliny i 2,5% aldehydu glutarowego rozpuszczonego w 0,1-molowym buforze fosforanowym o pH 7,2. Następnie utrwal komórki w naczyniu do obrazowania, dodając roztwór utrwalający Karnovsky'ego przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować bufor inkubacyjny, rozpuszczając 0,1 grama saponiny w pięciu mililitrach FBS i rozcieńczając przez dodanie 95 mililitrów PBS.

Następnie umyj utrwalone komórki dwukrotnie za pomocą buforu inkubacyjnego przez dwie minuty. Po utrwaleniu dodać pierwsze przeciwciało przeciwko fosfo-PAK1, dodać rozcieńczenie od 1 do 250 do buforu inkubacyjnego i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemnej, wilgotnej komorze. Następnego dnia, po 24 godzinach inkubacji, przemyć komórki dwukrotnie buforem inkubacyjnym przez dwie minuty.

Następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 i Phalloidin 555. Inkubuj komórki w ciemnej, wilgotnej komorze przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie buforem inkubacyjnym przez dwie minuty.

Zabarwić jądro, dodając DAPI w rozcieńczeniu jeden do 2000 i inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przygotuj podłoże montażowe DABCO, używając 25 miligramów DABCO w 90% glicerolu i 10% PBS. Aby prawidłowo się rozpuścić, dostosuj pH do 8,6 za pomocą spektrofotometrycznego rozcieńczonego kwasu solnego i trzymaj roztwór na kołysce do wymieszania.

Jako środek przeciwwybielający dodaj podłoże montażowe DABCO bezpośrednio na naczynie obrazowe zawierające szkiełko nakrywkowe na dole. Odczekaj co najmniej jedną do dwóch godzin i bezpośrednio przystąp do wykonywania obrazowania konfokalnego. Aby zidentyfikować nanorurki tunelowe, przechwyć obrazy stosu Z komórek barwionych immunologicznie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, najpierw wybierając kanały i klikając kolejno wymagane lasery na ścieżce pierwszej, drugiej i trzeciej okna w oprogramowaniu konfokalnym.

Kliknij opcję TPMT poniżej okna ścieżki pierwszej, aby wykonać obrazy kontrastu interferencji różnicowej z kanałami fluorescencji. Wybierz zakładkę Pobieranie oprogramowania, kliknij kartę Z-stack i poczekaj, aż otworzy się okno. Następnie kliknij Live Scan aby ustawić ostrość komórek na dole naczynia.

Zaznacz ten skoncentrowany obraz jako pierwszy stos, a następnie ustaw ostrość w górę, aby zobaczyć najwyższą część komórki, i wybierz go jako ostatni stos. Zatrzymaj skanowanie na żywo i kliknij liczbę obok karty Optymalny, aby ustalić rozmiar kroku stosów, który określa liczbę wycinków i interwały na podstawie grubości komórek. Wykonaj sekwencyjne obrazy trzech kanałów DAPI, FITC i TRITC za pomocą laserów 405 nanometrów, 488 nanometrów i 561 nanometrów i uchwyć je z czasem przebywania pikseli 1,02 mikrosekundy.

Przechwytuj obrazy w kanale DIC z kanałami fluorescencyjnymi, aby obserwować granicę komórki. Otwórz obrazy konfokalne zapisane w formacie danych czi w oprogramowaniu Fiji w celu analizy. Wybierz opcję Hyperstack, aby wyświetlić każdy stos Z i kanał obrazu.

Przewiń paski przewijania kanału i stosu Z, aby wybrać dokładny stos określonego interesującego Cię kanału. Następnie najpierw wybierz kanał barwiony F-aktyną, przewijając pasek kanałów i ręcznie przewijaj stosy Z, aby zobaczyć każdy stos jeden po drugim. Zidentyfikuj struktury barwione F-aktyną, które wydają się łączyć komórki, które są widoczne w dolnych częściach stosów Z i znajdują się blisko powierzchni naczynia do obrazowania z Z równym dwóm jako neuryty.

Zidentyfikuj tunelujące nanorurki, dodatnia komórka F-aktyny unosząca się do przewodów komórkowych, przewijając stosy Z w kierunku góry od Z równa się czterem. Szukaj neurytów w pobliżu dolnych części stosów Z w kierunku powierzchni i obserwuj, że zaczynają one znikać wraz z przewijaniem stosów Z w kierunku góry przy Z równym sześciu. Zidentyfikuj dodatnie nanorurki tunelujące fosfo-PAK1, podobnie jak nanorurki tunelujące dodatnie w alfabecie, analizując unoszącą się naturę przewodów od stosów Z.

Ponieważ barwienie fosfo-PAK1 jest słabsze niż barwienie F-aktyną, należy szukać barwionych fosfo-PAK1 nanorurek tunelowych przy Z równym czterem i przy Z równym sześciu. Następnie obserwuj obrazy DIC, aby sprawdzić, czy struktury nanorurek tunelowych barwionych F-aktyną i fosfo-PAK1 są kanałami błonowymi między komórkami. Ponadto połącz kanały F-aktyny i fosfo-PAK1, aby sprawdzić, czy zidentyfikowane nanorurki tunelujące są współbarwionymi strukturami F-aktyny i fosfo-PAK1.

Aby określić ilościowo nanorurki tunelowe, należy ręcznie policzyć całkowitą liczbę komórek i zidentyfikowane nanorurki tunelowe i przedstawić liczby w procentach. Aby odróżnić dodatnie nanorurki tunelujące tubulinę F-aktyny i beta III, takie jak unoszące się przewody, od obrazów stosu Z, połącz kanały tubuliny F-aktyny i beta III, a następnie przeanalizuj stosy Z połączonych obrazów. Szukaj wyłącznie narurki tunelowych barwionych F-aktyną, które są słabo widoczne w Z równej trzy i widoczne w Z równej sześć i Z równej dziewięciu.

Podobnie zidentyfikuj tubulinę F-aktynę i tubulinę beta III. podwójnie dodatnie nanorurki tunelujące, takie jak unoszące się przewody w Z równe sześć i Z równe dziewięciu. Zidentyfikuj inne nieunoszące się wypukłości rurki F-aktyny i beta III barwione w dolnych częściach stosów Z.

Zmierz średnicę nanorurek tunelowych za pomocą narzędzia Linia na Fidżi. Sprawdź skalę pomiaru, klikając przycisk Analizuj, a następnie ustaw skalę tak, aby odległość w pikselach była ustawiana automatycznie od obrazów czi. Zmierz średnice nanorurek tunelowych w płaszczyźnie XY.

Korzystając z wtyczki Volume Viewer na Fidżi, która umożliwia ponowne krojenie 3D i wizualizację 3D z obsługą progów, podziel obrazy Z-stack na poszczególne kanały. Następnie przytnij jednokanałowe obrazy stosu Z, aby użyć widoku rekonstrukcji 3D, aby podkreślić jedną lub dwie tunelujące nanorurki lub neuryty jednocześnie. Przypnij pojedynczą nanorurkę tunelową lub neuryt w płaszczyźnie XY i oznacz przekroje dostępowe XZ i YZ.

Obserwuj neuryty na dole płaszczyzny XZ, w płaszczyznach XZ i YZ oraz nanorurki tunelujące w górnych stosach Z. Wybierz poszczególne nanorurki tunelowe lub neuryt, aby zrekonstruować widok objętości 3D w płaszczyźnie XZ. W rekonstrukcji 3D obserwuj neuryty na dole płaszczyzny Z i tunelujące nanorurki wyglądające jak unoszące się struktury łączące dwie komórki bez dotykania dolnej płaszczyzny Z.

Przeanalizowano konfokalne obrazy stosu Z komórek barwionych immunologicznie za pomocą F-aktyny i fosfo-PAK1 w celu identyfikacji nanorurek tunelowych. Ponadto przeanalizowano obrazy DIC w celu sprawdzenia, czy struktury nanorurek tunelowych barwionych F-aktyną i fosfo-PAK1 były kanałami błonowymi między komórkami. Komórki zostały podwójnie wybarwione immunologicznie F-aktyną i tubuliną beta III, a tunelujące nanorurkopodobne F-aktyny i tunelujące podwójnie dodatnie przewody błonowe F-aktyny F-aktyny i tubuliny beta III zostały odróżnione od tylko dodatnich nanorurek tunelowych F-aktyny.

Tunelujące nanorurki ulegające jednoczesnej ekspresji z fosfo-PAK1 i F-aktyną odróżniono od wypukłości komórek innych neurytów, konstruując obrazy 3D w widoku objętościowym w oparciu o ich charakterystykę unoszenia się między dwiema komórkami bez dotykania podłoża. Zastosowanie odpowiedniego utrwalacza jest ważne, ponieważ niedoskonałe utrwalenie próbki może prowadzić do szybkiej degradacji proteolitycznej docelowych białek i zmniejszenia swoistej immunoreaktywności.