Name: Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki kończyny aksolotla w celu badania mechanicznych sygnałów w procesie regeneracji tkanek. Ta metoda pozwala dokładnie mierzyć właściwości mechaniczne kluczowe dla inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Sandoval-Guzmán za ciągłe wsparcie i towarzystwo podczas rozwoju tej pracy. Jesteśmy również wdzięczni Anji Wagner, Beate Gruhl i Judith Konantz za ich zaangażowanie w opiekę nad aksolotlami. Dziękujemy również Paulowi Müllerowi za dostarczenie kodów do analizy danych AFM. Prace te były wspierane przez Zakład Mikroskopii Świetlnej Platformy Technologicznej CMCB na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie. AT jest stypendystą Mildred Scheel Early Career Center Dresden P2 finansowanego przez Niemiecką Pomoc Onkologicznemu (Deutsche Krebshilfe). RA jest finansowany przez tymczasowe stanowisko kierownika (Eigene Stelle) z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) – AI 214/1-1.

Mechanical Characterization of Tissue Stiffness During Axolotl Limb Regeneration

<ol><li>Mills, L. A., Aitken, S. A., Simpson, A. H. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+non-union+per+fracture%3A+current+myths+and+revised+figures+from+a+population+of+over+4+million+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">The risk of non-union per fracture: current myths and revised figures from a population of over 4 million adults.</a> Acta Orthop. 88 (4), 434-439 (2017).</li>
<li>Calori, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-unions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cases+Miner+Bone+Metab%22%5BJournal%5D)">Non-unions.</a> Clin Cases Miner Bone Metab. 14 (2), 186-188 (2017).</li>
<li>Nandra, R., Grover, L., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+non-union+epidemiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trauma%22%5BJournal%5D)">Fracture non-union epidemiology and treatment.</a> Trauma. 18 (1), 3-11 (2016).</li>
<li>Nauth, A., Schemitsch, E., Norris, B., Nollin, Z., Watson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical-size+bone+defects%3A+Is+there+a+consensus+for+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Critical-size bone defects: Is there a consensus for diagnosis and treatment.</a> J Orthop Trauma. 32 (3 Suppl), S7-S11 (2018).</li>
<li>Schemitsch, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+Defining+critical+in+bone+defect+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Size matters: Defining critical in bone defect size.</a> J Orthop Trauma. 31 (10), S20-S22 (2017).</li>
<li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Salamanders%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Salamanders.</a> Development (Cambridge). 146 (14), 0-2 (2019).</li>
<li>Aires, R., Keeley, S. D., Sandoval-Guzmán, T. Basics of Self-Regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAires%2C+R+%22Cell+Engineering+and+Regeneration%22">Cell Engineering and Regeneration</a>. , Springer. Cham. (2020).</li>
<li>Stocum, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+urodele+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of urodele limb regeneration.</a> Regeneration. 4 (4), 159-200 (2017).</li>
<li>Bassat, E., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+signaling+dynamics+of+salamander+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cellular and signaling dynamics of salamander limb regeneration.</a> Curr Opin Cell Biol. 73, 117-123 (2021).</li>
<li>Vinarsky, V., Atkinson, D. L., Stevenson, T. J., Keating, M. T., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+newt+limb+regeneration+requires+matrix+metalloproteinase+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal newt limb regeneration requires matrix metalloproteinase function.</a> Dev Biol. 279 (1), 86-98 (2005).</li>
<li>Godwin, J., Kuraitis, D., Rosenthal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+considerations+for+scar-free+repair+and+regeneration%3A+Insights+from+regenerative+diversity+among+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22International+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix considerations for scar-free repair and regeneration: Insights from regenerative diversity among vertebrates.</a> International J Biochem Cell Biol. 56, 47-55 (2014).</li>
<li>Riquelme-Guzmán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast-mediated+resorption+primes+the+skeleton+for+successful+integration+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Osteoclast-mediated resorption primes the skeleton for successful integration during axolotl limb regeneration.</a> ELife. 11, e79966(2022).</li>
<li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), aaq0681(2018).</li>
<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li>
<li>Currie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axolotl+Digit+Regeneration+Reveals+Spatiotemporal+Choreography+of+Diverse+Connective+Tissue+Progenitor+Pools%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axolotl Digit Regeneration Reveals Spatiotemporal Choreography of Diverse Connective Tissue Progenitor Pools.</a> Dev Cell. 39 (4), 411-423 (2016).</li>
<li>Qin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+novel+mitochondria-related+musculoskeletal+cell+populations+during+adult+axolotl+limb+regeneration+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals novel mitochondria-related musculoskeletal cell populations during adult axolotl limb regeneration process.</a> Cell Death Differ. 28 (3), 1110-1125 (2021).</li>
<li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14, 174-187 (2014).</li>
<li>Currie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prrx1limb+enhancer+marks+an+adult+subpopulation+of+injury-responsive+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">The Prrx1limb enhancer marks an adult subpopulation of injury-responsive dermal fibroblasts.</a> Biol Open. 8, bio043711(2019).</li>
<li>Wagh, K., Ishikawa, M., Garcia, D. A., Stavreva, D. A., Upadhyaya, A., Hager, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+transcription%3A+Recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of transcription: Recent advances.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 457-472 (2021).</li>
<li>d'Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stiffness+in+cell+reprogramming%3A+A+potential+role+for+biomaterials+in+inducing+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of stiffness in cell reprogramming: A potential role for biomaterials in inducing tissue regeneration.</a> Cells. 8 (9), 1036(2019).</li>
<li>Akhtar, R., Sherratt, M. J., Cruickshank, J. K., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+elastic+properties+of+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+%28Kidlington%29%22%5BJournal%5D)">Characterizing the elastic properties of tissues.</a> Mater Today (Kidlington). 14 (3), 96-105 (2011).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).</li>
<li>El Kirat, K., Burton, I., Dupres, V., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+procedures+for+biological+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Sample preparation procedures for biological atomic force microscopy.</a> J Microsc. 218 (3), 199-207 (2005).</li>
<li>Riquelme-Guzmán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+development+and+aging+of+the+appendicular+skeleton+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Postembryonic development and aging of the appendicular skeleton in Ambystoma mexicanum.</a> Dev Dyn. 251 (6), 1015-1034 (2021).</li>
<li>López-Alonso, J., Eroles, M., Janel, S., et al. <a target="_blank" href="https://open-research-europe.ec.europa.eu/articles/3-187">PyFMLab: Open-source software for atomic force microscopy microrheology data analysis [version 2; peer review: 2 approved].</a> Open Res Europe 2024. 3 (187), (2024).</li>
<li>Abuhattum, S., Mokbel, D., Müller, P., Soteriou, D., Guck, J., Aland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+explicit+model+to+extract+viscoelastic+properties+of+cells+from+AFM+force-indentation+curves%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">An explicit model to extract viscoelastic properties of cells from AFM force-indentation curves.</a> iScience. 25 (4), 104016(2022).</li>
<li>Glorieux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+pancreatic+extracellular+matrix+during+development+for+next-generation+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the pancreatic extracellular matrix during development for next-generation tissue engineering.</a> Int J Mol Sci. 24 (12), 10268(2023).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+stress+and+creep+relaxations+of+single+cells+measured+by+colloidal+probe+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Power-law stress and creep relaxations of single cells measured by colloidal probe atomic force microscopy.</a> Jpn J Appl Phys. 48 (8 PART 3), 08JB17(2009).</li>
<li>Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+energy+and+the+contact+of+elastic+solids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+A%22%5BJournal%5D)">Surface energy and the contact of elastic solids.</a> Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).</li>
<li>Kondiboyina, V., Duerr, T. J., Monaghan, J. R., Shefelbine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+properties+in+regenerating+axolotl+limbs+using+inverse+finite+element+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Material properties in regenerating axolotl limbs using inverse finite element analysis.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 150, 106341(2024).</li>
<li>Calve, S., Simon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+mechanical+environment+cooperatively+regulate+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and mechanical environment cooperatively regulate skeletal muscle regeneration.</a> FASEB J. 26 (6), 2538-2545 (2012).</li>
<li>Calve, S., Simon, H. G. Extracellular control of limb regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalve%2C+S+%22IUTAM+Symposium+on+Cellular%2C+Molecular+and+Tissue+Mechanics.+IUTAM+Bookseries%22">IUTAM Symposium on Cellular, Molecular and Tissue Mechanics. IUTAM Bookseries</a>. 16, Springer. Dordrecht. 257-266 (2010).</li>
<li>Kaufmann, R. A., Kozin, S. H., Barnes, A., Kalluri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+strain+distribution+along+the+radius+and+ulna+with+loading+and+interosseous+membrane+section%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Changes in strain distribution along the radius and ulna with loading and interosseous membrane section.</a> J Hand Surg Am. 27 (1), 93-97 (2002).</li>
<li>Martin, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+distal+forearm+bone+mineral+density%3A+Can+different+forearm+segments+be+used+interchangeably%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Densitom%22%5BJournal%5D)">Measurement of distal forearm bone mineral density: Can different forearm segments be used interchangeably.</a> J Clin Densitom. 2 (4), 381-387 (1999).</li>
<li>Riquelme-Guzmán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+mechanical+properties+during+axolotl+development+and+regeneration+using+confocal+Brillouin+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of mechanical properties during axolotl development and regeneration using confocal Brillouin microscopy.</a> Open Biol. 12 (6), 220078(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Tutaj demonstrujemy technikę pomiaru sztywności chrząstki w kończynach aksolotla z AFM. Jednak metoda ta może być rozszerzona o sondowanie również innych typów tkanek. Kluczowym krokiem do udanych pomiarów AFM jest przygotowanie próbki, która okazała się szczególnie trudna w przypadku próbek aksolotlów. Odkryliśmy, że badanie powierzchni tkanki, która była nadal osadzona w bloku agarozowym, było najlepszym sposobem na zachowanie integralności tkanki. Dzieje się tak, ponieważ skóra aksolotla wydziela duże ilości śluzu na powierzchnię naskórka, co uniemożliwia stabilne osadzenie się pokrojonego fragmentu tkanki w agarozie.
Niektóre próbki mogą wiązać się z dodatkowymi wyzwaniami, takimi jak wysoka przyczepność. Doświadczyliśmy tego problemu, szczególnie w próbkach w fazie histolizy, które były stosunkowo podatne i adhezyjne. Na tych próbkach zaobserwowaliśmy również wiele krzywych siła-odległość, w których część wgłębienia miała "postrzępiony" wygląd, co wskazuje, że ścieg deformował powierzchnię próbki w sposób nieciągły (rysunek 2C), np. z powodu powierzchni poddawającej się pod wpływem naprężeń. Takie krzywe siła-odległość musiały zostać odrzucone, ponieważ nie można było ich dopasować do modelu Hertza-Sneddona. W celu zmniejszenia adhezji pomocna może być pasywacja wgłębnika28, tj. poprzez pokrycie stopki wgłębnika środkami zmniejszającymi jego lepkość, takimi jak glikol polietylenowy (PEG) lub albumina surowicy bydlęcej. Można również zastosować alternatywne modele do dopasowywania krzywych siła-odległość, np. JKR (Johnson-Kendall-Roberts) model29. Ponieważ analizowane tutaj tkanki wykazywały stosunkowo duże różnice w modułach sprężystości o więcej niż jeden rząd wielkości dla sąsiednich obszarów tkanek i różnych badanych warunków, wybór jednego idealnego wspornika/wgłębnika (stała sprężystości/rozmiar wgłębnika) był wyzwaniem. Dość duże różnice w sztywności tkanki wymagały również dostosowania przyłożonej siły nacisku w celu utrzymania porównywalnej głębokości wgłębienia i w odpowiednim zakresie (około 5%-25% średnicy wgłębnika).
Innym krytycznym parametrem pozwalającym zachować właściwości mechaniczne tkanki tak fizjologicznie, jak to tylko możliwe, jest utrzymanie maksymalnej integralności tkanki. Zapewniono to poprzez pomiar świeżych próbek, które zostały przetworzone natychmiast po pobraniu i utrzymywane w odpowiedniej temperaturze w pożywce do hodowli komórkowych o stabilnym pH.
Ostatnio inne grupy przeprowadziły pomiary mikrowgłębień w elementach szkieletu aksolotla przy użyciu alternatywnych metod przetwarzania próbek30. Jednak w tych eksperymentach tkanka została wcześniej zamrożona, a regenerujące się kawałki szkieletu zostały ręcznie wypreparowane z otaczających je tkanek w celu zmierzenia ich in situ. Dopóki nie zostanie to udowodnione empirycznie, nie jest jasne, czy manipulacje te mają wpływ na integralność tkanki chrzęstnej i właściwości mechaniczne. Przedstawiono również analizy mięśni salamander i blastemów31,32. W tych przypadkach jednak skóra została usunięta, a próbki nie zostały podzielone na sekcje; W ten sposób uzyskano tylko informacje z powierzchni znajdującej się bezpośrednio pod usuniętym nabłonkiem. Chociaż ten rodzaj kwantyfikacji jest dokładny, dostarcza raczej informacji o bocznej powierzchni mięśnia, ignorując w ten sposób informacje mechaniczne z wewnętrznych warstw mięśni. Użyliśmy wgłębnika o średnicy 20 μm, co oznacza, że pomiary nie były masowe, jak podawano w pomiarach mikrowgłębień 30,31,32, ale raczej w skali komórkowej i zewnątrzkomórkowej. W związku z tym uzyskujemy rozdzielczość, która odzwierciedla mechaniczne sygnały, na które komórki są faktycznie narażone, a także ujawnia niejednorodność tkanek (ryc. 2D-I).
W pomiarach wykryto niższe pozorne wartości modułów Younga na obrzeżach nienaruszonych elementów szkieletowych, co sugeruje, że okołochrzęstne aksolotla jest bardziej podatne niż chrząstka. Nie można jednak wykluczyć, że badaniom poddano również tkanki przylegające do elementów szkieletowych ze względu na ustawienie siatki 70 μm x 70 μm. W fazie histolitycznej nie zaobserwowano takich różnic, co sugeruje, że histoliza w kończynach regenerujących aksolotl może przebiegać równoważnie w chrząstce, otaczającej ją okołochrzęstnej i sąsiednich tkankach. Kość promieniowa i łokciowa mają podobną budowę, ale mają znaczne różnice anatomiczne, takie jak promień o większej średnicy, a kość łokciowa jest dłuższa24. Niemniej jednak do tej pory nie przedstawiono analizy porównawczej ich sztywności, z wyjątkiem ich reakcji na obciążenia mechaniczne w celach medycznych33. W tym miejscu opisujemy pomiary wgłębień w przekrojach tych dwóch elementów szkieletowych w nienaruszonych i regenerujących się kończynach. Pokazujemy, że nie ma istotnych różnic w sztywności między promieniami a łokciami w kończynach aksolotl, co jest zgodne z równoważnymi gęstościami mineralnymi kości wykrytymi u ludzkich odpowiedników34. Zaobserwowano jednak tendencję do niższych pozornych modułów Younga w promieniu, szczególnie podczas histoklizy. Aby ustalić, czy ta obserwacja jest istotna z biologicznego punktu widzenia, preferowana byłaby większa liczba próbek. Na podstawie danych uzyskanych w tym badaniu proponujemy minimum 5 próbek na warunek. Podczas fazy histolizy oba elementy szkieletu stają się bardziej podatne, co jest zgodne z opisanym natym etapie przebudową ECM 9. Wreszcie, pomiary uzyskane w tym badaniu sugerują, że sztywność chrząstki stopniowo wzrasta w późniejszej fazie kondensacji chrząstki. Obserwacje te zgadzają się z niedawno opisanymi pomiarami wgnieceń w nienaruszonych kościach i chrząstce kondensacyjnej29, a także z oceną in vivo właściwości mechanicznych chrząstki za pomocą mikroskopii konfokalnej Brillouina35.
Podsumowując, prace te rozszerzają potencjał AFM jako cennego narzędzia do badania właściwości mechanicznych kończyn aksolotlów. Dzięki tej technice zamierzamy uzupełnić naszą wiedzę na temat ekspresji genów i trajektorii transdyferencjacji komórek16,13, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób mechanika tkanek kształtuje i wpływa na proces regeneracji.

Szkielet, zwłaszcza chrząstki i kości, stanowi główne mechaniczne wsparcie dla tkanek miękkich ciała u kręgowców. Dlatego wszelkie uszkodzenia układu kostnego mogą znacznie zagrozić funkcjonalności, a nawet przeżyciu. U ludzi złamania kości są jednym z najczęstszych urazów1, z których większość naprawia się w ciągu kilku tygodni, ale 5%-10% z nich będzie miało opóźnienia w gojeniu lub nigdy nie wyzdrowieje w pełni2,3. Co więcej, ludzie nie są w stanie odzyskać sił po rozległej utracie kości lub chrząstki4,5. Niektóre salamandry mogą jednak regenerować różne struktury ciała, w tym pełne kończyny6, co czyni je idealnym modelem do badań nad regeneracją szkieletu.
Aksolotl (Ambystoma mexicanum) to rodzaj salamandry, gdzie regeneracja kończyn była szeroko badana. Proces ten zachodzi w czterech głównych, sekwencyjnych, ale nakładających się na siebie fazach: 1) gojenie się ran, 2) zapalenie/histoliza, 3) powstawanie blastemy i 4) wyrastanie/różnicowanie blastemy (przejrzane w7,8). Po amputacji keratynocyty graniczące z miejscem urazu szybko migrują, zamykając ranę i tworząc nabłonek rany (WE). Podczas następującego po tym stanu zapalnego i histolizy patogeny są eliminowane, zanieczyszczenia i uszkodzone komórki są usuwane, a macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) pod powierzchnią amputacji jest przebudowywana9. Histoliza tkanek jest niezbędna do regeneracji kończyn10, gdzie wydzielanie enzymów proteolitycznych ma kluczowe znaczenie nie tylko dla ogólnej przebudowy ECM, ale także dla uwolnienia komórek powodujących powstanie blastemy i wolnych bioaktywnych cząsteczek sekwestrowanych w samym ECM8. W rzeczywistości badania w wielu kontekstach regeneracyjnych i organizmach modelowych wykazały, że unikalne właściwości materiałowe ECM podczas histalizy są w stanie indukować procesy odróżnicowania lub kierować migrację komórek w kierunku miejsca uszkodzenia (recenzja w11). Co więcej, resorpcja zwapniałej tkanki w późnych stadiach histolizy okazała się kluczem do prawidłowej integracji nowo powstałych elementów szkieletu kończyny12. Po etapie histolizy blastema powstaje pod nabłonkiem rany (WE) jako nagromadzenie niezróżnicowanych, wieloliniowych komórek progenitorowych powstałych z odróżnicowanych dojrzałych komórek tkankowych lub rezydentnych komórek macierzystych. Komórki blastemy namnażają się i różnicują we wszystkie brakujące typy komórek. Wreszcie zachodzi morfogeneza kończyn, w której tkanka szkieletowa jest regenerowana poprzez kondensację chondroprogenitorów pochodzących z komórek okołoszkieletowych i transzróżnicowanych fibroblastów skóry13,14,15.
Chociaż zidentyfikowano wiele biochemicznych sygnałów regulujących zmiany w tożsamości komórki i składzie ECM10,13,14,16,17,18, właściwości mechaniczne tkanek podczas różnych faz regeneracji kończyn, a także ich wpływ na regenerację, pozostały w dużej mierze niezbadane. Wiele badań wykazało, że komórki wyczuwają i integrują mechaniczne sygnały, które regulują ich los i zachowanie w kilku kontekstach (recenzja w19,20). Dlatego uzupełnienie naszej wiedzy komórkowej i molekularnej na temat regeneracji kończyn o pomiary mechaniczne tkanek znacznie poprawi nasze zrozumienie tych procesów.
Opracowano różne techniki, które pozwalają na mechaniczną charakterystykę i manipulację siłą próbek biologicznych21. Wśród tych technik mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się złotym standardem w mechanobiologii, w której właściwości lepkosprężyste próbek biologicznych są badane w wysokiej rozdzielczości przestrzennej poprzez wgłębienie za pomocą ultraczułego czujnika siły, AFM cantilever22. Ponieważ technika ta wymaga bezpośredniego kontaktu z próbką, zazwyczaj generowane są wycinki tkanki, co w niektórych przypadkach może być trudne. W związku z tym warunki przygotowania muszą być dostosowane i zoptymalizowane dla każdej konkretnej próbki, tak aby mogła pozostać jak najbardziej zbliżona do warunków fizjologicznych i generowane były minimalne artefakty23. Protokół ten opisuje, jak mierzyć sztywność tkanek w kończynach aksolotla za pomocą AFM, koncentrując się na tkankach chrzęstnych w nienaruszonych warunkach, podczas histolizy i na etapach kondensacji chrząstki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Metoda ta może być również rozszerzona o pomiar innych typów tkanek.

<table><tbody><tr><td>Affinity Designer</td><td>Affinity</td><td>&nbsp; wersja 1.10.4</td><td>Do montażu figur</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej stopie topliwości</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td>Do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Do barwienia tkanek</td></tr><tr><td>Axiozoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Do obrazowania próbki pod AFM</td></tr><tr><td>Benzokaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Aby znieczulić zwierzęta</td></tr><tr><td>Winian butorfanolu (+) sól</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; B9156</td><td>Jako środek przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow TL1</td><td>Do pomiarów wgnieceń AFM</td></tr><tr><td>Zestaw Cellhesion 200 wyposażony w motorstage</td><td>JPK/Bruker</td><td></td><td>Do pomiarów wgłębień AFM</td></tr><tr><td>CellSense Entry</td><td></td><td></td><td>Do obrazowania w stereoskopie Olympus UC90</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS, 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Do czyszczenia próbek i sekcji pod wibratomem</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ2)</td><td>https://imagej.net/software/fiji</td><td>wersja 2.9.0/1.53t</td><td>Do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>GraphPad</td><td>Prism Oprogramowanie GraphPad</td> <td>(wersja 8.4.3)</td><td>Do wykresu i analizy statystycznej danych</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Do komórki pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana Klej histoakrylowy (2-butyl-cyjanoakryl)</td><td>Braun</td><td></td><td>Do przyklejania próbki do szalek Petriego</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>Do barwienia tkanek</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>780 LSM</td><td>Do obrazowania skrawków tkanek</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>980 LSM</td><td>Do obrazowania skrawków tkanek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych JPK/Bruker</td><td>JPK/Bruker</td><td>SPM 6.4</td><td>Do analizy krzywych siła-odległość</td></tr><tr><td>L15 medium (Leibovitz)</td><td>Sigma</td><td>L1518</td><td>Do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Do komórki pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana kulki polistyrenowe ( 20 & mikro; m średnicy); )</td> <td>mikrocząstki</td><td></td><td>do pomiarów wgnieceń AFM</td></tr><tr><td>Pyjibe</td><td>napisane przez Paula M&uuml; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe</td><td>0.15.0</td><td>Do analizy lepkosprężystej</td></tr><tr><td>Stereoskop Olympus SX10</td><td>Olympus</td><td>SX10</td><td>Do amputacji kończyn i montażu tkanek</td></tr><tr><td>Stereoskop Olympus UC90</td><td>Olympus</td><td>UC90</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT 1200S</td><td>Do sekcji tkanek</td></tr></tbody></table>

pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla

Atomic Force Microscopy Measurements of Cartilage in Intact and Regenerating Axolotl Limbs

Siły mechaniczne dostarczają ważnych sygnałów dla prawidłowego funkcjonowania komórek i tworzenia wzorców w rozwijających się tkankach, a ich rola była szeroko badana podczas embriogenezy i patogenezy. Stosunkowo niewiele wiadomo na temat tych sygnałów podczas regeneracji zwierząt. 
Aksolotl jest ważnym organizmem modelowym do badań nad regeneracją, ze względu na jego zdolność do pełnej odbudowy wielu organów i tkanek po urazach, w tym brakujących chrząstek i kości. Ze względu na jej kluczową rolę jako głównej tkanki podporowej w organizmie kręgowców, odzyskanie funkcji kośćca podczas regeneracji wymaga zarówno odtworzenia brakujących struktur, jak i ich właściwości mechanicznych. Protokół ten opisuje metodę przetwarzania próbek kończyn aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM), która jest złotym standardem w badaniu właściwości mechanicznych komórek i tkanek w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. 
Korzystając z możliwości regeneracyjnych aksolotl, to badanie zmierzyło sztywność chrząstki kończyny podczas homeostazy i dwóch etapów regeneracji kończyn: histolizy tkanek i kondensacji chrząstki. Pokazujemy, że AFM jest cennym narzędziem do uzyskania wglądu w dynamiczną restrukturyzację tkanek i zmiany mechaniczne, które zachodzą podczas regeneracji.

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, zmierzyliśmy pozorny moduł Younga tkanek chrzęstnych kończyn aksolotla w warunkach homeostatycznych („Intact”), podczas wczesnej histolizy chrząstki oraz w późniejszych etapach kondensacji chrząstki (Rycina 1A). Zbadaliśmy również właściwości mechaniczne elementów szkieletowych w różnych obszarach, w tym w ich centrum i na obwodzie, co przedstawiono na obrazach obrazujących położenie wspornika (Rycina 1B). Aby zobrazować architekturę tkanki i skorelować ją z pomiarami sztywności, utrwalono i zabarwiono albo poprzeczne przekroje tkankowe, albo blok tkanki, w którym przeprowadzono pomiary, odpowiednio na filamenty aktynowe i jądra komórkowe za pomocą faloidyny sprzężonej z Alexa Fluor 488 oraz Hoechst (Rycina 1C). W nienaruszonych kończynach kość promieniowa jest wyraźnie większa od kości łokciowej, lecz oba chrzęstne elementy szkieletowe mają podobną morfologię, z równomiernie rozmieszczonymi okrągłymi jądrami w centrum, otoczonymi pierścieniem spłaszczonych jąder odpowiadających chondrium24. Podczas fazy histolizy wykryto drastyczne zmiany w architekturze tkanki, z niezorganizowanymi i mniej gęsto upakowanymi jądrami wewnątrz elementów szkieletowych. W późniejszej fazie kondensacji chrząstki jądra ponownie ulegają organizacji, z wyraźnym rozgraniczeniem między nowo tworzącą się chrząstką a otaczającymi ją regenerującymi się tkankami. Jednak na tym etapie większość jąder jest spłaszczona i nie występują wyraźne różnice morfologiczne między centrum a obwodem.
Po pomiarze przekrojów poprzecznych obu elementów szkieletowych obecnych w regionie zeugopodialnym (promienia i łokci), w nienaruszonych kończynach wykryto nieodróżnialne pozorne moduły Younga, z wartościami mediany wynoszącymi odpowiednio 10,95 ± 11,69 kPa oraz 15,71 ± 6,49 kPa (Ryc. 2D, lewa), co jest zgodne z ich podobieństwem anatomicznym (Ryc. 1C). Co ciekawe, analiza centrum chrząstki vs. obwodu wykazała, że w warunkach nienaruszonych pozorne moduły Younga w centrum były wyższe niż na obwodzie, z wartościami median odpowiednio 16,48 ± 6,86 kPa vs. 7,53 ± 4,63 kPa (Ryc. 2E, lewa). W 5. dniu po amputacji, odpowiadającym fazie histolizy, pozorne moduły Younga w promieniu i łokciu znacznie spadły (odpowiednio 0,03 ± 0,02 kPa i 0,13 ± 0,09 kPa, Ryc. 2D, prawa), a różnice między centrum a obwodem zanikły, przy medianach modułów Younga wynoszących odpowiednio 0,11 ± 0,07 kPa i 0,27 ± 0,34 kPa (Ryc. 2E, prawa). Podczas analizy właściwości chrząstki w późniejszym etapie regeneracji, w czasie gdy chrząstka zaczyna się kondensować, wykryto istotny wzrost pozornych modułów Younga, które osiągnęły wartości pośrednie między fazą nienaruszoną a histolityczną (0,77 ± 0,29 kPa, Ryc. 2F).
Jak widać na przedstawionych przykładowych krzywych (Rysunek 2B), między większością par krzywych zbliżania i oddalania wystąpiła histereza, co wskazuje na lepko sprężystą odpowiedź tkanki pod wpływem siły. Następnie postanowiliśmy szczegółowo przeanalizować właściwości lepko sprężyste różnych tkanek. Ponieważ pomiary oscylacyjne w wielu częstotliwościach są czasochłonne i dość ryzykowne pod kątem zachowania integralności tkanki, szczególnie podczas mapowania wielu obszarów tkankowych, zastosowaliśmy wcześniej opublikowaną metodę Abuhattuma i wsp., która umożliwia dopasowanie części zbliżania krzywych siła-odległość przed natychmiastowym wycofaniem wspornika26. Model ten opiera się na elementach modelu Kelvina-Voigta i Maxwella i był wcześniej stosowany do analizy właściwości lepko sprężystych komórek i hydrożeli26, a także tkanki trzustki27. Mediany modułów nierelaksowanych (Tkanka nienaruszona: 23.05 kPa, Histoliza: 0.20 kPa i Chrząstka kondensująca: 1.60 kPa) oraz pozornych modułów Younga (Tkanka nienaruszona: 17.54 kPa, Histoliza: 0.07 kPa i Chrząstka kondensująca: 1.54 kPa) wyznaczone dla tkanek na różnych etapach regeneracji wykazały istotne różnice (Rysunek 2G-H). Ogólnie, przy wybranej szybkości odkształcenia zaobserwowano przeważnie sprężystą odpowiedź tkanek na deformację, co odzwierciedla duże podobieństwo modułów sprężystości nierelaksowanych i pozornych (Rysunek 2G,H). Istotnie niższe mediany wartości pozornej lepkości uzyskano dla etapu histolizy (0.72 Pa·s) w porównaniu do etapu tkanki nienaruszonej (2.06 Pa·s) oraz etapu chrząstki kondensującej (2.32 Pa·s) (Rysunek 2I). Zgodnie z oczekiwaniami, pozorne moduły Younga z analizy PyJjibe (Rysunek 2H) były w wysokim stopniu zgodne z wartościami uzyskanymi za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych JPK (Rysunek 2F).
Podsumowując, charakterystyka mechaniczna odzwierciedla dynamiczną przebudowę tkanki podczas procesu regeneracji. Pomiary te są zgodne z obserwacjami anatomicznymi, w których sztywność tkanki maleje wraz z obserwowanymi zmianami w architekturze tkanki (Rysunek 1C) i jest stopniowo przywracana w trakcie regeneracji.
<img alt="Proces histolizy chrząstki; schematy i obrazy mikroskopowe; kość promieniowa i łokciowa w centrum; fluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pomiary wklęsłości chrząstki kończyny axolotla podczas regeneracji. (A) Schematyczne przedstawienie etapów regeneracji. Linia przerywana wskazuje przybliżone miejsce przekroju poprzecznego wykonanego wibratomem, w którym przeprowadzono pomiary. (B) Reprezentatywne obrazy pomiarów w centrum (góra) i na obwodzie (dół) chrząstki kończyny. Czarna końcówka to belka dwuwpisowa (cantilever). Pasek skali: 100 µm. (C) Architektura tkanki w kończynach nienaruszonych (lewo), tkanki podlegającej histolizie (środek) i kondensującej chrząstki (prawo). Zielony: jądra (Hoechst), magenta: filamenty aktynowe (Falloidyna). Pasek skali: 500 µm. C' Powiększony obszar obrysowany w panelu. Pasek skali: 100 µm. Siatki wklęsłości o wymiarach 70 µm x 70 µm są zaznaczone białymi (centrum) i żółtymi (obwód) przerywanymi kwadratami. Na panelach B i C litery R i U oznaczają odpowiednio kość promieniową (Radius) i łokciową (Ulna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia sił atomowych: Krzywe siła-wgniecenie, moduł Younga, diagramy analizy chrząstki, dopasowanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Pomiar sztywności chrząstki podczas regeneracji kończyny aksolotla z wykorzystaniem AFM. (A) Schematy eksperymentu wbijania AFM przedstawione jako siła w funkcji czasu (powyżej) oraz siła w funkcji odległości między indentorem a próbką (poniżej). Krzywe zbliżania i oddalania przedstawiono odpowiednio w kolorze niebieskim i czerwonym. Punkt kontaktu zaznaczono czarną pionową linią przerywaną. Krzywe siła-wbijanie dopasowano w obrębie części zbliżania, wykorzystując model Hertza/Sneddona (oprogramowanie do przetwarzania danych JPK oraz Pyjibe) lub rozszerzenie modelu KVM dla materiałów lepkosprężystych w programie Pyjibe. (B) Reprezentatywne krzywe siła-odległość z pomiarów AFM w nienaruszonych i regenerujących kończynach podczas etapów histolizy oraz kondensacji chrząstki. Procent analizowalnych krzywych (tj. pozbawionych artefaktów) jest wskazany w prawym górnym rogu każdej krzywej. (C) Przykłady typowych artefaktów w krzywych siła-wgłębienie, np. wynikające z nieprawidłowego kontaktu indentora z powierzchnią. Przedstawione przykłady dotyczą kończyn nienaruszonych, jednak analogiczne rodzaje artefaktów zaobserwowano we wszystkich warunkach. Dla B-CReprezentatywne krzywe siła-odległość zostały dopasowane i wyświetlone przy użyciu programu Pyjibe. Jasnoniebieska krzywa przedstawia etap zbliżania, a jasnoczerwona krzywa etap oddalania. Ciemnoniebieska linia to zastosowane dopasowanie wg modelu Hertza/Sneddona dla wkluwacza sferycznego. Odpowiednie rezydua z dopasowania są pokazane poniżej dla dolnych krzywych siła-odległość. Wykreślone rezydua reprezentują różnicę między dopasowaniem a rzeczywistymi wartościami siły.D) Pozorne moduły Younga środków kości promieniowej i łokciowej mierzone w kończynach nienaruszonych oraz poddawanych histolizie. (E) Pozorne moduły Younga centrum chrząstki w porównaniu z jej obwodem (Peri) w kończynach nienaruszonych oraz podczas histolizy. (F) Pozorne moduły Younga zmierzone dla centrum chrząstki w analizowanych etapach regeneracji. Dla D-F: każda kropka pochodzi z jednej pomyślnie przeanalizowanej krzywej siła-odległość, a większe kropki odpowiadają wartościom mediany na próbki. Pozorne moduły Younga uzyskano za pomocą dopasowania modelu Hertza/Sneddona w oprogramowaniu JPK Bruker.G-I) Moduł nierelaksacyjny (G), pozorny moduł Younga (H) oraz lepkość pozornej (I) obliczone przy użyciu PyJibe (rozszerzenie KVM) na podstawie pomiarów z centrum chrząstki w analizowanych etapach regeneracji. Każda kropka pochodzi z jednej pomyślnie przeanalizowanej krzywej siła-odległość. Linie odpowiadają wartościom mediany wszystkich pomiarów na warunek. Dla D-ITest Kruskala-Wallisa z testem wielokrotnych porównań Dunna. Różne litery oznaczają warunki, które różnią się od siebie statystycznie (p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

W tym protokole pokazujemy, jak przygotować tkankę aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM) i wykonać pomiary wgłębień w nienaruszonej i regenerującej się chrząstce kończyny.

Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla

Mechanical forces provide important signals for normal cell function and pattern formation in developing tissues, and their role has been widely studied ...

Interesuje nas zrozumienie roli sygnałów mechanicznych w procesie regeneracji. W tym celu kluczowe jest posiadanie niezawodnych narzędzi, które umożliwiają pomiar właściwości mechanicznych, takich jak AFM. Istnieje wiele technik badania właściwości mechanicznych tkanek.Na przykład udostępnij geometrię lub elastografię. Jednak złotym standardem dla małych próbek tkanek lub badania właściwości mechanicznych tkanek w skali komórkowej jest nadal AFM. Jednym z najtrudniejszych etapów jest przygotowanie próbki, ponieważ musimy zapewnić maksymalną integralność strukturalną, abyśmy mogli wiarygodnie mierzyć właściwości mechaniczne próbek za pomocą AFM.Wierzymy, że nasze odkrycia zmotywują do bardziej mechanistycznych badań nad tym, jak sygnały mechaniczne wpływają na regenerację tkanek. Ponadto uzyskane wyniki mogą poinstruować bardziej realistyczne modele inżynierii tkankowej do przeprowadzania takich eksperymentów.

atomic-force-microscopy-measurements-cartilage-intact-regenerating

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokoły echokardiografii do dwuwymiarowego i trójwymiarowego obrazowania bijącego serca salamandry aksolotlowej (Ambystoma mexicanum), modelowego gatunku w regeneracji serca. Metody te pozwalają na podłużną ocenę funkcji serca w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Echokardiografia 2D i 3D u aksolotla (Ambystoma Mexicanum)

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Ten manuskrypt przedstawia protokoły chirurgicznego zadawania kontrolowanych i ostrych uszkodzeń rdzenia kręgowego regeneracyjnemu aksolotlowi (Ambystoma mexicanum).

Stłuczenie Uszkodzenie rdzenia kręgowego poprzez mikrochirurgiczną laminektomię w regeneracyjnym aksolotlu

Prezentujemy metodę badania wczesnych zmian zwyrodnieniowych stawów na poziomie komórkowym w chrząstce stawowej za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do wykrywania wczesnej choroby zwyrodnieniowej stawów

Ten artykuł opisuje, jak przeprowadzić metodę chirurgiczną hamującą powstawanie naskórka ran podczas regeneracji kończyn aksolotla poprzez natychmiastowe zszycie skóry o pełnej grubości na płaszczyźnie amputacji. Metoda ta pozwala badać funkcjonalne role naskórka rany we wczesnych etapach regeneracji kończyn.

Hamowanie tworzenia się naskórka rany poprzez pełną operację płata skóry podczas regeneracji kończyn aksolotla

Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.

Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Przedstawiono protokół operacji osteotomii kości udowej z użyciem wewnętrznego mocowania płytki u dojrzałych aksolotlów. Zabieg może być wykorzystany do wykonywania badań porównawczych nad regeneracją kończyn i gojeniem złamań u wodnych.

Stabilizacja osteotomii kości udowej z mocowaniem płytki w Ambystoma mexicanum

Celem niniejszej pracy było ujednolicenie bezpiecznego i powtarzalnego podejścia chirurgicznego do przeprowadzenia całkowitej poprzecznej amputacji żuchwy u Ambystoma mexicanum w celu badania regeneracji tkanki czaszkowo-twarzowej.

Projektowanie i standaryzacja modelu urazu żuchwy w celu badania regeneracji tkanek czaszkowo-twarzowych w modelu Ambystoma mexicanum

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Poznaj pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki kończyny aksolotla w celu badania mechanicznych sygnałów w procesie regeneracji tkanek. Ta metoda pozwala dokładnie mierzyć właściwości mechaniczne kluczowe dla inżynierii tkankowej.

Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla

Przeglądaj więcej filmów