Charakterystyka mikromechaniczna tkanki płucnej przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest scharakteryzowanie lokalnego środowiska mechanicznego miąższu płuc w skali przestrzennej istotnej dla komórek rezydentnych poprzez bezpośredni pomiar lokalnych właściwości elastycznych świeżej, lustrzanej tkanki płucnej za pomocą mikroskopii sił atomowych mikrowgłębienia. Osiąga się to poprzez przecięcie napompowanej tkanki płucnej myszy agarro za pomocą brzytwy lub ostrza skalpela w celu przygotowania pasków miąższu płuc o długości i szerokości pięciu na pięć milimetrów oraz grubości 400 mikrometrów. Następne nieutrwalone paski tkanki płucnej un perme to barwienie immunologiczne, które identyfikuje obszary zainteresowania dla mikrowgłębienia FM.

Następnie wykonuje się mikrowgłębienie FM na paskach tkanek w PBS w temperaturze pokojowej. W celu bezpośredniego pomiaru lokalnych właściwości sprężystych świeżej tkanki płucnej uzyskuje się wyniki. Pokazują one uderzające różnice w zakresie i rozkładzie sztywności tkanek w prawidłowym i zwłóknienionym miąższu płuc oraz duże przestrzenne różnice w sztywności, szczególnie w obrębie zwłóknienionej próbki płuc.

Na podstawie map sztywności wyodrębnionych z krzywych wymuszonego przemieszczenia uzyskanych za pomocą mikrowgłębienia FM. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi środkami, takimi jak rozciąganie pasków tkankowych, jest to, że oferuje ona niespotykaną rozdzielczość przestrzenną, zapewniając unikalną perspektywę na mikroskalowe zmiany sztywności tkanek. Pomiar ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, jak sztywność zmienia się przestrzennie w tkance oraz jaki jest zakres i skala przestrzenna zmian sztywności w chorobie.

Procesy, które skutkują przebudową tkanki Aby przygotować paski tkanki płucnej, zacznij od ustabilizowania struktury płuc do cięcia poprzez napompowanie izolowanych płuc myszy. Dotchawczo z 50 mililitrami na kilogram masy ciała ciepłego, 2% niskiego punktu żelu przygotowanego w PBS zwiąż tchawicę i schłodzić napompowane płuca w kąpieli PBS o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Aros żeluje się i sztywnieje w przestrzeniach powietrznych, aby delikatnie ustabilizować strukturę płuc W tym czasie, za pomocą brzytwy lub skalpela, pokrój stabilizowaną tkankę płucną myszy na paski o długości i szerokości około pięciu na pięć milimetrów oraz grubości 400 mikrometrów.

Następnie umyj paski w PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby usunąć resztki aros, aby wykluczyć duże drogi oddechowe i naczynia. Jeśli mają być obrazowane drogi oddechowe w dużych naczyniach, należy wyciąć paski z obszarów podopłucnowych oddalonych od głównych oskrzeli łodygowych, wyciąć paski z tkanki płucnej bardziej proksymalnie do oskrzeli głównej łodygi, aby wyizolować obszary zainteresowania dla mikrowgłębienia FM. Wizualizacja tkanki za pomocą mikroskopii kontrastowej twarzy lub barwienia immunologicznego i wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Prosimy o zapoznanie się z pisemną częścią niniejszego protokołu w celu zapoznania się z procedurą. Bezpośrednio przed charakterystyką FM przymocuj paski tkanki do 15-milimetrowych szkiełek nakrywkowych pokrytych poli L lizyną, podnosząc szkiełko nakrywkowe spod pływającej tkanki, upewniając się, że pasek tkanki rozprowadza się równomiernie na powierzchni szkiełka nakrywkowego. W razie potrzeby umieść pasek na drugim czystym, niepowlekanym szkiełku nakrywkowym i delikatnie dociśnij, aby pomóc w przymocowaniu tkanki do szkiełka nakrywkowego pokrytego polilizyną.

Skalibruj system A FM zgodnie z instrukcjami producenta bezpośrednio przed każdą rundą eksperymentów z mikrowgłębieniami. W tym celu określ dwa krytyczne parametry. Stała sprężystości wspornika przy użyciu metody fluktuacji termicznej w powietrzu i czułość ugięcia wspornika, która jest parametrem używanym do skalowania sygnału wyjściowego fotodiody do rzeczywistej odległości ugięcia wspornika.

Skalibruj czułość ugięcia, uzyskując standardową krzywą wymuszonego przemieszczenia w PBS na czystym szkiełku podstawowym. Następnie oblicz nachylenie krzywej wymuszonego przemieszczenia w pomiarze krzywej wymuszonego przemieszczenia. Końcówka A FM jest wysuwana w kierunku powierzchni próbki i cofana od niej w jednym miejscu, przy czym odchylenie wspornika delta D jest monitorowane w funkcji delta przemieszczenia końcówki Z.It zaleca się stosowanie trójkąta wspornikowego z azotku krzemu z kulistą końcówką o średnicy pięciu mikrometrów przy użyciu sond FM o stałej sprężystości 0,06 niutona na metr.

Scharakteryzowaliśmy mechanicznie miękkie materiały o modulacji przezroczystej o rozpiętości od 100 do 50 000 paskali. Przetrzyj dolną powierzchnię szkiełka nakrywkowego próbki bibułą, a następnie przymocuj ją do standardowego szkiełka podstawowego za pomocą smaru próżniowego. Zamontuj szkiełko podstawowe na stoliku na próbki A FM i przykryj tkankę 500 mikrolitrami PBS o temperaturze pokojowej.

Następnie umieść głowicę skanującą FM nad próbką. Wyreguluj stolik na próbkę mikroskopu, aby ustawić mikroskop do okularu viewaby wyrównać końcówkę A FM w środku pola view. Przesuń stolik próbki A FM, aby wybrać obszar zainteresowania na tkance.

Następnie przełącz się na kamerę CCD view, aby rejestrować obraz kontrastu fazowego i/lub obrazy fluorescencyjne tkanki zgodnie z potrzebami. Powoli przesuwaj końcówkę A FM w dół, aż zetknie się z sample dokładny. Charakterystyka mikrowgłębienia FM miękkich próbek wymaga małych głębokości wgłębień, aby uniknąć dużych lokalnych odkształceń, które unieważniają model hercowy używany do obliczania modułu sprężystości, aby uniknąć dużych odkształceń, wykonaj wgłębienie w trybie wyzwalania, ustawiając maksymalne ugięcie wspornika na 500 nanometrów.

Ta granica ugięcia ograniczy maksymalną siłę wcięcia do mniej niż 30 nanoniutonów. Prędkość wgłębienia powinna być tak dobrana, aby była wystarczająco niska, aby można było zbadać właściwości elastyczne, a nie lepkosprężyste miękkiej próbki. Wybierz zakres prędkości od dwóch do 20 mikrometrów na sekundę dla tkanki płucnej dla pojedynczego pomiaru z obszaru zainteresowania.

Przesuń sondę A FM w interesujące Cię miejsce i wykonaj pojedyncze wcięcie, aby zebrać standardową krzywą przemieszczenia siły. Sonda będzie poruszać się tylko w kierunku Z. Aby automatycznie zmapować obszar zainteresowania, przełącz się w tryb mapy wymuszenia, wybierz rozmiar skanowania i punkty próbkowania w wybranym obszarze.

Końcówka A FM RA przesuwa się w poprzek powierzchni próbki między ruchami wgłębień i zbiera indywidualne krzywe wymuszonego przemieszczenia w każdym punkcie w niezdefiniowanej siatce próbki. Stwierdziliśmy, że praktyczne jest użycie siatki próbek o wymiarach 16 na 16 do zmapowania obszaru o wymiarach 80 na 80 mikrometrów przy prędkości wgłębienia 20 mikrometrów na sekundę, co można ukończyć w około 10 minut. Aby obliczyć moduł Younga, dopasuj krzywą przemieszczenia siły do hercowego modelu wcięcia sferycznego, używając dopasowania krzywej nieliniowej kwadratu Lee, jak pokazano tutaj, gdzie F równa się K, sub C razy delta D to siła potrzebna do zgięcia wspornika.

K sub C jest stałą sprężystości wspornikowej. R to promień końcówki kuli, delta równa się delta Z minus delta D to wcięcie, a nowy to współczynnik Poissona próbek, który wynosi 0,4 dla tkanki płucnej. Aby ocenić jakość dopasowania, należy obliczyć wartość SSR lub sumę kwadratów różnicy między danymi a wartościami dopasowania podczas dopasowania krzywej nieliniowej.

Wyeliminuj niewiarygodne lub niemożliwe do zinterpretowania pomiary, odrzucając dane z uszkodzonych krzywych o dużych wartościach SSR. W razie potrzeby przekształć moduł sprężystości lub E na moduł czysty. G.Korzystając z relacji E równa się dwa razy sumie jeden plus nowe razy G.To wizualizacji przestrzennych wzorców sztywności zebranych w trybie mapy sił, wykreślić dane modułu i mapy konturowe, na przykład w siatce 16 na 16 obejmującej obszar o wymiarach 80 mikrometrów na 80 mikrometrów.

Aby przetworzyć dużą ilość danych dotyczących krzywej siły, można napisać niestandardowy algorytm, który automatycznie dopasowuje krzywe przemieszczenia siły, wyodrębnia mapy modułowe i/lub wykresy konturowe lub przeszczep ELA. Korzystając z tych samych procedur i parametrów, które właśnie opisano, rysunek ten pokazuje, że prawidłowo tnę i barwię tkankę. Mikro pęcherzyk płucnych miąższu płuc jest dobrze zachowany, co obserwuje się za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego składnika błony podstawnej, lamininy bez utrwalenia lub przenikania.

Panele te pokazują barwienie immunofluorescencyjne kolagenu, jedno w świeżych, nieutrwalonych płucach pobranych od myszy wcześniej leczonych PBS lub leczonych blio mycyną w celu wywołania zwłóknienia. Przykładowe wykresy przemieszczenia siły uzyskane z mikrowgłębienia FM są pokazane tutaj przy tej samej przyłożonej sile. Końcówka A FM generuje duże wgłębienie w miękkim obszarze, co skutkuje stosunkowo płaską krzywą przemieszczenia siły pokazaną na niebiesko w porównaniu z małym wcięciem i stromą krzywą przemieszczenia siły dla sztywniejszego obszaru pokazanego na czerwono.

Aby uzyskać czyste krzywe siły po każdym wgłębieniu, końcówka A FM musi być całkowicie cofnięta od powierzchni próbki i wolna od kontaktu przed następnym wgłębieniem. Ten stan bezkontaktowy odpowiada płaskiemu obszarowi krzywej, w którym końcówka przesuwa się bez ugięcia wspornika. Rysunek ten przedstawia typową fałszywą krzywą bez płaskiego obszaru, która występuje, gdy końcówka nie jest całkowicie cofnięta od powierzchni próbki, na przykład gdy miękka próbka przyczepia się do końcówki, co uniemożliwia określenie punktu kontaktu, jeśli końcówka jest całkowicie uwięziona w miękkiej próbce.

Krzywa może wyglądać tak bez wyraźnego ugięcia, ale z niewielkim szumem. Ten rysunek pokazuje sztywność. Dane uzyskane z krzywych wymuszonego przemieszczenia wyświetlanych przestrzennie jako mapy sztywności określane jako przeszczep ELAs, gdzie kolorowe skale ze sztywnością przeszczepu ELA wykazują uderzające różnice w zakresie i rozkładzie sztywności tkanki w prawidłowym i zwłóknienionym miąższu płuc oraz duże przestrzenne różnice w sztywności, szczególnie w zwłókniejącej próbce płuc.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak scharakteryzować lokalne środowisko mechaniczne miąższu płuc poprzez bezpośredni pomiar lokalnych właściwości elastycznych świeżej tkanki płucnej za pomocą mikroskopijnej kopii Atomic Force.