Name: Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę pomiaru modułu Younga błony podstawnej płuc myszy przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Technika ta pozwala zachować właściwości mechaniczne próbek i badać rolę sztywności w inwazji komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

B.H. i H.C.-S. potwierdzają finansowanie przez Bawarskie Ministerstwo Nauki i Sztuki przez Bawarski Focus Bawarski Focus Badawczy Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben (CANTER) oraz Bawarskie Forum Akademickie (BayWISS)-Konsorcjum Doktoranckie Badań nad Zdrowiem. Opracowanie oprogramowania do analizy danych CANTER Processing Toolbox zostało sfinansowane przez Niemiecką Fundację Badawczą w ramach podprojektu 1 (CL 409/4-1/2) konsorcjum badawczego Badanie zwyrodnienia i regeneracji chrząstki stawowej oraz kości podchrzęstnej w chorobie zwyrodnieniowej stawów - ExCarBon (FOR2407-1/2). B.H. oraz H.C.-S. potwierdzić finansowanie przez Niemiecką Fundację Badawczą w ramach dużej kampanii dotyczącej oprzyrządowania GGA-HAW (INST 99/38-1). Prace te były dodatkowo wspierane przez Duńskie Towarzystwo Onkologiczne (R204-A12454 (R.R.)) oraz Niemiecką Fundację Badawczą (539446614 do R.R.).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Charakterystyka mechaniczna BM spotkała się z dużym zainteresowaniem ze względu na ich wpływ na różne funkcje komórkowe, takie jak pączkowanie guza, różnicowanie komórkowe, ruch komórek i dostępność chromatyny 53,63,64,65,66,67,68 . W związku z tym istnieje niewypełniona luka w zdolności do oceny mechaniki BM w spójny i mierzalny sposób. Protokół ten ma na celu umożliwienie użytkownikom AFM określenia modułu Younga płucnych BM na podstawie zdrowych lub patologicznych próbek płuc myszy uzyskanych od myszy typu dzikiego lub zmodyfikowanego genetycznie. Przyjazna dla użytkownika aplikacja MATLAB CANTER Processing Toolbox56 oparta na graficznym interfejsie użytkownika ułatwia dalszą analizę danych AFM. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla innych badaczy prowadzących badania, które mogą prowadzić do postępów w diagnostyce klinicznej, leczeniu lub nowych strategiach leczenia chorób płuc.
Krytyczne kroki w protokole obejmują zapewnienie, że podczas kriosekcji próbki płuc skrawki tkanek nie rozmrażają się w żadnym momencie, aby zapobiec zmianom właściwości mechanicznych spowodowanych cyklami zamrażania i rozmrażania. Dlatego ważne jest, aby do zbierania skrawków używać wyłącznie wstępnie schłodzonych szkiełek mikroskopowych i obchodzić się z nimi tylko w komorze kriotomu. Najważniejszym krokiem podczas rejestrowania map sił na ścianie wyrostka zębodołowego jest wykorzystanie wygenerowanego obrazu nachylenia, który zapewnia jakościowy przegląd rozkładu sztywności badanego obszaru, w celu określenia odpowiedniego miejsca pomiaru BM. Filtrowanie przestrzenne uzyskanych wartości modułu Younga stanowi krytyczny krok w protokole i jest kluczową cechą zestawu narzędzi do przetwarzania CANTER. Ten etap filtrowania umożliwia badaczowi zidentyfikowanie BM, który znajduje się między dwiema bardziej miękkimi warstwami komórek, poprzez jego charakterystyczny sztywniejszy ślad i wyodrębnienie odpowiednich wartości modułu Younga BM do dalszej analizy.
Ten zaawansowany proces analizy wykazał, że myszy z nokautem netryny-4 wykazywały znacznie (około dwukrotnie) wyższy moduł Younga w błonie podstawnej płuc w porównaniu z myszami z dzikim miotem53. W związku z tym niniejszy protokół ułatwia analizę porównawczą różnych warunków lub grup.
Oprócz AFM istnieje wiele metodologii badania właściwości mechanicznych biomateriałów, obejmujące pęsety optyczne lub magnetyczne 69,70,71 na poziomie molekularnym, techniki mikrowgłębień72,73 w skali pośredniej oraz testy kompresji ograniczonej lub nieograniczonej74,75 na poziomie makroskopowym. W szczególności miografia ciśnieniowa, próby rozciągania76,77 i reologia78 zostały wykorzystane do oceny sztywności BM próbek naczyniowych i odtworzonych matryc BM. Jednak techniki takie jak miografia ciśnieniowa i próba rozciągania mogą ocenić tylko właściwości mechaniczne całych tkanek lub całych struktur tkankowych, takich jak całe naczynia krwionośne, które obejmują różne warstwy komórek i elementy strukturalne. W rezultacie, przy stosowaniu tych metod do oceny biomechaniki BM, właściwości mechaniczne innych niż BM, takie jak składniki komórkowe, są zawsze nakładane na wyniki BM, co utrudnia wyizolowanie specyficznych właściwości samego BM.
W tym protokole cecha będąca przedmiotem zainteresowania (BM) jest wyodrębniana poprzez filtrowanie przestrzenne wyników mapy sił. Ograniczeniem tego podejścia jest wymóg, aby cecha będąca przedmiotem zainteresowania była dostrzegalna i możliwa do zidentyfikowania jako wyraźny wzór w uzyskanych mapach modułu Younga lub w dowolnym innym dostępnym kanale mapy. Na przykład BM w tkance wyrostka zębodołowego można zidentyfikować wyłącznie ze względu na jego wzajemnie połączoną strukturę, która wykazuje znacznie wyższy moduł Younga w porównaniu z otaczającymi komórkami. W związku z tym BM manifestuje się jako ciągły jasny pasek na uzyskanych mapach modułu Younga. Niemniej jednak inne struktury biologiczne wykazują właściwości mechaniczne, które nie różnią się na tyle od właściwości otaczającej tkanki, aby umożliwić filtrowanie przestrzenne w wynikach mapy. Chociaż protokół można łączyć z innymi metodami identyfikacji struktur na zarejestrowanych mapach sił, takimi jak barwienie immunofluorescencyjne, takie podejście może przynieść wyniki, które są trudne do interpretacji. To powikłanie może wystąpić, ponieważ procedury barwienia mogą zmienić właściwości mechaniczne tkanek. W związku z tym jakiekolwiek przetwarzanie lub barwienie tkanki przed pomiarami AFM powinno być przeprowadzane tylko wtedy, gdy nie jest dostępna żadna alternatywna metoda identyfikacji cechy będącej przedmiotem zainteresowania. Ponadto ważne jest przeprowadzenie odpowiednich eksperymentów kontrolnych porównujących właściwości biomechaniczne próbek barwionych i niebarwionych.
Protokół wprowadza metodę identyfikacji struktur docelowych na podstawie kontrastu modułu Younga. W związku z tym może być stosowany do tkanek o anatomicznym BM podobnym do płuc, w tym tarczycy, okrężnicy i prostaty. (patrz Rozszerzony rysunek danych w Hartmann et al.59). Chociaż początkowo został opracowany do analizy mechaniki BM, protokół ten i CANTER Processing Toolbox56 są wystarczająco wszechstronne, aby zbadać dowolny mechanicznie odrębny i połączony region na mapach sił AFM (patrz instrukcje na www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki). To szerokie zastosowanie sprawia, że narzędzie to jest cenne w całej dziedzinie AFM i wspiera rosnące zainteresowanie mechanobiologią w szerszej społeczności naukowej.

Mapy sił AFM stały się powszechnie stosowaną techniką do określania właściwości nanomechanicznych różnorodnych próbek biologicznych z nanometrową rozdzielczością przestrzenną i czułością siły Piconewton1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Pionierskie badania nad zastosowaniem pomiarów AFM do próbek biologicznych w warunkach fizjologicznych przeprowadzili P. Hansma i współpracownicy13,14,15,16,17,18,19,20. Następnie zastosowano pomiary siły AFM do oceny właściwości mechanicznych poszczególnych cząsteczek21, żywe komórki i ich cytoszkielet9,10,22,23,24,25,26, tkanki i sekcje tkanek6,8,11,27,28,29,30,31, a także biologiczne hydrożele3,4,32. W naszych badaniach wykorzystaliśmy AFM do zbadania właściwości mechanicznych wiązań biologicznych i chemicznych18,33,34,35,36,37 oraz do pomiaru cech nanomechanicznych poszczególnych komórek38,39,40. Ponadto, pomiary chrząstki płytki wzrostu8 wykazały, że architektura kolagenu i moduł Younga w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) kierują podziałem chondrocytów, a co za tym idzie, kierunkiem wzrostu mysiej płytki wzrostu podczas rozwoju embrionalnego. Ponadto zbadaliśmy zmiany związane ze zwyrodnieniem chrząstki i chorobą zwyrodnieniową stawów w chrząstce stawowej2,41,42,43,44,45,46,47.
W ostatnich latach liczne badania AFM badały właściwości mechaniczne zarówno zdrowej, jak i patologicznej tkanki płucnej48,49,50,51,52. Jednak badania te dotyczyły przede wszystkim ogólnej mechaniki tkanek, nie skupiając się na konkretnych składnikach tkanki, takich jak BM. BM stanowi cienką warstwę (100 nm - 400 nm u ludzi) wyspecjalizowanej struktury ECM, która wyściela większość narządów ssaków i struktur tkankowych, takich jak neurony, mięśnie, tkanki adipocytów i naczynia krwionośne. Odkryliśmy, że właściwości mechaniczne mysiego płucnego BM odgrywają kluczową rolę podczas tworzenia przerzutów w taki sposób, że łagodniejszy BM koreluje z wyższym prawdopodobieństwem przeżycia u pacjentów z rakiem piersi i nerki53. Co więcej, badanie to ujawniło, że wydzielane białko macierzy zewnątrzkomórkowej netryna-4 zmniejsza moduł Younga BM poprzez stechiometryczną interakcję 1:1 z lamininą γ1, kluczowym składnikiem obecnym w prawie wszystkich sieciach lamininy wewnątrz BMs40.
Tutaj prezentujemy wizualizację opracowanego przez nas protokołu do wyznaczania modułu Younga (EBM) cienkiego mysiego płucnego BM o długości fali 100 - 200 nm. Moduł Younga BM jest miarą jego sztywności i jest definiowany jako stosunek naprężenia (siły na jednostkę powierzchni) do wynikowego odkształcenia osiowego (przemieszczenia) podczas liniowego odkształcenia sprężystego54, w tym przypadku niewielkie ściskanie BM przez wciętą końcówkę AFM. W eksperymencie AFM siłę i przemieszczenie (głębokość wcięcia) można uzyskać na podstawie ugięcia wspornika AFM i położenia wspornika, a moduł Younga (zależność naprężenie-odkształcenie) można wyodrębnić z wynikowej krzywej siła w funkcji wgłębienia za pomocą odpowiedniego modelu sprężystego, który uwzględnia geometrię końcówki wcięcia (w tym przypadku zmodyfikowany model Hertza<klasa sup="xref">55). Główne kroki są pokazane w Rysunek 1. Początkowo protokół ten określa metodologię przygotowania i osadzania próbek mysiej tkanki płucnej w związku OCT (patrz krok 1), ułatwiając w ten sposób późniejszą procedurę kriosekcji (krok 2), która umożliwia określenie sztywności BM przy użyciu map sił AFM. Przedstawiona tu technika kriosekcji, wykorzystująca taśmę jednostronną i dwustronną, umożliwia przecięcie tkanki płucnej bez konieczności utrwalania i bez rozmrażania wycinka. Szczegółowa procedura AFM służąca do zbierania odpowiednich danych do oceny sztywności BM została opisana w trzeciej sekcji protokołu. W następnej sekcji protokołu wyjaśniamy, w jaki sposób wygenerowane objętości siły mogą być automatycznie analizowane (krok 4.1) za pomocą opracowanego przez nas oprogramowania opartego na MATLAB, CANTER Processing Toolbox56. W tym kroku moduł Younga jest wyodrębniany z każdej zarejestrowanej krzywej wcięcia siły poprzez dopasowanie zmodyfikowanego modelu Hertza, który jest korygowany dla geometrii wgłębnika, w tym przypadku czworobocznej piramidy55. Na koniec opisujemy w krokach 4.2 i 4.3, jak zastosować narzędzie do filtrowania przestrzennego i narzędzie filtrujące R2 opracowanego zestawu narzędzi w celu wyodrębnienia wartości modułu Younga specyficznych dla błony podstawnej (BM) z obszernego zestawu wartości modułu Younga uzyskanych na mapie sił zawierającej wszystkie przedziały tkankowe ściany wyrostka zębodołowego.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>10 mL Strzykawka</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 ml Rurka Falcon Rurka</td> z <td>nakrętką</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td></tr><tr><td>Wspornik - MLCT</td><td>Sondy AFM Bruker</td><td>3444</td><td>Wspornik AFM w kształcie piramidy</td></tr><tr><td>Ostrza kriotomu</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>Niskoprofilowe ostrza jednorazowe DB80LX</td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki kriotomu</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td>Dysk na próbki 30</td></tr><tr><td>Cyotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>Direct Overlay Extension</td> Rozszerzenie oprogramowania <td>Bruker</td><td></td><td>do oprogramowania JPK SPM, które umożliwia import obrazu optycznego mikroskopu odwróconego do przeglądarki danych oprogramowania SPM.</td></tr><tr><td>Jednorazowa forma bazowa</td><td>Usługi naukowe</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>Taśma</td><td>dwustronna tesa Film</td><td>56661-00002</td><td>Taśma do filmów fotograficznych</td></tr><tr><td>Uchwyt wspornikowy ze sprężyną</td> stałą <td></td> Mikroskop odwrócony Bruker <td></td><td></td></tr><tr><td>- Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK Zmotoryzowany stolik</td><td>montażowy Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Oprogramowanie Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM</td><td>Mikroskop Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Wersja R2024a lub wyższa</td></tr><tr><td>MATLAB - Zestaw narzędzi do dopasowywania krzywych&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazów</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Przybornik do przetwarzania sygnałów&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Zestaw narzędzi do statystyki i uczenia maszynowego</td><td>Preparaty mikroskopowe Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe do kalibracji wspornikowej Szkiełka</td></tr><tr><td>mikroskopowe - matowa krawędź</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>Szkiełka mikroskopowe z matową krawędzią do kriosekcji</td></tr><tr><td>Igła i ukośnik; 0,9 mm i razy; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT wstrzyknięcie&nbsp; do próbki płuc</td></tr><tr><td>Igła &oslash; 0,9 mm i razy; 70 mm</td><td>B Braun</td><td>4665791</td><td>Długa igła do nakładania PBS pod związek AFM</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Bio& Sprzedam</td> rozwiązanie <td>BS.L1825</td><td>PBS bez Ca2+, Mg2+, 500 mL</td></tr><tr><td>QI Advanced Imaging Extension</td><td>Rozszerzenie oprogramowania Bruker</td><td></td><td>dla oprogramowania JPK SPM, które zapewnia dla każdego zarejestrowanego piksela obrazu całą podstawową krzywą siły.</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>B Jednorazowe</td> chirurgiczne nożyczki do <td>skalpeli</td>Braun <td>5518083</td></tr><tr><td></td> Precyzyjne nożyczki do skalpela <td>M681700 Kaut-Bullinger</td><td></td><td>13 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Taśma</td><td>jednostronna tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>krystalicznie czysta taśma, 33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>Pudełko na slajdy</td><td>GWL Systemy magazynowania</td><td>K50W</td><td>Slidebox na 50 szkiełek</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy - Pęseta Zeiss</td><td></td><td></td><td></td>Stemi DR1663</tr><tr><td>- Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

wyodrębnianie modułu younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Mikroskopia sił atomowych (AFM) pozwala na scharakteryzowanie właściwości mechanicznych próbki z rozdzielczością przestrzenną kilkudziesięciu nanometrów. Ponieważ komórki ssaków wyczuwają i reagują na mechanikę swojego bezpośredniego mikrośrodowiska, charakterystyka właściwości biomechanicznych tkanek z wysoką rozdzielczością przestrzenną ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia różnych procesów rozwojowych, homeostatycznych i patologicznych. Błona podstawna (BM), cienka podstruktura macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) o grubości około 100 - 400 nm, odgrywa znaczącą rolę w progresji guza i tworzeniu przerzutów. Chociaż określenie modułu Younga dla tak cienkiej podstruktury ECM jest trudne, dane biomechaniczne BM dostarczają fundamentalnych nowych informacji na temat tego, jak BM wpływa na zachowanie komórek, a ponadto oferują cenny potencjał diagnostyczny. W tym miejscu przedstawiamy zobrazowany protokół oceny mechaniki BM w mysiej tkance płucnej, która jest jednym z głównych narządów podatnych na przerzuty. Opisujemy wydajny przepływ pracy w celu określenia modułu Younga BM, który znajduje się między warstwami komórek śródbłonka i nabłonka w tkance płucnej. Instrukcje krok po kroku obejmują zamrażanie mysiej tkanki płucnej, kriosekcję i zapis mapy sił AFM na skrawkach tkanek. Dodatkowo zapewniamy półautomatyczną procedurę analizy danych za pomocą CANTER Processing Toolbox, opracowanego przez nas przyjaznego dla użytkownika oprogramowania do analizy danych AFM. Narzędzie to umożliwia automatyczne wczytywanie zarejestrowanych map sił, konwersję krzywych siły w funkcji wydłużenia piezologicznego na krzywe siły w funkcji wcięcia, obliczanie modułów Younga oraz generowanie map modułów Younga. Na koniec pokazano, jak określić i wyizolować wartości modułu Younga pochodzące z BM płuc za pomocą narzędzia do filtrowania przestrzennego.

Po identyfikacji i pomiarze nienaruszonej ściany pęcherzyka płucnego, głównym wynikiem tego protokołu są przefiltrowane wartości modułu Younga dla BM. Należy zauważyć, że w każdym przekroju tkanki nie jest możliwe znalezienie odpowiedniej ściany pęcherzyka do pomiaru AFM. W naszych obserwacjach eksperymentalnych około 75% krioprzekrojów pobranych z próbek płuc myszych wykazywało mierzalną ścianę pęcherzyka. Aby dokładnie określić rozkład przestrzenny modułu Younga w płucnej BM, zalecamy stosowanie map sił obejmujących obszar 3 µm x 3 µm lub 4 µm x 4 µm. Takie podejście zapewnia wystarczającą rozdzielczość do badania płucnych BM myszy, których grubość zazwyczaj wynosi od 100 nm do 200 nm. W związku z tym podejście eksperymentalne polega na zarejestrowaniu 50 x 50 krzywych siły dla każdej mapy sił, co daje łącznie 2 500 krzywych siły. W obrębie mapy sił krzywe te są rozmieszczone równomiernie. Oznacza to, że oprócz modułu Younga dla BM, badane są również struktury tkankowe otaczające BM, nawet w przypadku małych map sił. Dlatego, aby dokładnie i selektywnie wyznaczyć moduł Younga wyłącznie dla płucnej BM, w niniejszym protokole zastosowano dwuetapowy proces filtrowania.
Pierwszy etap filtrowania przestrzennego, zależny od operatora, pozwala na wybranie wyników dopasowania krzywych siły pochodzących z błony podstawnej (BM) płuc myszy, co stanowi około 10% do 25% całkowitej liczby wartości wyników zawartych w analizowanej mapie sił. Po tym wstępnym filtrowaniu przestrzennym do dalszej analizy zachowuje się około 250 - 625 wyników dopasowania. Kolejny krok filtrowania zapewnia, że uwzględnione zostaną tylko wyniki związane z BM pochodzące z krzywych siły, które są odpowiednio opisane przez zmodyfikowany model Hertza. W związku z tym, jako kryterium filtrujące wykorzystuje się współczynnik determinacji (R2) dopasowania zmodyfikowanego modelu Hertza. Nasze doświadczenie empiryczne sugeruje, że zachowanie wyników z wartościami R2 wyższymi niż 0,96 jest odpowiednie dla wyników dopasowania uzyskanych przy przestrzeganiu niniejszego protokołu. Należy zauważyć, że wartość R2 jest w znacznym stopniu zależna od jakości (gładkości) i długości linii bazowej krzywej siły, wyznaczenia punktu kontaktu oraz zbieżności dopasowanego modelu. Po zastosowaniu obu procedur filtrowania dla BM pojedynczej ściany pęcherzyka zazwyczaj pozostaje około 100 do 500 wartości modułu Younga.
Rozkład pozostałych wartości modułu Younga dla BM można zwizualizować za pomocą histogramu (Rysunek 4A). Należy zauważyć, że otrzymane wartości modułu Younga dla BM płuc wykazują rozkład log-normalny, co jest powszechnie obserwowane w przypadku zmiennych losowych, które mogą przyjmować wyłącznie wartości dodatnie61. Jest to przedstawione na wykresie QQ na Rysunku 4B. W konsekwencji, do rozkładu logarytmicznie przekształconych wartości modułu Younga (E) można dopasować rozkład normalny (Gaussa). W tym przypadku do przekształcenia wartości E zastosowano logarytm naturalny (ln). Położenie szczytu rozkładu (µ) oraz odchylenie standardowe (σ) zostały wyznaczone z tego dopasowania, a następnie poddane odwrotnemu przekształceniu w celu uzyskania reprezentatywnego modułu Younga, oznaczonego jako EBM, przy użyciu następującego równania:
<img alt="Wzór funkcji wykładniczej \( E_{BM}(\mu) = e^{\mu} \) wykorzystany w modelowaniu matematycznym." src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">
Należy zauważyć, że po przeprowadzeniu retransformacji przedział odchylenia standardowego nie jest już symetryczny względem wartości szczytowej. Negatywną (σ-) i pozytywną (σ+) krawędź przedziału odchylenia standardowego można obliczyć, korzystając z następujących wyrażeń:
<img alt="Równowaga statyczna, wzór σ = e^(μ-σ) - e^μ, równania, obliczenia fizyczne." src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">
<img alt="Równanie rozkładu log-normalnego, σ₊=e^(μ+σ)−e^μ, formuła do analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">
Równania te wynikają z faktu, że funkcja wykładnicza jest funkcją odwrotną do logarytmu naturalnego62.
Po ponownej transformacji wartości szczytowej μ = 9,31 oraz odchylenia standardowego σ = 0,18 wyznaczonych z histogramu na Rysunku 4A, reprezentatywna wartość modułu Younga wynosi EBM = 11,05 kPa z przedziałem odchylenia standardowego [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Alternatywnie, do histogramu nieprzetransformowanych wartości modułu Younga (E) można dopasować rozkład log-normalny, aby wyznaczyć charakterystyczne parametry rozkładu.
Zaleca się analizę co najmniej czterech ścian na mysz w celu uzyskania wiarygodnego, reprezentatywnego wyniku, co szczegółowo opisaliśmy w pracy Hartmann et al.59. Aby wyznaczyć reprezentatywny moduł Younga EBM dla danej myszy, wartości logarytmowane wszystkich czterech ścian naniesiono na jeden wspólny histogram, a następnie wyznaczono µ i σ poprzez dopasowanie rozkładu normalnego. Następnie wartości µ i σ poddano odwrotnej transformacji, zgodnie z wcześniejszym opisem, aby otrzymać EBM oraz przedział odchylenia standardowego dla badanej myszy.
<img alt="Przygotowanie próbek do analizy objętości siły AFM; obejmuje kriosekcjonowanie, dopasowywanie danych i analizę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd głównych etapów protokołu służącego do oznaczenia modułu Younga błony podstawnej płuc myszy. Pierwszy krok obejmuje pozyskanie i przygotowanie płuc mysich, a następnie ich zatopienie. W tym celu do płuc wstrzykuje się mieszaninę medium OCT i PBS, a następnie całkowicie zanurza je w związku OCT. Następnie, za pomocą kriotomu, wykonuje się kriosekcjonowanie w celu uzyskania przekrojów tkanki płucnej o grubości 15 µm. W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy proces wykorzystania jednostronnych i dwustronnych taśm klejących do unieruchomienia próbek podczas procesu cięcia. Następnie, poprzez pomiary mapy sił AFM na przekrojach tkankowych, wyznacza się wartości modułu Younga dla BM. Po zakończeniu procesu analizy krzywych siły zastosowano filtrowanie przestrzenne oraz filtrowanie R², aby wyodrębnić wyniki modułu Younga dla analizowanej struktury, konkretnie dla BM (zaznaczonej na zielono na mapie sił i ilościowo określonej na rozkładzie logarytmicznym modułu Younga). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe struktury komórkowej; widoki powiększone; dane skanowania; analiza obrazowania komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykładowy eksperyment mapowania sił AFM przeprowadzony na przekroju tkanki płuca myszy. (A) Obraz z mikroskopii w jasnym polu przedstawiający przekrój tkanki płuca myszy, umożliwiający identyfikację odpowiednich, nienaruszonych ścian pęcherzyków znajdujących się pomiędzy dwoma pęcherzykami płucnymi. Po prawej stronie obrazu widoczny jest trójkątny wspornik F MLCT urządzenia AFM. (B) Powiększony widok wybranej ściany w przekroju tkankowym. (C) Kanał nachylenia (slope) i (D) kanał wysokości (height) mapy ogólnej o rozmiarach 15 x 15 µm zawierającej 50 x 50 krzywych sił ściany pęcherzyka. W kanale nachylenia błona podstawna (BM) jest widoczna jako jasna linia (biała strzałka), co wskazuje na strukturę o zwiększonej sztywności w obrębie ściany. Kanał wysokości potwierdza integralność ściany, nie wykazując oznak przerwania. Po zidentyfikowaniu BM na mapie ogólnej 15 x 15 µm, zarejestrowano mniejszą mapę 4 x 4 µm (E: kanał nachylenia, F: kanał wysokości) z 50 x 50 krzywymi sił. Paski skali: (A) 200 µm oraz (B-D) 25 µm. Zakresy skal kolorystycznych dla przedstawionych obrazów AFM wynoszą (C) 2,36 - 9,29 nN/µm, (D) 0 - 3,38 µm, (E) 2,36 - 9,29 nN/µm (obraz ogólny) i 2,42 - 8,37 nN/µm (mniejszy obraz), (F) 0 - 3,38 µm (obraz ogólny) i 0 - 1,99 µm (mniejszy obraz), od ciemnego do jasnego. Dla wszystkich obrazów AFM zastosowano liniowe skale kolorów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapy modułu Younga, histogramy; rozkład elastyczności, mikromechanika, wykres kPa, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wizualizacja procedury filtrowania przestrzennego. (A) Mapa modułu Younga uzyskana z analizy krzywych siły, przedstawiona w narzędziu Result Filtering Tool w celu umożliwienia przestrzennego filtrowania wyników. Błonę podstawową (BM) można zidentyfikować jako jasny prążek (wysokie wartości modułu Younga) otoczony przez miększe obszary tkanki. (B) Histogram wartości modułu Younga odpowiadający niefiltrowanej mapie (A). Po (C) zastosowaniu maski filtra przestrzennego (obszar zielony), (D) histogram obejmuje wyłącznie wartości modułu Younga z zaznaczonego na zielono regionu, który zidentyfikowano jako BM. Należy zauważyć, że pozostałe niskie wartości widoczne po lewej stronie histogramu można przypisać słabo zbieżnym dopasowaniom, które zostaną usunięte w kolejnym kroku filtrowania R². <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Histogram i wykres Q-Q modułu Younga BM (skala logarytmiczna), rozkład danych i ocena normalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Rozkład modułu Younga mysiej macierzy pozakomórkowej (BM) płuc uzyskany po zastosowaniu niniejszego protokołu. (A) Logarytmicznie znormalizowany histogram otrzymanych wartości modułu Younga BM (N = 325). Poprzez dopasowanie rozkładu normalnego (czarna ciągła linia) wyznaczono wartość średnią µ = 9.31 z odchyleniem standardowym σ = 0.18. Po odwrotnej transformacji odpowiada to modułowi Younga BM wynoszącemu EBM = 11.05 kPa z asymetrycznym przedziałem odchylenia standardowego [-1.82 kPa, +2.18 kPa]. (B) Wykres QQ kwantyli zlogarytmowanych wartości modułu Younga BM w stosunku do kwantyli standardowego rozkładu normalnego. Wykres ten pokazuje, że z wyjątkiem niektórych wartości w lewym i prawym ogonie rozkładu, otrzymane wartości modułu Younga mają głównie rozkład log-normalny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół wizualizuje, jak przygotować kriosekcje mysiej tkanki płucnej, przeprowadzić eksperymenty z mapą siły pod mikroskopią sił atomowych i przeanalizować dane w celu określenia modułu Younga natywnej mysiej błony podstawnej płuc.

Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

W naszych badaniach badamy wpływ właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej na zachowanie komórek i integralność tkanek. Chcemy zrozumieć, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie między komórkami i ich mikrośrodowiskiem wpływa na procesy patologiczne, takie jak powstawanie przerzutów. Badając dane dotyczące właściwości mechanicznych błony podstawnej płuc, odkryliśmy, że bardziej miękkie błony podstawne są bardziej odporne na inwazję komórek rakowych.Metoda przedstawiona w naszym protokole umożliwia kriosekcję i badanie mechaniczne nieutrwalonych próbek biologicznych, przy zachowaniu właściwości mechanicznych. Co więcej, pokazuje sposób na określenie modułu Younga wyłącznie błony podstawnej wewnątrz ściany pęcherzyka płucnego za pomocą mikroskopu sił atomowych pomiarów i procedur filtrowania opisanych w naszym protokole. Kolejnym krokiem jest dowiedzenie się więcej o dynamice sztywności błony podstawnej i jej roli w procesach rozwojowych i patologicznych, aby potencjalnie poprawić diagnostykę i wskazać opcje leczenia.Aby rozpocząć, usuń formę zawierającą zamrożoną optymalną temperaturę cięcia lub OCT, złożone tkanki płuc myszy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść dwustronną taśmę klejącą na środku szkiełka mikroskopowego z matową krawędzią. Przetocz 15-mililitrową probówkę wirówkową po taśmie, aby zapewnić mocne przyleganie bez pęcherzyków powietrza.Upewnij się, że długość taśmy odpowiada szerokości bloku OCT zawierającego próbkę. Oznacz slajdy ołówkiem, w tym informacje o próbce i numery sekcji. Włóż przygotowane preparaty mikroskopowe do pudełka na szkiełka.Umieść pudełko ze szkiełkami w komorze kriotomicznej, aby schłodzić szkiełka. Następnie napełnij dwa wewnętrzne pierścienie uchwytu próbki pożywką OCT. Umieścić próbkę w pożywce OCT na uchwycie próbki.Umieścić uchwyt próbki w komorze kriotomicznej na około 10 minut, aż podłoże OCT całkowicie zestali się, a próbka zostanie mocno zabezpieczona. Teraz zainstaluj uchwyt na próbkę na stoliku do cięcia kriotomu. Przymocuj kawałek jednostronnej taśmy klejącej do próbki, mocno dociskając chłodnym kciukiem.Wykonać 15-mikrometrowy wycinek tkanki za pomocą kriotomu. Użyj pędzla, aby skierować sekcję i zapobiec odklejaniu się taśmy klejącej podczas procedury cięcia. Użyj schłodzonego szkiełka mikroskopowego z dwustronną taśmą klejącą i mocno dociśnij go do sekcji, aby go podnieść.Umieść szkiełko przenoszące sekcję z powrotem w pudełku na slajdy. Aby skalibrować wspornik przy użyciu metody szumu termicznego, umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku próbki mikroskopu sił atomowych lub AFM. Umieść głowicę AFM na stoliku na próbkę.Następnie opuść głowicę AFM za pomocą silników krokowych, aż szczelina między uchwytem wspornika a szkiełkiem mikroskopu wyniesie około jednego do dwóch milimetrów. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki z długą igłą nałóż PBS na bok uchwytu wspornikowego, pozwalając mu spłynąć w dół i uformować płynną menisk w szczelinie. W oprogramowaniu sterującym AFM, aby przeprowadzić kalibrację kontaktową, przejdź do strony Acquire Data (Pobieranie danych) i wybierz opcję Advanced View (Widok zaawansowany).Uzyskaj dostęp do Menedżera kalibracji, klikając przycisk menu burgera znajdujący się w prawym górnym rogu. Następnie wybierz metodę opartą na kontakcie i wspornik MLCT-F z menu rozwijanego Nazwa jako nazwę wspornika. Wprowadź jeden wolt w polu Setpoint (Wartość zadana) i 10 w polu Number of scans (Liczba skanów).Na stronie Acquire Data (Pobieranie danych) wprowadź wartość zadaną jednego napięcia dla procedury automatycznego zbliżania się na panelu sterowania po lewej stronie. Kliknij niebieski przycisk strzałki skierowanej w dół w lewym górnym rogu interfejsu, aby zainicjować automatyczne podejście. Po zakończeniu podejścia i zetknięciu się wspornika ze szkiełkiem mikroskopu, kliknij przycisk Kalibruj w oknie Menedżer kalibracji, aby rozpocząć kalibrację.Po zakończeniu kalibracji zamknij okno Menedżera kalibracji i upewnij się, że we wstępnie wybranym katalogu został wygenerowany plik kalibracyjny zawierający określone wyniki kalibracji. Aby rozpocząć, wyjmij z zamrażarki szkiełko z próbką zawierającą pocięte tkanki płuc myszy. Umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku na próbki AFM.Kliknij przycisk z ikoną klucza w prawym górnym rogu interfejsu użytkownika, aby przejść do Menedżera ustawień. W sekcji Approach Settings (Ustawienia podejścia) ustaw Wysokość docelową na cztery mikrometry. Następnie w sekcji Bieżące ustawienia trybu w obszarze Zaawansowane ustawienia sprzężenia zwrotnego ustaw mnożnik na jeden.W podsekcji Force Settings (Ustawienia wymuszenia) w bieżących ustawieniach trybu wybierz opcję Retracted Piezo (Wycofany piezoelektryczny) z menu rozwijanego Mode at end (Tryb na końcu). W panelu sterowania po lewej stronie ustaw parametry krzywych wcięcia siły. W przypadku NanoWizard 4 XP i wspornika MLCT F wprowadź wartość zadaną na pięć nanoniutonów, długość Z na osiem mikrometrów i prędkość Z na 300 mikrometrów na sekundę.Następnie zdefiniuj położenie i rozmiar początkowej mapy sił przeglądu, aby objąć całą ścianę wyrostka zębodołowego, rozciągającą się z jednej strony powietrza na drugą. Ustaw liczbę pikseli na 50 na 50. Po zarejestrowaniu mapy przeglądowej uchwyć bardziej skoncentrowaną mapę sił o rozmiarze trzy na trzy mikrometry lub cztery na cztery mikrometry na błonie podstawnej, utrzymując liczbę pikseli na poziomie 50 na 50 krzywych.Aby przeanalizować krzywe wgłębienia siły, uruchom CANTER Processing Toolbox w MATLAB i otwórz aplikację Analiza krzywej siły. Następnie, aby załadować mapę sił w wysokiej rozdzielczości sekcji płuc, kliknij Wybierz plik, przejdź do lokalizacji zapisu, kliknij dwukrotnie plik i wybierz Załaduj dane. Gdy pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o wartości kalibracji dla wspornika, wprowadź wartości kalibracji w odpowiednich polach edycji.Kliknij przycisk Prześlij, aby kontynuować. Po wyświetleniu drugiego wyskakującego okienka kontynuuj procedurę wczytywania mapy obrazowania ilościowego lub QI, klikając przycisk Prześlij. Po zakończeniu procesu załadunku na ekranie wyświetlana jest początkowa krzywa sił z mapy sił.Ustaw głębokość dopasowania w odpowiednim polu edycyjnym na 1,5 mikrometra i wybierz za pomocą Hertz fit algorytm wyszukiwania kontaktów. Aby zastosować dopasowanie zmodyfikowanego modelu Hertza do wszystkich krzywych wcięć sił na mapie QI, kliknij przycisk Zachowaj zastosuj do wszystkich. Po zakończeniu ostatniej analizy krzywej siły pojawi się okno do zapisania plików.Kliknij przycisk Tak i wprowadź nazwę plików wynikowych. W celu filtrowania przestrzennego mapy QI z okna Wybór aplikacji w Narzędziu przetwarzania CANTER wybierz Narzędzie do filtrowania wyników i kliknij przycisk Uruchom aplikację. Aby załadować wyniki dopasowania, kliknij Otwórz na górnym pasku menu interfejsu użytkownika narzędzia do filtrowania wyników.W kolejnym wyskakującym okienku znajdź pierwszy przycisk Ustaw w zakładce Mapy JPK i wybierz plik tsv zawierający wyniki analizy krzywej sił. Następnie kliknij drugi przycisk Set i znajdź plik mapy QI odpowiadający wybranemu plikowi tsv. Następnie kliknij przycisk Prześlij, aby wczytać dane mapy i wyniki analizy krzywej siły.Z menu rozwijanego Wyświetlany kanał u góry wybierz opcję EModul, aby wyświetlić wyniki modułu Younga jako obraz mapy. Następnie z menu rozwijanego Kanał danych poniżej wykresu histogramu wybierz opcję EModul, aby zobrazować rozkład wartości modułu załadowanego Younga na mapie QI. Następnie kliknij przycisk strzałki przepływu manipulacji na środku interfejsu użytkownika, upewniając się, że jest skierowany w prawą stronę.Ustaw przełącznik Filtr obrazu w pozycji Włączone w panelu Filtr nad osiami histogramu. Z menu rozwijanego Geometria filtru wybierz opcję Odręczny, a następnie kliknij przycisk Dodaj. Na obrazie górnego kanału narysuj maskę filtra, okrążając membranę podstawną, przytrzymując lewy przycisk myszy.Następnie zwolnij przycisk myszy po zakończeniu i kliknij dwukrotnie maskę, aby zastosować ją do mapy. Aby zapisać nowy plik wynikowy tsv z zamaskowanymi wartościami modułu Younga, kliknij Zapisz, Zapisz histogram i Zapisz dane na górnym pasku menu. W wyświetlonym oknie podręcznym kliknij pozycję Zaznacz wszystko, aby wybrać wyniki do zapisania w pliku tsv.Następnie kliknij przycisk OK, aby potwierdzić wybór. W oknie dialogowym Zapisz wprowadź nazwę pliku tsv, wybierz żądaną lokalizację zapisywania i kliknij przycisk OK, aby zapisać przefiltrowane wyniki. Wartości modułu Younga błony podstawnej płuc wykazywały logarytmiczny rozkład normalny z wartością szczytową 9,31 i odchyleniem standardowym 0,18, co daje reprezentatywny moduł Younga wynoszący 11,05 kilopaskala.Wyniki te zostały następnie potwierdzone za pomocą wykresu kwantylowo-kwantylowego.

extracting-young-s-modulus-native-murine-pulmonary-basement-membranes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opisujemy metodę mapowania właściwości mechanicznych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Skupiamy się na tym, jak rejestrować zmiany mechaniczne, które zachodzą w ścianach komórkowych podczas rozwoju roślin w mezoskali szerokopolowej, umożliwiając skorelowanie tych zmian ze wzrostem i morfogenezą.

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Badania biomechaniki ściany komórkowej są niezbędne do zrozumienia wzrostu i morfogenezy roślin. Zaproponowano następujący protokół do zbadania cienkich pierwotnych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych organów roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

Przedstawiamy protokół do pomiaru modułów sprężystości obszarów bogatych w kolagen w prawidłowej i chorej wątrobie za pomocą mikroskopii sił atomowych. Jednoczesne zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej zapewnia wysoką precyzję przestrzenną do lokalizacji obszarów bogatych w kolagen w wycinkach wątroby.

Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Poznaj metodę pomiaru modułu Younga błony podstawnej płuc myszy przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Technika ta pozwala zachować właściwości mechaniczne próbek i badać rolę sztywności w inwazji komórek nowotworowych.

Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów