Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

W naszych badaniach badamy wpływ właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej na zachowanie komórek i integralność tkanek. Chcemy zrozumieć, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie między komórkami i ich mikrośrodowiskiem wpływa na procesy patologiczne, takie jak powstawanie przerzutów. Badając dane dotyczące właściwości mechanicznych błony podstawnej płuc, odkryliśmy, że bardziej miękkie błony podstawne są bardziej odporne na inwazję komórek rakowych.

Metoda przedstawiona w naszym protokole umożliwia kriosekcję i badanie mechaniczne nieutrwalonych próbek biologicznych, przy zachowaniu właściwości mechanicznych. Co więcej, pokazuje sposób na określenie modułu Younga wyłącznie błony podstawnej wewnątrz ściany pęcherzyka płucnego za pomocą mikroskopu sił atomowych pomiarów i procedur filtrowania opisanych w naszym protokole. Kolejnym krokiem jest dowiedzenie się więcej o dynamice sztywności błony podstawnej i jej roli w procesach rozwojowych i patologicznych, aby potencjalnie poprawić diagnostykę i wskazać opcje leczenia.

Aby rozpocząć, usuń formę zawierającą zamrożoną optymalną temperaturę cięcia lub OCT, złożone tkanki płuc myszy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść dwustronną taśmę klejącą na środku szkiełka mikroskopowego z matową krawędzią. Przetocz 15-mililitrową probówkę wirówkową po taśmie, aby zapewnić mocne przyleganie bez pęcherzyków powietrza.

Upewnij się, że długość taśmy odpowiada szerokości bloku OCT zawierającego próbkę. Oznacz slajdy ołówkiem, w tym informacje o próbce i numery sekcji. Włóż przygotowane preparaty mikroskopowe do pudełka na szkiełka.

Umieść pudełko ze szkiełkami w komorze kriotomicznej, aby schłodzić szkiełka. Następnie napełnij dwa wewnętrzne pierścienie uchwytu próbki pożywką OCT. Umieścić próbkę w pożywce OCT na uchwycie próbki.

Umieścić uchwyt próbki w komorze kriotomicznej na około 10 minut, aż podłoże OCT całkowicie zestali się, a próbka zostanie mocno zabezpieczona. Teraz zainstaluj uchwyt na próbkę na stoliku do cięcia kriotomu. Przymocuj kawałek jednostronnej taśmy klejącej do próbki, mocno dociskając chłodnym kciukiem.

Wykonać 15-mikrometrowy wycinek tkanki za pomocą kriotomu. Użyj pędzla, aby skierować sekcję i zapobiec odklejaniu się taśmy klejącej podczas procedury cięcia. Użyj schłodzonego szkiełka mikroskopowego z dwustronną taśmą klejącą i mocno dociśnij go do sekcji, aby go podnieść.

Umieść szkiełko przenoszące sekcję z powrotem w pudełku na slajdy. Aby skalibrować wspornik przy użyciu metody szumu termicznego, umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku próbki mikroskopu sił atomowych lub AFM. Umieść głowicę AFM na stoliku na próbkę.

Następnie opuść głowicę AFM za pomocą silników krokowych, aż szczelina między uchwytem wspornika a szkiełkiem mikroskopu wyniesie około jednego do dwóch milimetrów. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki z długą igłą nałóż PBS na bok uchwytu wspornikowego, pozwalając mu spłynąć w dół i uformować płynną menisk w szczelinie. W oprogramowaniu sterującym AFM, aby przeprowadzić kalibrację kontaktową, przejdź do strony Acquire Data (Pobieranie danych) i wybierz opcję Advanced View (Widok zaawansowany).

Uzyskaj dostęp do Menedżera kalibracji, klikając przycisk menu burgera znajdujący się w prawym górnym rogu. Następnie wybierz metodę opartą na kontakcie i wspornik MLCT-F z menu rozwijanego Nazwa jako nazwę wspornika. Wprowadź jeden wolt w polu Setpoint (Wartość zadana) i 10 w polu Number of scans (Liczba skanów).

Na stronie Acquire Data (Pobieranie danych) wprowadź wartość zadaną jednego napięcia dla procedury automatycznego zbliżania się na panelu sterowania po lewej stronie. Kliknij niebieski przycisk strzałki skierowanej w dół w lewym górnym rogu interfejsu, aby zainicjować automatyczne podejście. Po zakończeniu podejścia i zetknięciu się wspornika ze szkiełkiem mikroskopu, kliknij przycisk Kalibruj w oknie Menedżer kalibracji, aby rozpocząć kalibrację.

Po zakończeniu kalibracji zamknij okno Menedżera kalibracji i upewnij się, że we wstępnie wybranym katalogu został wygenerowany plik kalibracyjny zawierający określone wyniki kalibracji. Aby rozpocząć, wyjmij z zamrażarki szkiełko z próbką zawierającą pocięte tkanki płuc myszy. Umieść szkiełko mikroskopowe na stoliku na próbki AFM.

Kliknij przycisk z ikoną klucza w prawym górnym rogu interfejsu użytkownika, aby przejść do Menedżera ustawień. W sekcji Approach Settings (Ustawienia podejścia) ustaw Wysokość docelową na cztery mikrometry. Następnie w sekcji Bieżące ustawienia trybu w obszarze Zaawansowane ustawienia sprzężenia zwrotnego ustaw mnożnik na jeden.

W podsekcji Force Settings (Ustawienia wymuszenia) w bieżących ustawieniach trybu wybierz opcję Retracted Piezo (Wycofany piezoelektryczny) z menu rozwijanego Mode at end (Tryb na końcu). W panelu sterowania po lewej stronie ustaw parametry krzywych wcięcia siły. W przypadku NanoWizard 4 XP i wspornika MLCT F wprowadź wartość zadaną na pięć nanoniutonów, długość Z na osiem mikrometrów i prędkość Z na 300 mikrometrów na sekundę.

Następnie zdefiniuj położenie i rozmiar początkowej mapy sił przeglądu, aby objąć całą ścianę wyrostka zębodołowego, rozciągającą się z jednej strony powietrza na drugą. Ustaw liczbę pikseli na 50 na 50. Po zarejestrowaniu mapy przeglądowej uchwyć bardziej skoncentrowaną mapę sił o rozmiarze trzy na trzy mikrometry lub cztery na cztery mikrometry na błonie podstawnej, utrzymując liczbę pikseli na poziomie 50 na 50 krzywych.

Aby przeanalizować krzywe wgłębienia siły, uruchom CANTER Processing Toolbox w MATLAB i otwórz aplikację Analiza krzywej siły. Następnie, aby załadować mapę sił w wysokiej rozdzielczości sekcji płuc, kliknij Wybierz plik, przejdź do lokalizacji zapisu, kliknij dwukrotnie plik i wybierz Załaduj dane. Gdy pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o wartości kalibracji dla wspornika, wprowadź wartości kalibracji w odpowiednich polach edycji.

Kliknij przycisk Prześlij, aby kontynuować. Po wyświetleniu drugiego wyskakującego okienka kontynuuj procedurę wczytywania mapy obrazowania ilościowego lub QI, klikając przycisk Prześlij. Po zakończeniu procesu załadunku na ekranie wyświetlana jest początkowa krzywa sił z mapy sił.

Ustaw głębokość dopasowania w odpowiednim polu edycyjnym na 1,5 mikrometra i wybierz za pomocą Hertz fit algorytm wyszukiwania kontaktów. Aby zastosować dopasowanie zmodyfikowanego modelu Hertza do wszystkich krzywych wcięć sił na mapie QI, kliknij przycisk Zachowaj zastosuj do wszystkich. Po zakończeniu ostatniej analizy krzywej siły pojawi się okno do zapisania plików.

Kliknij przycisk Tak i wprowadź nazwę plików wynikowych. W celu filtrowania przestrzennego mapy QI z okna Wybór aplikacji w Narzędziu przetwarzania CANTER wybierz Narzędzie do filtrowania wyników i kliknij przycisk Uruchom aplikację. Aby załadować wyniki dopasowania, kliknij Otwórz na górnym pasku menu interfejsu użytkownika narzędzia do filtrowania wyników.

W kolejnym wyskakującym okienku znajdź pierwszy przycisk Ustaw w zakładce Mapy JPK i wybierz plik tsv zawierający wyniki analizy krzywej sił. Następnie kliknij drugi przycisk Set i znajdź plik mapy QI odpowiadający wybranemu plikowi tsv. Następnie kliknij przycisk Prześlij, aby wczytać dane mapy i wyniki analizy krzywej siły.

Z menu rozwijanego Wyświetlany kanał u góry wybierz opcję EModul, aby wyświetlić wyniki modułu Younga jako obraz mapy. Następnie z menu rozwijanego Kanał danych poniżej wykresu histogramu wybierz opcję EModul, aby zobrazować rozkład wartości modułu załadowanego Younga na mapie QI. Następnie kliknij przycisk strzałki przepływu manipulacji na środku interfejsu użytkownika, upewniając się, że jest skierowany w prawą stronę.

Ustaw przełącznik Filtr obrazu w pozycji Włączone w panelu Filtr nad osiami histogramu. Z menu rozwijanego Geometria filtru wybierz opcję Odręczny, a następnie kliknij przycisk Dodaj. Na obrazie górnego kanału narysuj maskę filtra, okrążając membranę podstawną, przytrzymując lewy przycisk myszy.

Następnie zwolnij przycisk myszy po zakończeniu i kliknij dwukrotnie maskę, aby zastosować ją do mapy. Aby zapisać nowy plik wynikowy tsv z zamaskowanymi wartościami modułu Younga, kliknij Zapisz, Zapisz histogram i Zapisz dane na górnym pasku menu. W wyświetlonym oknie podręcznym kliknij pozycję Zaznacz wszystko, aby wybrać wyniki do zapisania w pliku tsv.

Następnie kliknij przycisk OK, aby potwierdzić wybór. W oknie dialogowym Zapisz wprowadź nazwę pliku tsv, wybierz żądaną lokalizację zapisywania i kliknij przycisk OK, aby zapisać przefiltrowane wyniki. Wartości modułu Younga błony podstawnej płuc wykazywały logarytmiczny rozkład normalny z wartością szczytową 9,31 i odchyleniem standardowym 0,18, co daje reprezentatywny moduł Younga wynoszący 11,05 kilopaskala.

Wyniki te zostały następnie potwierdzone za pomocą wykresu kwantylowo-kwantylowego.