Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Tradycyjne metody hodowli dyfuzyjnej często nie są w stanie odtworzyć złożonego środowiska żywych narządów, co prowadzi do utraty markerów i funkcji specyficznych dla tkanek. Opracowaliśmy chip typu open-top, który łączy w sobie kulturę dyfuzyjną i zasadę mikroprzepływowości, aby dokładnie naśladować mikrośrodowisko tkanek nabłonkowych. Dzięki uwzględnieniu sygnałów biochemicznych i biomechanicznych, które są naturalnie obecne w żywych narządach, ale często są zaniedbywane w tradycyjnych modelach in vitro, chip z otwartym dachem stanowi lepszą alternatywę między systemami zamkniętymi.

Procedurę zademonstruje dziś Adya Panchal, studentka w moim laboratorium. Aby rozpocząć, umieść wymagane odczynniki pod szafką bezpieczeństwa biologicznego na lodzie. Hoduj tkankowo specyficzne komórki mezenchymalne w celu uzyskania 80% do 90% zbieżności, a następnie dysocjuj komórki za pomocą trypsyny lub innych metod zgodnie z zaleceniami producenta.

Granuluj komórki w 250 g przez pięć minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Zawiesić osad komórkowy w 225 mikrolitrach każdy lodowatego 10X EMEM i bufora rekonstrukcyjnego. Wymieszaj komórki przez pipetowanie i dodaj 1 800 mikrolitrów lodowatego roztworu kolagenu 1.

Następnie wymieszaj roztwór żelu z lodem, pipetując w górę i w dół pięć do sześciu razy. Zneutralizować roztwór żelu wstępnego za pomocą 18 mikrolitrów jednego normalnego wodorotlenku sodu, delikatnie wymieszać pipetując, a następnie pipetować 150 mikrolitrów hydrożelu wypełnionego komórkami do centralnej komory otwartego chipa, unikając pęcherzyków. Zgrupuj frytki na oddzielnych szalkach Petriego, w tym nakrętkę probówki wirówkowej wypełnioną dwoma mililitrami sterylnej, podwójnie destylowanej wody na każdej szalce Petriego, i inkubuj szalki Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby wykonać mikrowzór powierzchni hydrożelu zrębowego, należy odpipetować 20 mikrolitrów zneutralizowanego roztworu żelu wstępnego Collagen 1 na wzorzystą powierzchnię sterylnego stempla wydrukowanego w 3D i włożyć stempel do otwartej komory, podczas gdy hydrożel zrębu jest jeszcze w postaci płynnej. Usuń wszelkie pozostałości hydrożelu, które mogą z górnej części komory otwartej, za pomocą aspiratora. Zgrupuj wszystkie wiórki na oddzielnych szalkach Petriego ze stożkową nakrętką rurki wypełnioną wodą, jak pokazano wcześniej.

I inkubuj wszystkie szalki Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 90 minut. Pod koniec inkubacji umieść chipsy z powrotem pod szafką bezpieczeństwa biologicznego i delikatnie usuń stemple za pomocą precyzyjnej pęsety, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia hydrożelu. Gdy hodowane komórki osiągną konflufluację od 80% do 90%, należy oddzielić komórki za pomocą procedur enzymów proteolitycznych, zgodnie z zaleceniami dostawcy komórek.

Po dysocjacji osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki nabłonkowe do odpowiedniej gęstości fragmentów komórek, jak opisano w manuskrypcie. Aby wysiać komórkę nabłonkową, przenieś wióry z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i trzykrotnie przepłucz powierzchnię zrębu 100 mikrolitrami świeżej pożywki do hodowli komórek nabłonkowych, aby usunąć nadmiar roztworu powlekającego. Po zassaniu pożywki płuczącej należy wysiać powierzchnię hydrożelu 50 mikrolitrami zawiesiny komórek nabłonka przy użyciu odpowiedniej gęstości komórek, a następnie przenieść wióry z powrotem do inkubatora na dwie godziny.

Aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe, delikatnie przepłucz powierzchnię hydrożelu dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowych, odśwież pożywkę przez autoklawowanie w szczelnych pojemnikach autoklawowalnych i podłącz chipy do pompy perystaltycznej. Wstrzymaj pompę perystaltyczną, ostrożnie odłącz wióry od pompy i wyjmij nośnik obudowy wiórów. Po przeniesieniu wiórów z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego, należy usunąć pozostałą objętość pożywki do górnego zbiornika.

Następnie delikatnie zassaj całe medium z górnego kanału mikroprzepływowego i zaciśnij krótkie rurki mikroprzepływowe podłączone do górnych wlotów za pomocą zacisków do segregatorów, aby zmniejszyć parowanie mediów i utrzymanie granicy faz powietrze-ciecz lub ALI. Umieść otwarty chip na uchwycie obudowy z powrotem do inkubatora. Ponownie podłącz wióry do pompy perystaltycznej i wznów przepływ, uruchamiając pompę perystaltyczną.

Przepłukać komorę naczyniową pożywką do hodowli komórek śródbłonka, a następnie zasiać 25 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka. Odwróć chipy do góry nogami, aby komórki śródbłonka przyczepiły się do górnej powierzchni komory mikroprzepływowej. Ułóż frytki na szalkach Petriego.

Umieść je z powrotem w inkubatorze, jak pokazano wcześniej, i pozwól komórkom śródbłonka przyczepić się na godzinę. Pod koniec inkubacji przenieść wióry z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i dwukrotnie przepłukać kanał naczyniowy pożywką do hodowli komórek śródbłonka w celu usunięcia resztek komórkowych. Połóż wióry płasko, aby ułatwić przyleganie komórek śródbłonka do dolnej powierzchni kanału naczyniowego.

Napełnij zbiornik pożywki naczyniowej odgazowaną pożywką do hodowli komórek naczyniowych pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Umieść wióry z powrotem w uchwycie obudowy wiórów i ponownie podłącz je do zbiorników medium na jednym końcu i do pompy perystaltycznej z drugiej. Sprawdź połączenia mikroprzepływowe, aby upewnić się, że wszystkie wióry są prawidłowo podłączone i czy nie ma widocznych kropelek kapiącego medium.

Następnie wznów przepływ płynu, uruchamiając pompę perystaltyczną. Wizualizowana jest mikrowzorzysta powierzchnia żelu z komórkami i bez. Analiza histologiczna wykazała dojrzały, wielowarstwowy naskórek zróżnicowany na chipie.

Zdjęcie chipa skóry w widoku z góry wykazało obecność fibroblastów wewnątrz warstwy skórnej. PECAM-1, VE-kadheryna i von Willebrand wykazały różnicowanie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego hodowanych wspólnie w otwartym chipie skóry. MUC5AC, tubulina alfa i beta, białko chlorokomórkowe 16, p63 i barwienie fluorescencyjne ZO-1 wykazały dojrzały nabłonek dróg oddechowych.

Bijące rzęski i zróżnicowany dojrzały pseudowarstwowy nabłonek obserwowano na otwartym chipie dróg oddechowych. Barwienie fluorescencyjne typu I, typu II i E-kadheryny wykazało obecność dojrzałych pneumocytów na chipie. Mikroskopia elektronowa ujawniła obecność mikrokosmków i pęcherzyków lizosomalnych, które świadczą o dojrzałym fenotypie pęcherzyków płucnych.

Analiza histologiczna wykazała obecność płaskich komórek płaskonabłonkowych zgodnych z fenotypem typu I oraz prostopadłościennych komórek przypominających kostkę brukową spójnych z fenotypem typu II oraz fibroblastów wewnątrz warstwy skórnej. Obecność enterocytów i dojrzałego kielicha potwierdzono barwieniem mucyną 2 i E-kadheryną. Fibroblasty wewnątrz warstwy skórnej potwierdziły obecność prostego nabłonka walcowatego.

Wszystkie odczynniki muszą być zimne, a powierzchnie żelu należy odpowiednio spłukać, aby uzyskać równą powierzchnię. Ważne jest, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki i zanieczyszczenia, aby uzyskać równomierną adhezję komórek i zwartą, brudną monowarstwę i ścianę naczyniową. Podobne podejście można zastosować do generowania innych typów modeli narządów nabłonkowych, takich jak jelito i płuca, w celu oceny, w jaki sposób określone leki lub czynniki środowiskowe mogą wpływać na homeostazę tkanek ludzkich, ze szczególnym uwzględnieniem funkcji bariery nabłonkowej i naczyniowej.

Dzięki łatwemu dostępowi do fazy skuteczności przedziału zrębu, badania mogą teraz generować określone wzory twarzy i odtwarzać funkcjonalną architekturę tkanki, taką jak krypviveoli, co jest trudne do osiągnięcia za pomocą innych urządzeń.