Name: Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę odtwarzania cytoarchitektury tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym. Technika ta umożliwia badanie interfejsów nabłonkowo-mezenchymalnych i naczyniowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+animal+studies+for+predicting+toxicity+in+clinical+trials%3A+Is+it+time+to+rethink+our+current+approach%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).</li>
<li>Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+the+principles+of+the+3Rs+of+animal+testing+at+CDER%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953(2021).</li>
<li>Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models%3A+New+opportunities+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li>
<li>Alépée, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+of+3D+cultures+%28organs-on-a-chip%29+in+safety+testing+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology.</a> Altex. 31 (4), 441-477 (2014).</li>
<li>MacArron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li>
<li>Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+based+in+vitro+test+systems+for+anticancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322(2020).</li>
<li>Mao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+type+II+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial type II cells in primary culture.</a> Physiological Reports. 3 (2), 12288(2015).</li>
<li>Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+significantly+alters+gene+expression+profiles+and+reduces+differences+between+myometrial+and+fibroid+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells.</a> Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).</li>
<li>Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+tissue+stiffness+and+bioadhesivity%3A+Advanced+biomaterials+to+model+tumor+microenvironments+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).</li>
<li>Nawroth, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+Lung-on-Chips%3A+The+best+of+both+worlds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2d+to+3d+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-component+radiation+survival+curve+using+an+in+vitro+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model.</a> International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).</li>
<li>Chandra, P., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+extracellular+microenvironment+for+modulating+stem+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Insights%22%5BJournal%5D)">Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors.</a> Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).</li>
<li>Nicolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+extracellular+matrix+mimics%3A+Fundamental+concepts+and+role+of+materials+chemistry+to+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate.</a> Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).</li>
<li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li>
<li>Mantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+hydrogels+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Materials. 12 (20), 3323(2019).</li>
<li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+cues+as+master+regulators+of+hematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).</li>
<li>Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+chips+and+microphysiological+systems+for+disease+modeling+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing.</a> Micromachines. 12 (2), 139(2021).</li>
<li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+A+new+paradigm+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li>
<li>Varone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organ-chip+system+emulates+three-dimensional+architecture+of+the+human+epithelia+and+the+mechanical+forces+acting+on+it%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it.</a> Biomaterials. 275, 120957(2021).</li>
<li>Hassell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organ+chip+models+recapitulate+orthotopic+lung+cancer+growth%2C+therapeutic+responses%2C+and+tumor+dormancy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro.</a> Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).</li>
<li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biobanking%22%5BJournal%5D)">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking. 1897, 253-268 (2019).</li>
<li>Grant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+drug+concentrations+in+PDMS+microfluidic+organ+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).</li>
<li>Barrile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+recapitulates+thrombosis+Induced+by+an+anti-CD154+monoclonal+antibody%3A+Translational+potential+of+advanced+microengineered+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+lung+alveolus-on-a-chip+model+of+intravascular+thrombosis+for+assessment+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
<li>Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+polydimethylsiloxane%3A+Alternative+materials+for+fabrication+of+organ-on-a-chip+devices+and+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).</li>
<li>Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+physiology+on-chip%3A+Historical+perspectives+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions.</a> Micromachines. 12 (10), 1250(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują następujące interesy finansowe/osobiste powiązania, które można uznać za potencjalnie konkurencyjne interesy: Varone Antonio jest byłym pracownikiem Emulate Inc. i może posiadać udziały w Emulate.

Open-Top Chip stanowi platformę umożliwiającą badanie złożonych interakcji komórkowych zachodzących między śródbłonkiem, zrębem i nabłonkiem w kontrolowanym mikrośrodowisku, w czasie rzeczywistym. Technologia ta oferuje kluczowe korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami organotypowymi i organoidowymi, takie jak integracja fizycznych i biochemicznych wskazówek, które są istotne dla odtworzenia mikrośrodowiska tkanek ludzkich, w tym płynne ścinanie (przepływ), cykliczne rozciąganie i rekonstrukcja topografii powie...

Historycznie rzecz biorąc, naukowcy polegali na przedklinicznych testach na zwierzętach w celu odkrywania leków, ale coraz więcej tych metod było kwestionowanych z powodu słabej korelacji z ludzkimi wynikami1. Wdrożenie zasad "3R" w celu zastąpienia, zmniejszenia i udoskonalenia eksperymentów na zwierzętach zachęca naukowców do znalezienia nowych alternatywnych metod in vitro w celu wsparcia przedklinicznej oceny ryzyka toksykologii leków i chemicznych2. Jednak wielu opracowanym do tej pory modelom in vitro brakuje architektury biologicznej, złożoności komórkowej i środowiska mechanicznego niezbędnego do podsumowania dynamicznej natury ludzkich żywych organów3,4.
Konwencjonalne systemy przedkliniczne in vitro zazwyczaj wykorzystują monokultury 2D komórek ludzkich hodowanych na sztywnej powierzchni z tworzywa sztucznego. Metody te stanowią narzędzie do prowadzenia prostych badań mechanistycznych i umożliwiają szybkie badania przesiewowe kandydatów na leki. Ze względu na ich stosunkowo niski koszt i wysoką wytrzymałość, modele 2D są często łączone z automatycznymi systemami o wysokiej przepustowości i wykorzystywane do szybkiej identyfikacji potencjalnych kandydatów na leki na wczesnym etapie procesu opracowywania leku5,6. Jednak takie modele 2D nie zapewniają translacyjnego podejścia do modelowania odpowiedzi na poziomie tkanki, narządów lub ogólnoustrojowych na kandydatów terapeutycznych, co jest potrzebne do dokładnego przewidywania bezpieczeństwa i skuteczności leków na etapie przedklinicznym ich opracowywania. Płaskie hodowle komórkowe nie podsumowują natywnego mikrośrodowiska tkankowego, w tym złożonej interakcji wielokomórkowej, właściwości biomechanicznych i trójwymiarowej (3D) architektury tkanek ludzkich7. Komórki rosnące na płaskiej powierzchni często nie osiągają dojrzałego fenotypu, a zatem nie mogą reagować na bodźce farmakologiczne, tak jak w tkance natywnej. Na przykład pierwotne ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych hodowane in vitro wykazują fenotyp płaskonabłonkowy i tracą kluczowe markery fenotypowe, w tym białka powierzchniowo czynne C i B (SP-C i SP-B)8. Oprócz niewystarczającego różnicowania, komórki pierwotne często stają się niewrażliwe na stresory biologiczne in vitro, ponieważ pewne szlaki biochemiczne związane z zapaleniem tkanek stają się niefunkcjonalne9. Taka utrata funkcji komórek wydaje się być przede wszystkim związana ze stosowaniem sztywnych substratów, a także z brakiem rozpuszczalnych czynników naturalnie uwalnianych przez tkankowo specyficzne komórki zrębu, takie jak fibroblasty płuc i komórki mięśni gładkich10,11.
Zrozumienie, że brak chemiczno-fizycznej i biologicznej złożoności ogranicza fizjologiczne zachowanie komórek in vitro, przyczyniło się do rozwoju bardziej wyrafinowanych modeli wielokomórkowych, które okazały się lepiej uchwycić złożoność ludzkich tkanek poza ciałem12,13. Od czasu stworzenia pierwszych modeli kokultur na początku lat siedemdziesiątych XX wieku14, wprowadzenie syntetycznych i naturalnych hydrożeli znacznie poprawiło zdolność do naśladowania natywnych mikrośrodowisk tkanek i stało się nieocenionym narzędziem do stymulowania różnicowania komórek, kierowania samoorganizacją komórek w struktury podobne do tkanek i przywracania natywnych funkcji tkanek15,16. Na przykład, gdy są hodowane na odpowiednim rusztowaniu 3D, ludzkie komórki mogą samoorganizować się w funkcjonalne struktury, takie jak sferoidy lub organoidy, wyrażając markery komórek macierzystych i są zdolne do samoodnawiania się17. W przeciwieństwie do tego, ludzkie komórki (w tym komórki macierzyste), gdy są hodowane na tradycyjnych podłożach 2D, szybko starzeją się i ulegają starzeniu po kilku przejściach18. Ponadto hydrożele mogą być "dostosowane" do określonych właściwości tkanki, takich jak porowatość, wielkość porów, grubość włókien, lepkosprężystość, topografia i sztywność, lub dalej modyfikowane przy użyciu składników komórkowych pochodzenia tkankowego i/lub bioaktywnych cząsteczek umożliwiających emulację stanów fizjologicznych lub patologicznych19,20. Pomimo ich ogromnego potencjału do testowania leków, modele 3D oparte na hydrożelu stosowane w badaniach farmaceutycznych nie oddają w pełni złożonej cytoarchitektury tkanek in vivo i brakuje im ważnych bodźców hemodynamicznych i mechanicznych normalnie obecnych w ludzkim ciele, w tym ciśnienia hydrostatycznego, cyklicznego rozciągania i ścinania płynów21.
Systemy mikrofizjologiczne (MPS), takie jak narządy na chipach (OOC), pojawiły się ostatnio jako narzędzia zdolne do rejestrowania złożonych reakcji fizjologicznych in vitro22,23. Modele te często wykorzystują platformy mikroprzepływowe, które umożliwiają modelowanie dynamicznego mikrośrodowiska żywych narządów.
Połączyliśmy zasady bioinżynierii tkankowej 3D i mechanobiologii, aby stworzyć model Open-Top Chip złożonej ludzkiej tkanki nabłonkowej. Pozwoliło nam to na dokładne odtworzenie wielokomórkowego i dynamicznego mikrośrodowiska tkanek nabłonkowych. Obejmuje to specyficzne dla tkanek sygnały biochemiczne i biomechaniczne naturalnie występujące w żywych organach, ale często zaniedbywane przez tradycyjne modele in vitro24. Open-Top Chip składa się z dwóch przedziałów: komory naczyniowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i komora zrębowa (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) oddzielone porowatą membraną, co pozwala na dyfuzję składników odżywczych między dwiema komorami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Przedział naczyniowy jest narażony na ciągły przepływ płynu w celu podsumowania fizjologicznego naprężenia ścinającego, a rozciągliwa konstrukcja komory zrębu pozwala na modelowanie obciążenia mechanicznego związanego z ruchami oddechowymi lub perystaltyką jelit. W komorze zrębu znajduje się przestrajalne rusztowanie hydrożelowe 3D zaprojektowane w celu wspierania fizjologicznego wzrostu fibroblastów specyficznych dla tkanki. Posiada zdejmowaną pokrywę, która ułatwia ustanowienie granicy faz powietrze-ciecz, warunek, który umożliwia lepsze naśladowanie ludzkiej fizjologii tkanek błony śluzowej, a także bezpośredni dostęp do tkanki w celu podawania leków bezpośrednio na warstwę nabłonkową. Rysunek uzupełniający 1 przedstawia niektóre z kluczowych elementów konstrukcji chipa Open-Top, w tym wymiary i przedziały biologiczne (rysunek uzupełniający 1A-D), a także główne kroki techniczne opisane w tym protokole (rysunek uzupełniający 1E).
Perfuzja układu Open-Top jest osiągana za pomocą programowalnej pompy perystaltycznej (Rysunek 1D). Konfiguracja pompy perystaltycznej pozwala na jednoczesne perfuzję 12 chipów Open-Top. W większości inkubatorów można umieścić dwie konfiguracje, które umożliwiają hodowlę do 24 chipów na inkubator. Rozciąganie mechaniczne odbywa się za pomocą specjalnie zaprojektowanego programowalnego regulatora ciśnienia podciśnienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Składa się z elektropneumatycznego regulatora podciśnienia sterowanego elektronicznie przez przetwornik cyfrowo-analogowy. Innymi słowy, elektropneumatyczny regulator podciśnienia generuje sinusoidalny profil podciśnienia o amplitudzie i częstotliwości określanej przez użytkownika. Odkształcenie cykliczne w zakresie od 0% do 15% jest generowane przez przyłożenie podciśnienia do kanału próżniowego układu Open-Top Chip o amplitudzie w zakresie od 0 do -90 kPa i częstotliwości 0,2 Hz. Jest to system wykonany na zamówienie, równoważny dostępnemu na rynku Flexcell Strain Unit, który został wcześniej przyjęty i opisany w innych artykułach25. Aby naśladować mechaniczne odkształcenie tkanki związane na przykład z ruchem oddechowym płuc lub perystaltyką jelita, siłownik pneumatyczny stosuje sinusoidalne fale próżniowe/odkształceniowe, których wielkość i amplitudę można dostosować do fizjologicznego poziomu naprężenia i częstotliwości, jakich ludzkie komórki doświadczają w swojej rodzimej tkance.
Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną metodę inżynierii i hodowli odpowiedników nabłonka organotypowego na prototypowej platformie Open-Top Chip. Umożliwia generowanie złożonych modeli narządów, takich jak skóra, pęcherzyki zębodołowe, drogi oddechowe i okrężnica, przy jednoczesnej integracji przepływu płynu naczyniowego i mechanicznego rozciągania. Przedstawimy kluczowe aspekty techniczne, które muszą być brane pod uwagę przy wdrażaniu zasad inżynierii tkankowej do generowania złożonych modeli nabłonkowych. Omówimy zalety i możliwe ograniczenia obecnego projektu.
Przegląd głównych etapów stosowanych do osiągnięcia dojrzałości tkanek i narządów, w tym parametrów przepływu i rozciągania, jest podany w: Rysunek 2 dla skóry, Rysunek 3 dla pęcherzyka płucnego, Rysunek 4 dla dróg oddechowych, oraz Rysunek 5 dla jelita. Dodatkowe informacje dotyczące składu pożywek i odczynników stosowanych do hodowli różnych modeli narządów znajdują się w tabelach uzupełniających (tabela uzupełniająca 1 dla skóry; Tabela uzupełniająca 2 dla zębodołu; Tabela uzupełniająca 3 dla dróg oddechowych i tabela uzupełniająca 4 dla jelita).

<table><tbody><tr><td>10x EMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-684F</td><td>Średni; Stroma</td></tr><tr><td>18 Gauge igła</td><td>MicroGroup</td><td>316H18RW</td><td>Rurka ze stali nierdzewnej 316 spawana, 18RW Full Hard&nbsp;</td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 19</td><td>MicroGroup</td><td>316H19RW</td><td>Rurka ze stali nierdzewnej 316 spawana, 19RW Full Hard</td></tr><tr><td>2-Stop PharMed BPT&nbsp;</td><td>Cole-Palmer&nbsp;</td><td>EW-95723-12</td><td>Tubka, 0,25 mm, 12/opakowanie</td></tr><tr><td>70% etanolu i chusteczki&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Do sterylizacji powierzchni&nbsp;</td></tr><tr><td>8-bromoadenozyna 3&,5&prime;-cykliczna sól sodowa monofosforanu (8-Br-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td>Średni suplement&nbsp;</td></tr><tr><td>A-83-01&nbsp;</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A9795</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Komórki nabłonka dróg oddechowych Technologia</td><td>komórek Lifeline</td><td>FC-0016</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Komórki pęcherzyków płucnych</td><td>Cell Biologics</td><td>H6621</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ABCA3&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB24751&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne [3C9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-Akwaporyna5 Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB215225&nbsp; &nbsp;</td><td>Przeciwciało monoklonalne królika [EPR3747]&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-akwaporyna5&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB92320&nbsp;</td><td>Przeciwciało monoklonalne królika [EPR3747]&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubulina anty-beta IV&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB11315&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne [ONS.1A6]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CD31 (PECAM-1)&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB9498&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne [JC/70A]&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CK5&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB75869&nbsp;</td><td>Rekombinowany monoklonalny preparat królików [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-cytokeratyna 10&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>MA5-13705&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (DE-K10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-cytokeratyna 14&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB7800&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-E-Kadheryna&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB1416&nbsp; &nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-Filaggrin&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>PA5-79267&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-HTI-56&nbsp;</td><td>Taras Biotech&nbsp;</td><td>TB-29AHT1-56&nbsp; &nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-HTII-280&nbsp;</td><td>Taras Biotech&nbsp;</td><td>TB-27AHT2-280&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (IgM)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-inwolucyna&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>MA5-11803&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (SY5)&nbsp;</td></tr><tr><td>Antyizoformy TA p63-&alpha;, -&beta;, -&gamma; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolengend&nbsp;</td><td>618902&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-Ki67&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB8191&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne [B126.1]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-LAMP3&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB111090&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciw dojrzewaniu SP-B&nbsp;</td><td>Siedem Wzgórza&nbsp;</td><td>WRAB-48604&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-MUC5AC&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>PA5-34612&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-Mucyna-2&nbsp;</td><td>SantaCruz Biotechnology</td><td>sc-7314</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne (IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-p63&nbsp; &nbsp;</td><td>Dako&nbsp;</td><td>GA662&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne p63 Białko (Dako Omnis)&nbsp; Klon DAK-p63&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-PCNA&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>PA5-32541&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-podoplanina (AT-1&alpha;)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB128994&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Pro+ Dojrzały Białko Surfaktantu B&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB40876&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-Surfaktant C&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Siedem Wzgórza&nbsp; &nbsp;</td><td>WRAB-9337&nbsp; &nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-Uteroglobina/SCGB1A1&nbsp;</td><td>Hycult Biotech&nbsp;</td><td>HM2178&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-VE-kadheryna&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB33168&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-ZO-1&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>33-9100&nbsp;</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne [1A12]&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Pipety zasysające&nbsp;</td><td>Corning / Sokół&nbsp;</td><td>357558&nbsp;</td><td>2 ml, polistyren, pakowany pojedynczo&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki zasysające&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Sterylne (autoklawowane)&nbsp;</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA (10X) w roztworze PBS&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>37525&nbsp;</td><td>Środek blokujący&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>Zaawansowany Biomatrix</td><td>5133</td><td>10 mg/ml (Stroma)</td></tr><tr><td>Kolagen I&nbsp;</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td>3 mg/ml (naczyniowy ECM)</td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; C5533</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen-IV</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C5533-5MG&nbsp;</td><td>Kolagen z łożyska ludzkiego, 5 mg proszek, rozpuszcza się do 1 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibroblasty jelita grubego&nbsp;</td><td>Biologia komórkowa</td><td>&nbsp; H6231</td><td></td></tr><tr><td>Komórki śródbłonka mikronaczyniowego okrężnicy</td><td>&nbsp; Biologia komórkowa</td><td>H6203&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rury stożkowe&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>15 ml i 50 ml&nbsp; polipropylen, sterylny&nbsp;</td></tr><tr><td>Środek sieciujący (ER-1)&nbsp;</td><td>Naśladować&nbsp;</td><td>10461</td><td>5 mg proszek&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, mleczan)&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>D3571&nbsp;</td><td>Sonda DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibroblasty skórne</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-010</td><td></td></tr><tr><td>Komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry</td><td></td><td>ATCC CRL-3243</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12&nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td></td><td></td>11320082</tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>Numer katalogowy 10565-018&nbsp;</td><td>Pożywka podstawowa dla pożywki ALI&nbsp;</td></tr><tr><td>Osioł Przeciw Myszom IgG H& L (Alexa Fluor 488)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150105&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Osioł Przeciw Myszom IgG H& L (Alexa Fluor 568)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB175472&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła&nbsp;</td></tr><tr><td>Osioł Przeciw Myszom IgG H& L (Alexa Fluor 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150107&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła&nbsp;</td></tr><tr><td>Osioł Anty-Królik IgG H& L (Alexa Fluor 488)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>&nbsp; AB150073&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła&nbsp;</td></tr><tr><td>Osioł Anty-Królik IgG H& L (Alexa Fluor 568)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB175470&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła&nbsp;</td></tr><tr><td>Osioł Anty-Królik IgG H& L (Alexa Fluor 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150075&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (bez Ca2+, Mg2+)&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV&nbsp;</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) ludzki, rekombinowany w E. coli</td><td>PromoCell</td><td>C-60170</td><td>Średni suplement&nbsp;</td></tr><tr><td>F-12 Szynka" s</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21700-108</td><td>Do naczyniowego</td></tr><tr><td>ECM FibriCol&nbsp;</td><td>Zaawansowana BioMatrix&nbsp;</td><td>5133-20ML&nbsp;</td><td>Roztwór kolagenu I (10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna, Ludzka, Naturalna,&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Numer telefonu 47743-654&nbsp;</td><td>Fibronektyna w osoczu ludzkim&nbsp;</td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta z cienką końcówką&nbsp;</td><td>Aven</td><td>18056Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>Technik Style 5B-SA Precyzyjna pęseta ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21700-108</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>Koza Anty-Mysia IgG H& L (Alexa Fluor 594)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150080&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne Goat Anti-Mysi&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kozia Anty-Mysia IgG H& L (Alexa Fluor 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB150115&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne Goat Anti-Mysi&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kozia Anty-Mysia IgG H& L (FITC)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB6785&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne Goat Anti-Mysi&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kozia Anty-Mysia IgG1 Alexa Fluor 568&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>A-21124&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne kozie anty-mysie IgG1&nbsp;</td></tr><tr><td>Kozia IgM Przeciw Myszom Alexa Fluor 488&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>A-21042&nbsp;</td><td>Przeciwciało wtórne kozie anty-mysie IgM&nbsp;</td></tr><tr><td>Ręczny aspirator próżniowy&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4930&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie Hyklon FetalSerum klonu II (FCS)&nbsp;</td><td>Hemocytometr GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Human [Leu15] - Gastrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Kolonoidy ludzkie</td><td>Uzyskiwane z resekcji</td><td></td> klinicznych <td>Uzyskiwane z resekcji klinicznych</td></tr><tr><td>Białko rekombinowane Ludzkie EGF&nbsp;</td><td>Termo</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>czynnik wzrostu ludzkiego nabłonka&nbsp;</td><td>Termo&nbsp;</td><td></td><td></td>PHG0311</tr><tr><td>HyClone FetalKlon II Serum (USA) &nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30066.02CZEŚĆ&nbsp; &nbsp;</td><td>Sterylne FBS&nbsp; Inaktywowane termicznie&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól sodowa 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu</td><td>Sigma</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon&nbsp;</td><td>Komórka promocyjna&nbsp; &nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>Średni suplement&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Wiaderko na lód&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Ismatec IPC-N&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-78000-41</td><td>Cyfrowa pompa perystaltyczna o niskiej prędkości; q24-kanałowy (1 na 12 chipów)</td></tr><tr><td>ITES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-839Z</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu keratynocytów (KGF), znany również jako podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów 7 (FGF-7), ludzki, rekombinowany w HEK</td><td>PromoCell</td><td>C-63821</td><td></td></tr><tr><td>Keratynocyty</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>Laminina&nbsp;</td><td>Biolamina</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, 521 KTG (CT521)&nbsp;</td><td>Biolamina&nbsp; &nbsp;</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td>ludzka rekombinowana laminina 521&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Lung Fibroblast</td><td>Cell Biologics</td><td>H6013</td><td></td></tr><tr><td>Technologia komórek linii życia fibroblastów płuc</td><td></td><td>FC-0049</td><td></td></tr><tr><td>Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>Komórki mięśni gładkich płuc</td><td>Technologia komórek Lifeline</td><td>FC-0046</td><td></td></tr><tr><td>Licznik ręczny&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Rurki przesyłowe Masterflex (TPE)&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>FV-96880-02</td><td>PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD</td></tr><tr><td>Medium 199, bez czerwieni fenolowej</td><td>Termo&nbsp;</td><td></td><td></td>11043023</tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp; &nbsp;</td><td>1,5 mL, sterylne&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop (z kamerą)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Do obrazowania w jasnym polu&nbsp;</td></tr><tr><td>N2</td><td>Sigma</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>A5099</td><td></td></tr><tr><td>Noggin (pożywka kondycjonowana HEK293T)</td><td>Sigma</td><td>N17001</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>50062Z&nbsp;</td><td>Rozwiązanie blokujące&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>O-fosfosryloetanoloamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (4% wag./obj.)&nbsp; &nbsp;</td><td>EMS&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 15710&nbsp;</td><td>Środek utrwalający&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>10 000 j./ml; 10 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>P20, P200 oraz P1000&nbsp; sterylna pipeta o niskiej przyczepności</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>&nbsp; F167380&nbsp;</td><td>P20, P200 oraz P1000&nbsp;</td></tr><tr><td>Wymiana surowicy PluriQ (lub alternatywnie wymiana surowicy KO)</td>Szkiełka mikroskopowe <td>AMSBIO (lub Thermo)</td><td>N/A (lub C1910828010)</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lizyna powlekana&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0425&nbsp;</td><td>Szkiełka szklane&nbsp;</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>P36931&nbsp;</td><td>Mocowanie zapobiegające blaknięciu z DAPI&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas retinowy&nbsp;</td><td>Inhibitor Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ROCK (Y27632)</td><td>Tocris</td><td>TB1254-GMP/10</td><td></td></tr><tr><td>R-spondyna (pożywka kondycjonowana HEK293T)</td><td>Suplementy Sigma</td><td>SCC111</td><td></td></tr><tr><td>SAGM SingleQuots&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4124</td><td></td></tr><tr><td>SAGMTM Pożywka do wzrostu komórek nabłonka małych dróg oddechowych BulletKitTM&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td>Średnie suplementy&nbsp;</td></tr><tr><td>SB2001190&nbsp;</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>1264/10</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>2 ml, 5 ml, 10 ml i 25 ml o niskiej zawartości endotoksyny, sterylne&nbsp;</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek nabłonka małych dróg oddechowych (SAGM)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bufor rozpuszczalnikowy (ER-2)&nbsp;</td><td>Naśladować&nbsp;</td><td>10462</td><td>Butelka 25 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriflip-HV&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Sterylna stożkowa rurka filtrująca</td></tr><tr><td>Sterilin 100 mm Kwadratowe szalki Petriego</td><td>Thermo</td><td>103</td><td>Sterylne, 1 na 6 chipsów&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolby T25&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Kolby T75&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Tri-jodotyronina</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (0,3% (vol/vol)&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8787&nbsp;</td><td>Środek permeabilizacyjny&nbsp;</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>93595&nbsp;</td><td>0,4% roztwór&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiązanie TrypEE&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>12604013&nbsp;</td><td>Rozwiązanie do odłączania komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN-20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P2287&nbsp;</td><td>Środek permeabilizacyjny&nbsp;</td></tr><tr><td>Piekarnik ze światłem UV (szczytowa częstotliwość 365 nm, intensywność 100 &mikro; J/cm2)</td><td>VWR</td><td>21474-598</td><td>UVP, dalekiego zasięgu UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L</td></tr><tr><td>Konfiguracja próżni&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Ciśnienie minimalne: -70 kPa</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego 165 (VEGF-165) ludzki, rekombinowany w E. coli</td><td>PromoCell</td><td>C-64420</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-165&nbsp; &nbsp;</td><td>Komórka promocyjna&nbsp; &nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>Średni suplement&nbsp;</td></tr><tr><td>Czynnik von Willebranda sprzężony FITC&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>AB8822&nbsp;</td><td>Przeciwciało poliklonalne owiec&nbsp;</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna (lub koraliki)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Ustaw na 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Wnt3A (medium kondycjonowane L-Wnt3A)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr></tbody></table>

odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Prawie wszystkie ludzkie organy są pokryte tkankami nabłonkowymi, składającymi się z jednej lub wielu warstw ściśle połączonych komórek zorganizowanych w trójwymiarowe (3D) struktury. Jedną z głównych funkcji nabłonka jest tworzenie barier, które chronią tkanki podszycia przed fizycznymi i chemicznymi urazami oraz czynnikami zakaźnymi. Ponadto nabłonek pośredniczy w transporcie składników odżywczych, hormonów i innych cząsteczek sygnałowych, często tworząc gradienty biochemiczne, które kierują pozycjonowaniem komórek i podziałem na przedziały w narządzie. Ze względu na ich kluczową rolę w określaniu struktury i funkcji narządów, nabłonki są ważnymi celami terapeutycznymi dla wielu chorób ludzkich, które nie zawsze są wychwytywane przez modele zwierzęce. Oprócz oczywistych różnic między gatunkami, prowadzenie badań naukowych nad funkcją bariery i właściwościami transportowymi nabłonka u zwierząt jest dodatkowo utrudnione przez trudności w dostępie do tych tkanek w żywym systemie. Chociaż dwuwymiarowe (2D) hodowle komórek ludzkich są przydatne do udzielania odpowiedzi na podstawowe pytania naukowe, często dają słabe prognozy in vivo. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w ciągu ostatniej dekady pojawiło się mnóstwo mikroinżynieryjnych platform biomimetycznych, znanych jako narządy na chipie, które stanowią obiecującą alternatywę dla tradycyjnych testów in vitro i testów na zwierzętach. W tym miejscu opisujemy Open-Top Organ-Chip (lub Open-Top Chip), platformę przeznaczoną do modelowania tkanek nabłonkowych specyficznych dla narządów, w tym skóry, płuc i jelit. Chip ten oferuje nowe możliwości odtworzenia wielokomórkowej architektury i funkcji tkanek nabłonkowych, w tym możliwość odtworzenia komponentu zrębu 3D poprzez włączenie specyficznych tkankowo fibroblastów i komórek śródbłonka do systemu aktywnego mechanicznie. Ten otwarty chip zapewnia bezprecedensowe narzędzie do badania interakcji nabłonkowych/mezenchymalnych i naczyniowych w wielu skalach rozdzielczości, od pojedynczych komórek po wielowarstwowe konstrukty tkankowe, umożliwiając w ten sposób molekularną analizę przesłuchów międzykomórkowych nabłonkowych narządów w zdrowiu i chorobie.

Mikrowzory powierzchniowe 
Mikrowzorce macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) można wykorzystać do odtworzenia konfiguracji przestrzennej interfejsu krypty jelitowej. Konfiguracja Open-Top Chip może być modyfikowana w celu zintegrowania mikrowzorzystych stempli specjalnie zaprojektowanych do naśladowania naturalnej topografii interfejsu nabłonka-zrębu okrężnicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A, B) i krypt jelitowych w skali mikrometra (<silna klasa="xfig"> Rysunek 6C-E<stro...

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

Tradycyjne metody hodowli dyfuzyjnej często nie są w stanie odtworzyć złożonego środowiska żywych narządów, co prowadzi do utraty markerów i funkcji specyficznych dla tkanek. Opracowaliśmy chip typu open-top, który łączy w sobie kulturę dyfuzyjną i zasadę mikroprzepływowości, aby dokładnie naśladować mikrośrodowisko tkanek nabłonkowych. Dzięki uwzględnieniu sygnałów biochemicznych i biomechanicznych, które są naturalnie obecne w żywych narządach, ale często są zaniedbywane w tradycyjnych modelach in vitro, chip z otwartym dachem stanowi lepszą alternatywę między systemami zamkniętymi.Procedurę zademonstruje dziś Adya Panchal, studentka w moim laboratorium. Aby rozpocząć, umieść wymagane odczynniki pod szafką bezpieczeństwa biologicznego na lodzie. Hoduj tkankowo specyficzne komórki mezenchymalne w celu uzyskania 80% do 90% zbieżności, a następnie dysocjuj komórki za pomocą trypsyny lub innych metod zgodnie z zaleceniami producenta.Granuluj komórki w 250 g przez pięć minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Zawiesić osad komórkowy w 225 mikrolitrach każdy lodowatego 10X EMEM i bufora rekonstrukcyjnego. Wymieszaj komórki przez pipetowanie i dodaj 1 800 mikrolitrów lodowatego roztworu kolagenu 1.Następnie wymieszaj roztwór żelu z lodem, pipetując w górę i w dół pięć do sześciu razy. Zneutralizować roztwór żelu wstępnego za pomocą 18 mikrolitrów jednego normalnego wodorotlenku sodu, delikatnie wymieszać pipetując, a następnie pipetować 150 mikrolitrów hydrożelu wypełnionego komórkami do centralnej komory otwartego chipa, unikając pęcherzyków. Zgrupuj frytki na oddzielnych szalkach Petriego, w tym nakrętkę probówki wirówkowej wypełnioną dwoma mililitrami sterylnej, podwójnie destylowanej wody na każdej szalce Petriego, i inkubuj szalki Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby wykonać mikrowzór powierzchni hydrożelu zrębowego, należy odpipetować 20 mikrolitrów zneutralizowanego roztworu żelu wstępnego Collagen 1 na wzorzystą powierzchnię sterylnego stempla wydrukowanego w 3D i włożyć stempel do otwartej komory, podczas gdy hydrożel zrębu jest jeszcze w postaci płynnej. Usuń wszelkie pozostałości hydrożelu, które mogą z górnej części komory otwartej, za pomocą aspiratora. Zgrupuj wszystkie wiórki na oddzielnych szalkach Petriego ze stożkową nakrętką rurki wypełnioną wodą, jak pokazano wcześniej.I inkubuj wszystkie szalki Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 90 minut. Pod koniec inkubacji umieść chipsy z powrotem pod szafką bezpieczeństwa biologicznego i delikatnie usuń stemple za pomocą precyzyjnej pęsety, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia hydrożelu. Gdy hodowane komórki osiągną konflufluację od 80% do 90%, należy oddzielić komórki za pomocą procedur enzymów proteolitycznych, zgodnie z zaleceniami dostawcy komórek.Po dysocjacji osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki nabłonkowe do odpowiedniej gęstości fragmentów komórek, jak opisano w manuskrypcie. Aby wysiać komórkę nabłonkową, przenieś wióry z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i trzykrotnie przepłucz powierzchnię zrębu 100 mikrolitrami świeżej pożywki do hodowli komórek nabłonkowych, aby usunąć nadmiar roztworu powlekającego. Po zassaniu pożywki płuczącej należy wysiać powierzchnię hydrożelu 50 mikrolitrami zawiesiny komórek nabłonka przy użyciu odpowiedniej gęstości komórek, a następnie przenieść wióry z powrotem do inkubatora na dwie godziny.Aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe, delikatnie przepłucz powierzchnię hydrożelu dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowych, odśwież pożywkę przez autoklawowanie w szczelnych pojemnikach autoklawowalnych i podłącz chipy do pompy perystaltycznej. Wstrzymaj pompę perystaltyczną, ostrożnie odłącz wióry od pompy i wyjmij nośnik obudowy wiórów. Po przeniesieniu wiórów z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego, należy usunąć pozostałą objętość pożywki do górnego zbiornika.Następnie delikatnie zassaj całe medium z górnego kanału mikroprzepływowego i zaciśnij krótkie rurki mikroprzepływowe podłączone do górnych wlotów za pomocą zacisków do segregatorów, aby zmniejszyć parowanie mediów i utrzymanie granicy faz powietrze-ciecz lub ALI. Umieść otwarty chip na uchwycie obudowy z powrotem do inkubatora. Ponownie podłącz wióry do pompy perystaltycznej i wznów przepływ, uruchamiając pompę perystaltyczną.Przepłukać komorę naczyniową pożywką do hodowli komórek śródbłonka, a następnie zasiać 25 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka. Odwróć chipy do góry nogami, aby komórki śródbłonka przyczepiły się do górnej powierzchni komory mikroprzepływowej. Ułóż frytki na szalkach Petriego.Umieść je z powrotem w inkubatorze, jak pokazano wcześniej, i pozwól komórkom śródbłonka przyczepić się na godzinę. Pod koniec inkubacji przenieść wióry z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i dwukrotnie przepłukać kanał naczyniowy pożywką do hodowli komórek śródbłonka w celu usunięcia resztek komórkowych. Połóż wióry płasko, aby ułatwić przyleganie komórek śródbłonka do dolnej powierzchni kanału naczyniowego.Napełnij zbiornik pożywki naczyniowej odgazowaną pożywką do hodowli komórek naczyniowych pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Umieść wióry z powrotem w uchwycie obudowy wiórów i ponownie podłącz je do zbiorników medium na jednym końcu i do pompy perystaltycznej z drugiej. Sprawdź połączenia mikroprzepływowe, aby upewnić się, że wszystkie wióry są prawidłowo podłączone i czy nie ma widocznych kropelek kapiącego medium.Następnie wznów przepływ płynu, uruchamiając pompę perystaltyczną. Wizualizowana jest mikrowzorzysta powierzchnia żelu z komórkami i bez. Analiza histologiczna wykazała dojrzały, wielowarstwowy naskórek zróżnicowany na chipie.Zdjęcie chipa skóry w widoku z góry wykazało obecność fibroblastów wewnątrz warstwy skórnej. PECAM-1, VE-kadheryna i von Willebrand wykazały różnicowanie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego hodowanych wspólnie w otwartym chipie skóry. MUC5AC, tubulina alfa i beta, białko chlorokomórkowe 16, p63 i barwienie fluorescencyjne ZO-1 wykazały dojrzały nabłonek dróg oddechowych.Bijące rzęski i zróżnicowany dojrzały pseudowarstwowy nabłonek obserwowano na otwartym chipie dróg oddechowych. Barwienie fluorescencyjne typu I, typu II i E-kadheryny wykazało obecność dojrzałych pneumocytów na chipie. Mikroskopia elektronowa ujawniła obecność mikrokosmków i pęcherzyków lizosomalnych, które świadczą o dojrzałym fenotypie pęcherzyków płucnych.Analiza histologiczna wykazała obecność płaskich komórek płaskonabłonkowych zgodnych z fenotypem typu I oraz prostopadłościennych komórek przypominających kostkę brukową spójnych z fenotypem typu II oraz fibroblastów wewnątrz warstwy skórnej. Obecność enterocytów i dojrzałego kielicha potwierdzono barwieniem mucyną 2 i E-kadheryną. Fibroblasty wewnątrz warstwy skórnej potwierdziły obecność prostego nabłonka walcowatego.Wszystkie odczynniki muszą być zimne, a powierzchnie żelu należy odpowiednio spłukać, aby uzyskać równą powierzchnię. Ważne jest, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki i zanieczyszczenia, aby uzyskać równomierną adhezję komórek i zwartą, brudną monowarstwę i ścianę naczyniową. Podobne podejście można zastosować do generowania innych typów modeli narządów nabłonkowych, takich jak jelito i płuca, w celu oceny, w jaki sposób określone leki lub czynniki środowiskowe mogą wpływać na homeostazę tkanek ludzkich, ze szczególnym uwzględnieniem funkcji bariery nabłonkowej i naczyniowej.Dzięki łatwemu dostępowi do fazy skuteczności przedziału zrębu, badania mogą teraz generować określone wzory twarzy i odtwarzać funkcjonalną architekturę tkanki, taką jak krypviveoli, co jest trudne do osiągnięcia za pomocą innych urządzeń.

reconstituting-cytoarchitecture-function-human-epithelial-tissues-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje wytwarzanie rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych urządzeń do hodowli komórek na poziomie narządów do rekapitulacji funkcjonalności na poziomie narządów in vitro.

Skalowalna produkcja rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych układów narządowych

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

Nasz szczegółowy protokół opisuje tworzenie i używanie zaawansowanego modelu jelita na chipie, który symuluje ludzką błonę śluzową jelit ze strukturami 3D i różnymi typami komórek, umożliwiając dogłębną analizę odpowiedzi immunologicznych i funkcji komórkowych w odpowiedzi na kolonizację mikrobiologiczną.

Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Nowy protokół uszczelniający do produkcji wodoodpornych uszczelek silikonowych dla membran urządzeń z układem polidimetylosiloksanu (PDMS). Przeznaczony do laboratoriów do tworzenia modeli chipów oraz rozwoju małych platform chipowych. Demonstrujemy protokół przy użyciu plastikowych i natywnych błon tkankowych. Procedura ta wymaga jedynie PDMS, toluenu, formy, membrany i komory próżniowej.

Dostępna procedura uszczelniania silikonu chip-to-membrana dla elastycznego i niezawodnego łączenia

Poznaj metodę odtwarzania cytoarchitektury tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym. Technika ta umożliwia badanie interfejsów nabłonkowo-mezenchymalnych i naczyniowych in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Przeglądaj więcej filmów