Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie hodowli identycznych tkanek trójwymiarowych zatopionych w żelu kolagenowym do zastosowania w wielu kontekstach eksperymentalnych, takich jak określanie wpływu stresu mechanicznego na morfogenezę rozgałęzioną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące morfogenezy tkanek, np. w ustaleniu mechanizmów leżących u podstaw zbiorowego zachowania komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że geometria zaprojektowanych tkanek jest kontrolowana i powtarzalna, co umożliwia precyzyjną manipulację oraz pomiar czynników fizycznych i biochemicznych.

W ten sposób wielkość próby jest wystarczająco duża, aby można było wyciągnąć wnioski z wysoką pewnością statystyczną. Należy rozpocząć od przygotowania krzemowej matrycy z fotowzorcem pożądanego układu, wykorzystując standardowe techniki fotolitografii. Wzorzec użyty w tym filmie składa się z prostokątnych struktur rozmieszczonych w odstępach 200 micronów.

Następnie przygotuj 50 g PDMS, łącząc prepolimer z czynnikiem sieciującym w jednorazowym naczyniu w stosunku 10:1. Potem umieść mieszaninę w próżni na 15 do 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza wprowadzone podczas procesu mieszania. Umieść silikonową matrycę stroną teksturowaną do góry w plastikowej łódce wagowej i wlej odgazowany roztwór PDMS na wierzch formy.

Następnie umieść szalkę w piekarniku i utwardzaj PDMS w temperaturze 60 °C przez 12 godzin. Po utwardzeniu wyjmij PDMS oraz matrycę z plastikowego pojemnika. Ostrożnie oddziel PDMS od wafla krzemowego.

Następnie za pomocą czystego ostrza do zadań specjalnych usuń nadmiar PDMS z okolic wytłoczonych elementów. Teraz użyj ostrza, aby pociąć wzorowany PDMS na pojedyncze prostokątne stemplowane. Przechowuj te stemplowane stroną z wzorem do góry w czystej płytce Petriego o średnicy 100 milimetrów.

Następnie należy przygotować świeżą partię odgazowanego roztworu PDMS, stosując ten sam stosunek prepolimeru do czynnika sieciującego wynoszący 10:1. Nanieść metodą spin coatingu od dwóch do trzech gramów tego roztworu na szalkę Petriego o średnicy 100 mm, a następnie utwardzać PDMS przez 12 godzin w temperaturze 60 °C. Potem, używając żyletki, należy pociąć cienką warstwę PDMS na prostokąty, które posłużą jako podpory dla stempli.

Dla każdej stemplówki potrzebne są dwa wsporniki. Po wycięciu wszystkich wsporników należy wysterylizować stemplówki PDMS oraz wsporniki, zanurzając je w 70% etanolu, a następnie osuszyć je za pomocą aspiratora w komorze bezpiecznej biologicznie. W komorze bezpiecznej biologicznie należy nanieść 50 µL 1% BSA w PBS na górną powierzchnię każdej stemplówki.

Przechowywać stemplowanie z naniesionymi kroplami w temperaturze 4 °C przez co najmniej cztery godziny, aby zapewnić adsorpcję BSA na powierzchni stempla. Następnie przenieść stemple z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i odessać roztwór BSA ze stempli PDMS. Następnie dwukrotnie przemyć powierzchnie stempli 50 µL pożywki do hodowli komórkowych.

Po każdym myciu odessaj pożywkę. Przygotuj jedną szalkę hodowlaną o średnicy 35 milimetrów dla każdego stempla PDMS. W każdej szalce umieść dwa wsporniki PDMS w odstępie nieco mniejszym niż długość stempli PDMS.

Następnie za pomocą pęsety należy pobrać szkiełka nakrywki o średnicy 15 mm i wysterylizować je 70% etanolem. Odessać nadmiar cieczy ze szkiełek, trzymając je pęsetą, a następnie umieścić je w oddzielnej płytce Petriego. W następnym kroku nanieść 50 µL mieszaniny kolagenu o stężeniu 4 mg/mL bezpośrednio na każdą stemplować, aby równomiernie pokryć powierzchnię stempli PDMS.

Używając pęsety, chwyć każdą z powlekanych kolagenem stempli PDMS i delikatnie je odwróć. Umieść odwrócone stemple stroną z kolagenem do dołu na wspornikach PDMS w naczyniach do hodowli tkankowej. Następnie inkubuj naczynia w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Następnie nanieś 50 µL pozostałej mieszaniny kolagenu na każde z okrągłych szkiełek przykrywkowych i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 30 minut. W tym momencie zbierz interesujący Cię typ komórek. W tym przypadku zastosowaliśmy mysie komórki nabłonka gruczołu piersiowego EpH4 zawieszone w stężeniu od 1 do 10 milionów komórek na ml.

Teraz wyjmij próbki żelatynowego kolagenu z inkubatora. Używając pęsety, delikatnie podnieś stemple PDMS pionowo w górę, aby oddzielić je od uformowanego kolagenu, a następnie je wyrzuć. Ważne jest, aby podnosić stempel pionowo w górę, aby nie zdeformować struktur w żelu kolagenowym.

Nanieś 30 µL skoncentrowanej zawiesiny komórkowej na powierzchnię każdego żelu kolagenowego zawierającego uformowane wgłębienia o pożądanej geometrii. Obserwuj komórki pod mikroskopem w jasnym polu, delikatnie potrząsając naczyniami z boku na bok, aby wspomóc osiadanie komórek wewnątrz wgłębień. Wgłębienia powinny zostać wypełnione w ciągu pięciu minut.

Aby usunąć nadmiar komórek z okolic wgłębień, przechyl każdą szalkę do hodowli tkankowej i delikatnie nalej 400 µL pożywki do hodowli komórkowej na powierzchnię żelu kolagenowego. Ważne jest, aby płukanie odbywało się delikatnie, poprzez powolne wlewanie pożywki na żel przy jednoczesnym przechylaniu szalki, tak aby usunąć nadmiar komórek z powierzchni żelu, nie wypłukując przy tym komórek znajdujących się w jego wgłębieniach. Odsaj lity płyn i powtórz proces płukania jeszcze dwukrotnie.

Podglądaj żele kolagenowe pod mikroskopem pomiędzy każdym płukaniem, aby sprawdzić, czy nadmiar komórek został usunięty. Po usunięciu nadmiaru komórek z okolic wypełnionych komórkami jam, umieść szalki hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 minut. Następnie, używając pęsety, delikatnie odwróć pokrywki szkieł pokrywowych powlekane kolagenem i umieść je na wierzchu wypełnionych komórkami form kolagenowych, tak aby kolagen z pokrywki utworzył zamknięcie nad jamami wypełnionymi komórkami.

Inkubuj próbki w temperaturze 37°C przez 15 minut. Gdy zakrętki kolagenowe przylegną do wypełnionych komórkami form kolagenowych, powoli dolej od 2 do 2,5 ml pożywki hodowlanej na szklane okienka przykrywające żele i inkubuj próbki w temperaturze 37°C przez okres od jednego do trzech dni. Przedstawione obrazy to widoki w niskim i wysokim powiększeniu mat uformowanych w żelu z kolagenu typu I przed wysiewem komórek.

Kształt studni jest określany przez kształt struktur na krzemowej matrycy. W tym przypadku prostokątne studnie zostały wypełnione komórkami nabłonka gruczołów mlekowych. W tym przykładzie każda prostokątna studnia o wymiarach 200 na 50 mikronów zawiera około 80 do 100 komórek.

24 godziny po wysianiu komórek zaobserwowano ich przyleganie do siebie w obrębie studzienek, co doprowadziło do sformowania tkanki. 24 godziny po dodaniu czynnika wzrostu HGF do pożywki hodowlanej w tkankach widoczna jest morfogeneza rozgałęziona. Jednym z białek uczestniczących w migracji komórek jest kinaza adhezji ogniskowej, której poziom – jak widać na tym obrazie złożonym – zwiększa się na końcach studzienek, gdzie zazwyczaj dochodzi do rozgałęziania.

Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia sił trakcyjnych, RT-PCR w czasie rzeczywistym oraz Western Blotting, aby określić siły wywierane przez komórki podczas migracji oraz zmiany w poziomach transkrypcji i białek interesujących genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie sposobu przygotowania tego modelu 3D hodowli komórkowej, w którym tkanki o określonej geometrii początkowej są osadzone w żelu kolagenowym.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.