Name: Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę inżynierii trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w żelu kolagenowym. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę geometrii i badanie mechanizmów morfogenezy tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z NIH (HL118532, HL120142, CA187692), Fundacji Davida i Lucile Packardów, Fundacji Camille i Henry'ego Dreyfusów oraz Burroughs Welcome Fund. A.S.P. było częściowo wspierane przez Charlotte Elizabeth Procter Honorific Fellowship.

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór insuliny o stężeniu 5 mg/ml, należy rozcieńczyć sproszkowany zapas insuliny 5 mM kwasem solnym (HCl) w dH2O (500 mg insuliny w 100 ml rozpuszczalnika). Przygotować 100 ml rozpuszczalnika, dodając 50 μl stężonego HCl do 100 ml wody destylowanej (dH2O).</li>
	<li>Aby przygotować 1x roztwór PBS, rozcieńczyć 10x roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do 1x z dH2O w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przygotować roztwór elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) w następujący sposób: wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 (w:w).</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych w następujący sposób: do 500 ml wywaru Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco: mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12), dodać 10 ml sterylnej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 500 μl odczynnika gentamycyny i 500 μl 5 mg/ml insuliny.</li>
	<li>Aby przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w 1x roztworze PBS, dodaj 1% (w:v) roztwór proszku BSA do 1x PBS i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Aby przygotować 4 mg/ml roztworu zobojętnionego kolagenu bydlęcego typu I, dodaj 50 μl 10x bufor zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), 30 μl 0,1 N wodorotlenku sodu (NaOH), 30 μl pożywki do hodowli komórkowych i 400 μl kolagenu wyjściowego do schłodzonej 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Mieszać powoli, pipetując w górę i w dół; Unikaj wprowadzania bąbelków. Aby usunąć pęcherzyki, należy na krótko odwirować mieszaninę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający, rozcieńczając 16% paraformaldehydu w stosunku 1:4 (v:v) w 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór do znakowania jąder, rozcieńczając podstawowy roztwór do znakowania jąder w stosunku 1:1,000 (v:v) w 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować 0,3% buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej i detergentu (PBST), mieszając 1x PBS z 0,3% (v:v) detergentem.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący, rozcieńczając surowicę kozią w stosunku 1:10 (v:v) w 0,3% PBST.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego dla określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania, rozcieńczając przeciwciało pierwszorzędowe (na przykład królicza antyogniskowa kinaza adhezyjna (FAK)) w stosunku 1:200 (v:v) w buforze blokującym.</li>
	<li>Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając przeciwciało sprzężone z sondą fluorescencyjną (na przykład przeciwciało anty-królika kozy) w stosunku 1:1,000 (v:v) w buforze blokującym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie stempli elastomerowych do mikrowzorów 3D
Uwaga: Stemple elastomerowe są wykonane z PDMS.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór PDMS w tym samym stosunku, jak opisano w kroku 1.3 i dokładnie wymieszaj. Umieść mieszaninę w komorze próżniowej na 15-30 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które zostały wprowadzone podczas procesu mieszania.</li>
	<li>Wlej odgazowany roztwór do plastikowej łódki wagowej lub szalki Petriego zawierającej krzemowy wzorzec litograficznie wzorzysty z cechami pożądanej geometrii. Aby uzyskać najlepsze wyniki, utwardź roztwór PDMS w temperaturze 60 °C przez ~12 godz. 
	Uwaga: Wzorce krzemowe są wysoce konfigurowalne; W protokole tym wykorzystuje się struktury prostokątne o wymiarach 50 μm x 200 μm x 50 μm oddalone od siebie o 200 μm. Wzorce krzemowe mogą być wykonane przy użyciu standardowych technik fotolitografii. Krótko mówiąc, fotorezystor na bazie żywicy epoksydowej jest powlekany wirowo na płytce krzemowej. Maska szczegółowo opisująca pożądane cechy stempla jest umieszczana na wierzchu płytki pokrytej fotorezystem, która jest następnie wystawiana na działanie światła UV. Pożądane cechy, które nie są blokowane przez maskę, są wystawione na działanie światła, a fotorezyst w tych miejscach zostaje usieciowany, podczas gdy pozostała część powłoki fotorezystu jest rozpuszczalna i może zostać zmyta.</li>
	<li>Po utwardzeniu PDMS wokół pożądanych cech na wzorcu krzemowym, wyjmij PDMS i master z plastikowego pojemnika. Ostrożnie oddziel PDMS od płytki krzemowej i usuń nadmiar PDMS z okolic nadrukowanych elementów za pomocą czystej żyletki.</li>
	<li>Teraz wytnij PDMS z nadrukowanymi cechami w indywidualne prostokątne stemple (~8 mm x 5 mm) za pomocą żyletki. Przechowuj je stroną do góry na czystej szalce Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Dodatkowo należy skorzystać z rozwiązania PDMS opisanego w kroku 1.3, aby wykonać podpory dla prostokątnych stempli.</li>
	<li>Za pomocą powlekarki wirowej rozprowadzić ~2-3 g roztworu PDMS równomiernie na szalce Petriego o średnicy 100 mm i utwardzić PDMS przez ~12 godzin w temperaturze 60 °C, jak w kroku 2.1. Następnie za pomocą żyletki pokrój cienką warstwę PDMS na prostokąty (~5 mm x 2 mm). 
	Uwaga: Dla każdego stempla PDMS wykonanego w kroku 2.3 potrzebne są dwie podpory. Podpory mogą być przechowywane na szalce Petriego o średnicy 100 mm, która zawiera stemple PDMS.</li>
	<li>Zanim stemple i nośniki PDMS będą mogły być używane do hodowli komórkowych, należy je wysterylizować przez zanurzenie w 70% etanolu i wysuszyć za pomocą aspiratora w komorze bezpieczeństwa biologicznego (kaptur do hodowli komórkowych).</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek nabłonkowych 3D
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj kroplę około 50 μl 1% BSA w PBS na górze każdego stempla. Umieścić stemplowanie pokryte kropelkami w temperaturze 4 °C na co najmniej 4 godziny, aby zapewnić adsorpcję BSA na powierzchni stempla.</li>
	<li>Zassać roztwór BSA ze stempli PDMS.</li>
	<li>Powierzchnie stempli należy przemyć dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowych (powinno wystarczyć 50 μl na przemycie na stempel), odsysając po każdym praniu.</li>
	<li>Manipuluj wysterylizowanymi stemplami i podporami PDMS za pomocą zakrzywionej pęsety ze stali nierdzewnej. W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozłóż jedno naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm dla każdego stempla PDMS. W każdym naczyniu ułóż dwie podpory PDMS oddalone od siebie o odległość nieco mniejszą niż długość stempli PDMS.</li>
	<li>Za pomocą pęsety wysterylizuj tyle okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych (15 mm średnicy, #1), ile jest znaczków PDMS, używając 70% etanolu. Odessać nadmiar płynu z szkiełek nakrywkowych, trzymając je pęsetą. Umyte szkiełka nakrywkowe należy przechowywać na osobnej szalce Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Dozuj ~50 μl mieszanki kolagenowej, aby równomiernie pokryć powierzchnię każdego stempla PDMS.</li>
	<li>Podnieś pęsetą każdy stempel PDMS pokryty kolagenem i delikatnie je odwróć. Opuść odwrócone stemple na górze podpór PDMS ułożonych w kulturze tkankowej o średnicy 35 mm wydrążonej w taki sposób, aby kolagen znajdował się między stemplem a dnem naczynia do hodowli tkankowej. Inkubować naczynia w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dozuj ~ 50 μl pozostałej mieszanki kolagenu na każde z okrągłych szkiełek nakrywkowych (później zostaną one umieszczone na zmodyfikowanych tkankach, aby całkowicie zamknąć je w kolagenie) i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Uzyskaj naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm zawierające komórki nabłonkowe (np. EpH4 mysie komórki nabłonkowe sutka) przy ~40% zbieganiu. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej i przemyć raz 10 ml 1x PBS. Dodać 2 ml trypsyny do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.</li>
	<li>Dodać 8 ml świeżej pożywki hodowlanej do naczynia do hodowli tkankowej zawierającej trypsynizowane komórki, odrywając od naczynia wszelkie pozostałe przylegające komórki. Delikatnie wymieszać pipetując i przenieść mieszaninę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 100 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant z rurki stożkowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do hodowli komórkowych. Za pomocą hemocytometru policz komórki, aby określić stężenie zawiesiny. Dostosuj objętość zawiesiny, aby uzyskać końcowe stężenie ~106-10 7komórek/ml.</li>
	<li>Usunąć zżelowane próbki kolagenu z inkubatora. Za pomocą pęsety delikatnie podnieś stemple PDMS prosto do góry, aby oderwać je od uformowanego kolagenu i wyrzucić.</li>
	<li>Dozować ~30 μl skoncentrowanej zawiesiny komórkowej na powierzchnię każdego żelu kolagenowego zawierającego uformowane ubytki o pożądanej geometrii. Obserwuj komórki pod mikroskopem jasnego pola za pomocą obiektywu 10X/0,25 NA, delikatnie potrząsając szalkami na boki, aby ułatwić osadzanie się komórek w jamach. Ubytki należy wypełnić w ciągu ~5 min.</li>
	<li>Aby usunąć nadmiar komórek z okolic jam, przechyl każde naczynie do hodowli tkankowych na bok i delikatnie dozuj ~400 μl pożywki do hodowli komórkowych na powierzchnię żelu kolagenowego. Odessać płyn i powtórzyć pranie jeszcze 1-2 razy, sprawdzając żele kolagenowe pod mikroskopem pomiędzy każdym praniem.</li>
	<li>Po usunięciu nadmiaru komórek z okolic wypełnionych komórkami jam w formie kolagenowej, należy umieścić szalki z kultur tkankowych w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 15 minut. Następnie za pomocą pęsety delikatnie odwróć pokryte kolagenem szkiełka nakrywkowe i umieść je na wypełnionych komórkami formach kolagenowych tak, aby kolagen z szkiełek nakrywkowych utworzył czapeczkę nad jamami wypełnionymi komórkami. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Gdy nakrętki kolagenowe przylgną do wypełnionej komórkami formy kolagenowej, powoli dozuj ~ 2-2,5 ml pożywki do hodowli komórkowych na szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu żeli. Hodować próbki w temperaturze 37 °C przez 1-3 dni. 
	Uwaga: 24 godziny po pierwszym wysiewie tkanki nabłonkowe można potraktować czynnikami wzrostu, takimi jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) lub czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) w celu wywołania rozgałęzień.</li>
</ol>
4. Immunofluorescencja i analiza obrazu 
<ol>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z szalek do hodowli tkankowych i dodać tyle roztworu utrwalającego, aby pokryć żele zawierające komórki. Inkubuj naczynia w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min.</li>
	<li>Odessać utrwalacz, napełnić szalki do kultur tkankowych 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. Powtórz dwa razy przez trzy prania.</li>
	<li>Aby oznaczyć jądra: Odessać PBS z naczynia do hodowli tkankowej i zastąpić roztworem Hoechsta. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut. Aby wybarwić FAK lub inny marker, który jest wykrywalny za pomocą przeciwciał, przejdź do kroku 4.5.</li>
	<li>Odessać roztwór do znakowania jądrowego i przemyć żele zawierające komórki trzykrotnie 1x PBS, jak w kroku 4.2. Barwione próbki można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Aby wybarwić w celu uzyskania interesującego białka: Odessać PBS z szalek do hodowli tkankowych, dodać 300 μl 0,3% PBST i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Odessać PBS, przykryć żele buforem blokującym i inkubować na wytrząsarce (200 obr./min) w temperaturze pokojowej przez ~4 godziny.</li>
	<li>Odessać bufor blokujący, przykryć żele pierwszorzędowym roztworem przeciwciała i inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego, dodać 0,3% roztwór PBST i inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min w temperaturze pokojowej przez 30 min. Odsysać PBST i powtarzać co 30 minut przez 3-4 godziny.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.7 i 4.8, tym razem inkubując z drugorzędowym roztworem przeciwciała. Owiń naczynia do hodowli tkankowych folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu przeciwciała wtórnego. Po ostatnim umyciu wybarwione próbki można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Aby uwidocznić próbki, użyj obiektywu 10X/0,30 NA skoncentrowanego na płaszczyźnie środkowej tkanek nabłonkowych.</li>
	<li>Aby uwidocznić jądra komórkowe, należy zobrazować utrwalone próbki oznaczone markerem jądrowym za pomocą obiektywu 10X/0,30 NA w świetle UV.</li>
	<li>Aby zobrazować próbki barwione pod kątem białka będącego przedmiotem zainteresowania, zobrazuj za pomocą obiektywu 10X/0,30 NA na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
	<li>Aby utworzyć mapy częstotliwości barwienia białek wielu tkanek (zwykle 50 lub więcej) o identycznej geometrii początkowej, najpierw zaimportuj każdy z obrazów za pomocą standardowego oprogramowania do analizy obrazów (patrz Materiały) i przekonwertuj je na 8-bitową skalę szarości.</li>
	<li>Aby progizować te obrazy, przekonwertuj je na binarne (tj. półcienie/czerń i biel), definiując punkt odcięcia skali szarości; wartości skali szarości poniżej progu stają się czarne, a te powyżej progu stają się białe. Następnie połącz każdy z pojedynczych obrazów binarnych w jeden stos obrazów.</li>
	<li>Następnie zarejestruj ułożone w stos obrazy (tj. wyrównaj je lub dopasuj) w oprogramowaniu do analizy. Wiele pakietów oprogramowania do analizy obrazu jest dostarczanych z bezpłatną wtyczką rejestracyjną.
	<ol>
		<li>Użyj każdego obrazu w stosie jako szablonu do wyrównania następnego obrazu, tak aby obrazy w całym stosie były wyrównywane przez propagację. Na koniec nałóż (wyświetl) obrazy w wyrównanym stosie obrazów na podstawie średniej intensywności, aby utworzyć pojedynczy obraz z mapą częstotliwości pikseli. Ten obraz można następnie oznaczyć kolorami za pomocą wybranego oprogramowania do edycji obrazu10,11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li>
<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development%3A+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).</li>
<li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK%28ERK-1%2C2%29+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li>
<li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li>
<li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li>
<li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li>
<li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458(2015).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li>
<li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li>
<li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li>
<li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany powyżej protokół przedstawia metodę wytwarzania identycznych tkanek nabłonkowych o określonym kształcie, umożliwiającą przestrzenną kontrolę naprężeń mechanicznych doświadczanych przez komórki w tkance. Forma elastomerowa służy do tworzenia ubytków w kolagenie typu I, które są następnie wypełniane komórkami nabłonkowymi i pokrywane dodatkową warstwą kolagenu, tak aby komórki były całkowicie zamknięte w środowisku matrycy kolagenowej 3D. Dalsza hodowla tych tkanek i leczenie czynnikami wzrostu w celu wywołania roz...

Rozwój rozgałęzionych tkanek nabłonkowych, znany jako rozgałęziona morfogeneza, jest regulowany przez czynniki komórkowe, fizyczne i środowiskowe. W gruczole sutkowym rozgałęziona morfogeneza jest procesem iteracyjnym, w którym kierowana zbiorowa migracja komórek tworzy architekturę przypominającą drzewo. Pierwszym krokiem jest pierwotne utworzenie pąków z przewodów mlecznych, a następnie inicjacja gałęzi i wydłużenie1,2. Inwazja gałęzi do otaczającego zrębu jest indukowana przez ogólnoustrojowe uwalnianie hormonów steroidowych w okresie dojrzewania. Nowe pierwotne pąki następnie inicjują się z końców istniejących gałęzi, a proces ten kontynuuje tworzenie drzewa nabłonkowego3. Chociaż zidentyfikowano wiele ważnych sygnałów biochemicznych, obecnie brakuje kompleksowego zrozumienia mechanizmów biologicznych komórek, które kierują tym złożonym procesem rozwojowym. Co więcej, badania mechanistyczne nad wpływem konkretnych sygnałów są trudne do dekonstrukcji na podstawie eksperymentów in vivo, ponieważ precyzyjne perturbacje i pomiary czasoprzestrzenne często nie są możliwe.
Techniki hodowli trójwymiarowej (3D), takie jak hodowla całych organów, pierwotne organoidy i modele hodowli komórkowych, są użytecznymi narzędziami do systematycznego badania mechanizmów leżących u podstaw morfogenezy tkanek4-6. Mogą one być szczególnie przydatne do określania wpływu określonych czynników indywidualnie, takich jak siły mechaniczne i sygnały biochemiczne, na różne zachowania komórek, w tym migrację, proliferację i różnicowanie. 6 W szczególności zmodyfikowane modele hodowli komórkowych umożliwiają łatwe zaburzanie pojedynczych komórek i ich mikrośrodowiska.
Jeden z takich modeli kulturowych wykorzystuje podejście oparte na mikrofabrykacji do inżynierii modelowania tkanek nabłonka sutka z kontrolowaną strukturą 3D, które konsekwentnie i powtarzalnie tworzą gałęzie, które migrują zbiorowo, gdy są indukowane odpowiednimi czynnikami wzrostu. Główną zaletą modelu jest możliwość precyzyjnego manipulowania i mierzenia wpływu czynników fizycznych i biochemicznych, takich jak wzorce naprężeń mechanicznych, z dużą pewnością statystyczną. Technika ta, wraz z modelowaniem obliczeniowym, została już wykorzystana do określenia względnego udziału sygnałów fizycznych i biochemicznych w kierowaniu normalnym rozwojem tkanek nabłonka sutka i innych nabłonków rozgałęzionych7-11. Przedstawiono szczegółowy protokół budowy tych tkanek modelowych, który można łatwo rozszerzyć na inne typy komórek i żele macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i który służy jako potencjalne narzędzie do testowania środków terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Kleje Ellsworth Sylgard</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Utwardzacz PDMS</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Litograficznie wzorzysty silikonowy mistrz</td><td>własnej produkcji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa łódź do ważenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego o średnicy 100 mm</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Przygotuj 70% roztwór EtOH (v:v) mieszając z dH2O</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Amerykańska maszynka do golenia</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni : Szynka" s F12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyklon</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bydło kolagen typu I (niepepsynizowany)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiona pęseta ze stali nierdzewnej</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe #1, średnica 15 mm</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Specjalne zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>0,05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>N9300260 Detergent</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Zawieszony w dH2O w stężeniu 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało przeciw myszom</td><td>FAK Life Technologie</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik Przeciwciało Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Służy do kodowania kolorami map częstotliwości pikseli.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Darmowe oprogramowanie do analizy obrazów służące do progowania, rejestrowania i nakładania obrazów w celu stworzenia mapy częstotliwości pikseli. Wtyczka StackReg została użyta do rejestracji obrazów binarnych.</td></tr></tbody></table>

inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Architektura rozgałęzionych organów, takich jak płuca, nerki i gruczoły sutkowe, powstaje w wyniku procesu rozwojowego rozgałęzionej morfogenezy, która jest regulowana przez różne rozpuszczalne i fizyczne sygnały w mikrośrodowisku. Opisana tutaj jest metoda stworzona do badania procesu rozgałęziania się morfogenezy poprzez tworzenie zaprojektowanych trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonym kształcie i rozmiarze, które są całkowicie osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Metoda ta umożliwia tworzenie układów identycznych tkanek i umożliwia kontrolę różnych czynników środowiskowych, w tym geometrii tkanek, odstępów i składu ECM. Metodę tę można również połączyć z szeroko stosowanymi technikami, takimi jak mikroskopia sił trakcyjnych (TFM), aby uzyskać więcej informacji na temat interakcji między komórkami i otaczającym je ECM. Protokół może być wykorzystany do badania różnych procesów komórkowych i tkankowych poza rozgałęzioną morfogenezą, w tym inwazji raka.

Ogólny schemat mikrofabrykacji tkanki nabłonka gruczołowego piersi
Ogólny schemat procedury mikrowytwarzania przedstawiający przebieg prac eksperymentalnych pokazano na Rysunku 1. Wynikiem końcowym jest macierz tkanek nabłonkowych o identycznej geometrii i rozmieszczeniu, które są całkowicie zatopione w żelu ECM. W reprezentatywnym eksperymencie wykorzystano mysie komórki nabłonka gruczołu piersiowego EpH4 hodowane w żelu z kol...

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie hodowli identycznych tkanek trójwymiarowych zatopionych w żelu kolagenowym do zastosowania w wielu kontekstach eksperymentalnych, takich jak określanie wpływu stresu mechanicznego na morfogenezę rozgałęzioną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące morfogenezy tkanek, np. w ustaleniu mechanizmów leżących u podstaw zbiorowego zachowania komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że geometria zaprojektowanych tkanek jest kontrolowana i powtarzalna, co umożliwia precyzyjną manipulację oraz pomiar czynników fizycznych i biochemicznych.W ten sposób wielkość próby jest wystarczająco duża, aby można było wyciągnąć wnioski z wysoką pewnością statystyczną. Należy rozpocząć od przygotowania krzemowej matrycy z fotowzorcem pożądanego układu, wykorzystując standardowe techniki fotolitografii. Wzorzec użyty w tym filmie składa się z prostokątnych struktur rozmieszczonych w odstępach 200 micronów.Następnie przygotuj 50 g PDMS, łącząc prepolimer z czynnikiem sieciującym w jednorazowym naczyniu w stosunku 10:1. Potem umieść mieszaninę w próżni na 15 do 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza wprowadzone podczas

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Natywna matryca pochodząca z fibroblastów pochodząca z inżynierii tkankowej jest nowym narzędziem do generowania substratu zrębu, który wspiera proliferację i różnicowanie komórek nabłonkowych. W artykule przedstawiono protokół stosujący tę metodologię do oceny wpływu różnych typów komórek zrębu na biologię komórek nowotworowych.

Inżynieria tkankowa mikrośrodowiska zrębu guza z zastosowaniem do inwazji komórek rakowych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Poznaj metodę inżynierii trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w żelu kolagenowym. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę geometrii i badanie mechanizmów morfogenezy tkanek.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Przeglądaj więcej filmów