Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Celem tej procedury jest wyhodowanie identycznych trójwymiarowych tkanek, które są osadzone w żelu kolagenowym do wykorzystania w wielu kontekstach eksperymentalnych, takich jak określenie wpływu naprężeń mechanicznych na morfogenezę rozgałęzień. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące morfogenezy tkanek, takie jak określenie mechanizmów leżących u podstaw zbiorowego zachowania komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że geometria zmodyfikowanych tkanek jest kontrolowana i powtarzalna, co umożliwia precyzyjną manipulację i pomiar czynników fizycznych i biochemicznych.

W związku z tym wielkość próby jest na tyle duża, że wnioski można wyciągać z dużą pewnością statystyczną. Zacznij od przygotowania wzorca krzemowego z fotowzorem z żądaną matrycą przy użyciu standardowych technik fotolitografii. Wzór użyty w tym filmie składa się z prostokątnych struktur oddalonych od siebie o 200 mikronów.

Następnie wymieszaj 50 gramów PDMS, łącząc prepolimer i utwardzacz w jednorazowym naczyniu w proporcji 10:1. Następnie umieść mieszaninę w próżni na 15 do 30 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które zostały wprowadzone podczas procesu mieszania. Umieść silikonową teksturowaną stroną do góry w plastikowej łódce do ważenia i wlej odgazowany roztwór PDMS na wierzch formy.

Następnie wstaw naczynie do piekarnika i utwardź PDMS w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Po utwardzeniu wyjmij PDMS i master z plastikowego pojemnika. Ostrożnie oddziel PDMS od płytki krzemowej.

Następnie użyj czystej żyletki, aby usunąć nadmiar PDMS z okolic nadrukowanych elementów. Teraz użyj żyletki, aby pociąć wzorzyste PDMS na pojedyncze prostokątne stemple. Przechowuj te stemple stroną do góry na czystej szalce Petriego o średnicy 100 milimetrów.

Następnie przygotuj świeżą partię odgazowanego roztworu PDMS, używając tego samego stosunku 10:1 prepolimeru do utwardzacza. Odwiruj dwa do trzech gramów tego roztworu na szalce Petriego o średnicy 100 milimetrów, a następnie utwardź PDMS przez 12 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie za pomocą żyletki pokrój cienką warstwę PDMS na prostokąty, które posłużą jako podpory dla stempli.

Do każdego stempla potrzebne są dwie podpory. Po przecięciu wszystkich podpór wysterylizuj stemple i podpory PDMS, zanurzając je w 70% etanolu i susząc za pomocą aspiratora w komorze bezpieczeństwa biologicznego. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 50 mikrolitrów 1% BSA w PBS na górze każdego stempla.

Umieść znaczki pokryte kropelkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny, aby upewnić się, że BSA wchłonie się w powierzchnię stempla. Następnie należy umieścić stemple z powrotem w szafie bezpieczeństwa biologicznego i odessać roztwór BSA ze znaczków PDMS. Następnie dwukrotnie umyj powierzchnie stempli 50 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych.

Zasysać pożywkę po każdym praniu. Rozłóż jedną miskę do hodowli tkankowej o średnicy 35 milimetrów dla każdego stempla PDMS. W każdym naczyniu ułóż dwie podpory PDMS oddalone od siebie o odległość nieco mniejszą niż długość stempli PDMS.

Następnie użyj pęsety, aby zebrać szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 milimetrów i wysterylizować je przy użyciu 70% etanolu. Odessać nadmiar płynu z szkiełek nakrywkowych, trzymając je pęsetą, a następnie przechowywać na osobnej szalce Petriego. Następnie dozuj 50 mikrolitrów mieszaniny kolagenu o stężeniu czterech miligramów na mililitr bezpośrednio na każdy stempel, aby równomiernie pokryć powierzchnię stempli PDMS.

Za pomocą pęsety podnieś każdy ze stempli PDMS pokrytych kolagenem i delikatnie je odwróć. Opuść odwrócone stemplowanie kolagenem stroną do dołu na podporach PDMS w naczyniach do hodowli tkankowych. Następnie inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie naniec 50 mikrolitrów pozostałej mieszanki kolagenu na każde z okrągłych szkiełek nakrywkowych i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. W tym momencie zbierz swój rodzaj zainteresowania komórek. Tutaj mamy EpH4 mysie komórki nabłonkowe sutka, które zawiesiliśmy w stężeniu od jednego do 10 milionów komórek na mililitr.

Teraz wyjmij zżelowane próbki kolagenu z inkubatora. Za pomocą pęsety delikatnie podnieś stemple PDMS prosto do góry, aby oderwać je od uformowanego kolagenu i wyrzucić. Ważne jest, aby podnieść stempel prosto do góry, aby nie zniekształcić cech żelu kolagenowego.

Dozować 30 mikrolitrów skoncentrowanej zawiesiny komórkowej na powierzchnię każdego żelu kolagenowego zawierającego uformowane wgłębienia o pożądanej geometrii. Obserwuj komórki pod mikroskopem jasnego pola, delikatnie potrząsając naczyniami na boki, aby ułatwić osadzanie się komórek w jamach. Ubytki należy wypełnić w ciągu pięciu minut.

Aby usunąć nadmiar komórek z okolic jam, przechyl każde naczynie do hodowli tkankowej na bok i delikatnie dozuj 400 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych na powierzchnię żelu kolagenowego. Ważne jest, aby delikatnie umyć poprzez powolne dozowanie pożywki hodowlanej na żel, jednocześnie przechylając naczynie, tak aby nadmiar komórek na powierzchni żelu został usunięty, a komórki w zagłębieniach żelu nie uległy przemieszczeniu. Zassać płyn i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy.

Sprawdzaj żele kolagenowe pod mikroskopem między każdym myciem, aby zaobserwować, kiedy nadmiar komórek został wypłukany. Po usunięciu nadmiaru komórek z okolic jam wypełnionych komórkami, umieść szalki z kulturami tkankowymi w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. Następnie za pomocą pęsety delikatnie odwróć szkiełka nakrywkowe pokryte kolagenem i umieść je na wierzchu form kolagenowych wypełnionych komórkami, tak aby kolagen z szkiełka nakrywkowego utworzył czapeczkę nad wnękami wypełnionymi komórkami.

Próbki inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Gdy nasadki kolagenowe przylgną do wypełnionych komórkami form kolagenowych, powoli dozuj od dwóch do 2 1/2 mililitra pożywki do hodowli komórkowych na szklanych szkiełkach pokrywy na żelach i hoduj próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni. Obrazy te pochodzą z widoków w małym i dużym powiększeniu matryc uformowanych w żel kolagenowy typu I przed wysiewem komórek.

Kształt studzienek zależy od kształtu cech na wzorcu krzemowym. Tutaj prostokątne studzienki zostały wypełnione komórkami nabłonka sutka. W tym przykładzie każda studzienka prostokątna o wymiarach 200 na 50 mikronów zawiera około 80 do 100 komórek.

24 godziny po wysianiu komórek zaobserwowano, że komórki przylegają do siebie w studzienkach, tworząc tkankę. 24 godziny po dodaniu czynnika wzrostu HGF do pożywki hodowlanej obserwuje się, że tkanki przechodzą rozgałęzioną morfogenezę. Jednym z białek biorących udział w migracji komórek jest ogniskowa kinaza adhezyjna, która, jak widać na tym złożonym obrazie, wzrasta na końcach studzienek, gdzie zwykle dochodzi do rozgałęzień.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia sił trakcyjnych, RT-PCR w czasie rzeczywistym i Western Blotting, w celu określenia sił wywieranych przez komórki podczas migracji oraz zmian w poziomach transkryptu i białek w genach będących przedmiotem zainteresowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować ten model hodowli komórkowej 3D, w którym tkanki o określonej geometrii początkowej są osadzone w żelu kolagenowym.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.