Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Ten innowacyjny protokół został zaprojektowany do uprawy LLEC przez innych badaczy, tylko wynaczynionych. Opracowaliśmy wielozadaniową procedurę do zbioru i hodowli pierwotnych LLEC in vitro. Nasz protokół ostatecznie doprowadził do ustanowienia pierwotnej hodowli LLEC o poziomie czystości przekraczającym 95%Obecnie nie istnieje żaden protokół zbioru i hodowli LLEC in vitro.

Nasze wyniki torują drogę do dalszych badań nad podobną funkcją LLEC in vitro. LLEC są powodem do odkrycia wewnątrzczaszkowej populacji komórkowej, biologicznego znaczenia LLEC bezpiecznego roku. Przeprowadzimy dalsze badania nad funkcją komórkową i ujawnimy ich implikacje kliniczne.

Na początek ostrożnie naciąć skórę ofiarowanej myszy, zaczynając od otworu czaszki i rozciągając się w kierunku obszaru czołowego. Za pomocą nożyczek delikatnie podnieś i wyjmij czaszkę, nie uszkadzając opon mózgowych, zbierając cały mózg. Zanurz cały mózg w buforze płuczącym i delikatnie go przepłucz, aby usunąć krew z powierzchni.

Przenieś mózg na sterylną szalkę Petriego bez siekania. Następnie, pod mikroskopem, użyj cienkiej pęsety, aby wydobyć opony mózgowe z powierzchni mózgu. Za pomocą sterylnych mikronożyczek pokrój tkankę opon mózgowo-rdzeniowych na fragmenty.

Przygotuj mieszankę enzymów trawiennych przy użyciu podanych składników. Dodaj 10 mililitrów mieszanki do fragmentów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Delikatnie zamieszaj, aby oderwać fragmenty od dna tuby.

Następnie dodaj 10 mililitrów buforu zatrzymującego. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I za pomocą pipety ostrożnie usuń supernatant.

Dodaj 10 mililitrów zimnego PBS i przefiltruj wszelkie grudki przez sitko o średnicy 70 mikronów do sterylnej probówki o średnicy 50 mililitrów. Płytkę od 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy do kolby T25 pokrytej fibronektyną z pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.

Po inkubacji zastąp pożywkę świeżą pożywką, aby wyeliminować nieprzyłączone komórki. Zacznij od przymocowania separatora magnetycznego do podstawy. Podłącz kolumnę selekcyjną do separatora magnetycznego i umieść sitko o średnicy 70 mikronów na górze kolumny selekcyjnej.

Umieść rurkę o pojemności 50 mililitrów pod kolumną wyboru, aby zebrać przepływ. Gdy komórki mózgowe myszy osiągną 80% konfluencji, odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS. Dodaj 0,25% trypsyny, aby oderwać przylegające komórki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie dodaj bufor zatrzymujący. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 g przez pięć minut i usunąć supernatant. W przypadku barwienia przeciwciał ponownie zawieś od 10 do 7 komórek w 100 mikrolitrach PBS.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu przeciwciała LYVE-1 i dokładnie wymieszaj. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji odwirować komórki i wyrzucić supernatant.

Następnie przepłucz komórki, dodając jeden mililitr PBS i odwirowując przy 300 g przez pięć minut. W przypadku etykietowania mikrogranulek należy ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach PBS i 20 mikrolitrach mikrogranulek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie odwirować zawiesinę i przepłukać granulat jednym mililitrem PBS. Ponownie odwiruj i ponownie zawieś osad w czterech mililitrach PBS w celu wykluczenia ujemnego magnetycznie. Przepuść zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 mikronów, aby wyeliminować grudki.

Przygotuj kolumnę selekcyjną, przepłukując ją trzema mililitrami PBS. Następnie dodaj zawieszenie komórek do kolumny wyboru. Umyj kolumnę trzema mililitrami PBS i zbierz ujemne komórki LYVE-1 do 50-mililitrowej probówki.

W celu pozytywnej selekcji magnetycznej należy odpipetować sześć mililitrów PBS do kolumny selekcyjnej. Następnie przepłucz magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny selekcyjnej, aby uzyskać dodatnie LLEC LYVE-1. Następnie odwirować dodatnią zawiesinę komórek i usunąć supernatant.

Płytkę od 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy do kolby T-25 z pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej. Utrzymuj kulturę, wymieniając 50% pożywki co drugi dzień. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, odłącz je, jak wykazano wcześniej, przed wykonaniem pasażu komórkowego.

Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że odsetek komórek LYVE-1 dodatnich w pasażu drugim nie różnił się znacząco od pasażu trzeciego po maksimum, co wskazuje na czystość większą niż 95%Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło barwienie LYVE-1 z PDPN, VEGFR-3 i PROX1, ustalając tożsamość LLEC. Komórki LYVE-1 dodatnie nie wykazywały ekspresji F4/80 i płytkowego czynnika wzrostu beta. Skuteczne odróżnianie LLEC od makrofagów i fibroblastów.

Komórki opon mózgowo-rdzeniowych przed maksimum wykazywały niejednorodną morfologię, od okrągłych kulek po zrośnięte kształty włókien. Jednak post max, LLEC wykazywały typowe cechy przypominające śródbłonek, takie jak kształty wrzeciona i kostki brukowej.