Name: Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych z myszy. Protokół zapewnia czystość powyżej 95%, umożliwiając badanie funkcji komórkowych LLEC in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81960226, 81760223), Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) oraz Fundacji Badań Naukowych Departamentu Edukacji Prowincji Yunnan (2023Y0784).

To badanie otrzymało zgodę Komisji Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Kunming (kmmu20220945). Wszystkie eksperymenty były zgodne z ustalonymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Komórki śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych (LLEC) pobrano od samców myszy C57Bl/6J w wieku 6-8 tygodni i o wadze od 20 do 25 g. Myszy te zostały pozyskane z Uniwersytetu Medycznego Kunming w Kunming w Chinach. Cała procedura eksperymentalna została przeprowadzona w ściśle sterylnych warunkach. Wszystkie etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej.
1. Przygotowanie odczynników i instrumentów
UWAGA: Wszystkie kroki związane z rozwiązaniami muszą być przeprowadzane w gabinecie zagrożenia biologicznego klasy II.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do przemywania przez zmieszanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z wapniem i magnezem, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S) (patrz Tabela materiałów). Przechowywać ten bufor w niskiej temperaturze 4 °C. Konieczne jest, aby przygotować go na świeżo w dniu użycia i odgazować bufor.</li>
	<li>Przygotuj enzymy trawienne, łącząc 10 ml PBS (bez wapnia i magnezu) z 2 ml 0,25% trypsyny, 1 ml 20 mg/ml papainy i 200 μl 1 mg/ml kolagenazy I (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Należy zapewnić stosowanie podwielokrotności o odpowiednich objętościach, aby zapobiec powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania. Przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną, wykorzystując dostępny na rynku zestaw pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, który zawiera VEGF-C (100 ng / ml) i 1% P / S (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotować bufor zatrzymujący, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco 10% FBS, aby zatrzymać proces trawienia.</li>
	<li>Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne: narzędzia te powinny obejmować nożyczki, pęsetę z ząbkowaną końcówką i pęsetę z cienkim czubkiem.</li>
</ol>
2. Powłoka kolby
<ol>
	<li>Pokryć kolbę T25 roztworem fibronektyny o stężeniu 100 μg/ml (patrz tabela materiałów) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Przed użyciem usunąć roztwór powlekający za pomocą pipety.</li>
	<li>Umyć kolbę trzykrotnie PBS, następnie odessać PBS i pozostawić kolbę T25 do wyschnięcia na powietrzu.</li>
</ol>
3. Dysocjacja opon mózgowo-rdzeniowych
UWAGA: Zawsze używaj wstępnie schłodzonych i roztworów o temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Znieczulić myszy nadmiernym wdychaniem 4% izofluranu, a następnie złożyć je w ofierze przez szybkie ścięcie za pomocą nożyczek, które zostały wcześniej oczyszczone 70% etanolem.</li>
	<li>Ostrożnie naciąć skórę wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu z tyłu czaszki i rozciągając się w kierunku obszaru czołowego.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij czaszkę, delikatnie unosząc ją nożyczkami, aby uniknąć uszkodzenia opon mózgowych, upewniając się, że uzyskano cały mózg, w tym opony mózgowo-rdzeniowe.</li>
	<li>Zanurz cały mózg w buforze do płukania i delikatnie go przepłucz, aby usunąć krew z powierzchni.</li>
	<li>Przenieś mózg na sterylną szalkę Petriego bez siekania i wyekstrahuj opony mózgowe z powierzchni mózgu za pomocą cienkiej pęsety pod mikroskopem.</li>
	<li>Pokrój tkankę opon mózgowo-rdzeniowych na fragmenty za pomocą sterylnych mikronożyczek.</li>
</ol>
4. Trawienie enzymatyczne opon mózgowo-rdzeniowych
<ol>
	<li>Dodać 10 ml mieszaniny enzymów (krok 1.2) do fragmentów i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Delikatnie wstrząsnąć, aby upewnić się, że fragmenty odczepiają się od dna probówki. Następnie dodaj 10 ml buforu zatrzymującego (krok 1.4), aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodaj 10 ml zimnego PBS i przepuść mieszaninę przez sitko o wielkości 70 μm do sterylnej probówki o pojemności 50 ml, aby odfiltrować wszelkie grudki.</li>
</ol>
5. Ekspansja komórek
<ol>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek nacm2 do kolby T25 pokrytej fibronektyną (etap 2) z 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny. Następnie usunąć pożywkę, aby wyeliminować nieprzyłączone komórki.</li>
	<li>Utrzymuj kulturę, wymieniając 50% pożywki co dwa dni. Powtórz ten proces dwa lub trzy razy.</li>
</ol>
6. Magnetyczny wybór komórek
UWAGA: Pracuj szybko, utrzymuj chłód komórek i korzystaj z wstępnie schłodzonych rozwiązań, aby zapobiec niespecyficznemu oznaczaniu komórek.
<ol>
	<li>Przygotowanie narzędzi i odczynników: przymocować separator magnetyczny do stojaka separatora magnetycznego (patrz tabela materiałów). Podłącz kolumnę selekcyjną do separatora magnetycznego i umieść sitko o średnicy 70 μm na szczycie kolumny selekcyjnej. Umieść probówkę o pojemności 50 ml pod kolumną selekcyjną, aby zebrać przepływ.</li>
	<li>Trawienie enzymatyczne: gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS. Dodać 0,25% trypsyny, aby oderwać przylegające komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zatrzymaj trawienie, dodając bufor zatrzymujący. Odwirować komórki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał: ponownie zawiesić 1 x 107 komórek w 100 μl PBS i dodać 10 μl przeciwciała LYVE-1 (patrz tabela materiałów). Dokładnie wymieszać i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Przepłukać komórki, wprowadzając 1 ml PBS i odwirowując przy 300 x g przez 5 minut. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie mikrogranulek: ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS i dodać 20 μl mikrogranulek (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant. Następnie oczyść komórki 1 ml PBS poprzez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut. Na koniec całkowicie usuń supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykluczenie ujemne magnetycznie: ponownie zawiesić komórki w 4 ml PBS. Przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm, aby wyeliminować grudki. Przygotować kolumnę selekcyjną (patrz Tabela materiałów), przepłukując ją 3 ml PBS, a następnie nanieść zawiesinę komórek do kolumny selekcyjnej.
	<ol>
		<li>Wykonaj etapy przemywania za pomocą 3 ml PBS i zbierz komórki LYVE-1-ujemne do probówki o pojemności 50 ml umieszczonej poniżej kolumny selekcyjnej, aby umożliwić im przejście.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozytywna selekcja magnetyczna: odpipetować 6 ml PBS do kolumny selekcyjnej. Natychmiast wypłucz magnetycznie znakowane ogniwa, mocno wciskając tłok do kolumny selekcyjnej, aby uzyskać LYVE-1-dodatnie LLEC. 
	UWAGA: Zawsze poczekaj, aż zbiornik kolumny wyboru będzie pusty, zanim przejdziesz do następnego kroku.</li>
</ol>
7. Kultura LLEC
<ol>
	<li>Odwirować LYVE-1-dodatnie LLEC przy 300 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek nacm2 do kolby T25 pokrytej fibronektyną z 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Utrzymuj kulturę, wymieniając 50% pożywki co drugi dzień. Gdy komórki osiągną 80% zbiegu, odłącz komórki od 0,25% trypsyny i przeprowadź przejście komórkowe. Wykorzystaj komórki do kolejnych eksperymentów po 2-3 przejściach.</li>
</ol>
8. Analiza cytometryczna przepływowa
UWAGA: Analiza cytometryczna przepływowa została przeprowadzona zgodnie z wcześniej opisaną procedurą15.
<ol>
	<li>Dodać 0,25% trypsyny, aby oderwać przylegające komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Następnie dodaj bufor zatrzymujący, aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut i całkowicie odessać supernatant. Ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 100 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 1 μl przeciwciała LYVE-1. Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości buforu PBS do analizy za pomocą cytometrii przepływowej i oprogramowania FlowJo (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
9. Barwienie immunofluorescencyjne
UWAGA: Barwienie immunofluorescencyjne zostało przeprowadzone zgodnie z procedurą opisaną wcześniej16.
<ol>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć PFA i umyj komórki trzykrotnym PBS.</li>
	<li>Nakładać bufor blokowy na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokowy ze szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało LYVE-1 w buforze barwiącym do komórek i inkubuj w ciemności. Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (patrz tabela materiałów) z buforu barwiącego do komórek i inkubować w ciemności. Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Komórki są teraz gotowe do mikroskopii immunofluorescencyjnej.</li>
</ol>

Establishing In Vitro LLEC Cultures Using Magnetic Cell Selection

<ol><li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li>
<li>Suárez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+with+many+talents%3A+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799(2021).</li>
<li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li>
<li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics%3A+A+techniques+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778(2023).</li>
<li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li>
<li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Identification%2C+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li>
<li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li>
<li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691(2015).</li>
<li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li>
<li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li>
<li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li>
<li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li>
<li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964(2022).</li>
<li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965(2016).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
<li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+lymphatic+vasculature%3A+From+development+to+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li>
<li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+%28VEGF-C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li>
<li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li>
<li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949(2023).</li>
<li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Istniejący protokół odłowu i hodowli LLEC in vitro nie został wcześniej zgłoszony. Badanie to wprowadza powtarzalny, wieloproceduralny protokół zbioru i hodowli LLEC z opon mózgowych myszy.
Chociaż ten wieloproceduralny protokół jest powtarzalny, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kwestii. Na przykład kolby T25 pokryte fibronektyną promują adhezję LLEC i działają poprzez eliminację nieprzylegających komórek, zapewniając w ten sposób bardziej jednorodną populację komórkową. Ponadt...

Nowo odkryte komórki śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych (LLECs) tworzą siatkę pojedynczych komórek w obrębie opon mózgowo-rdzeniowych, wykazując wyraźny wzorzec dystrybucji w porównaniu z komórkami śródbłonka limfatycznego obwodowego1,2. Funkcje komórkowe i implikacje kliniczne związane z LLEC pozostają w dużej mierze niezbadanym terytorium. Aby utorować drogę do badań funkcjonalnych nad LLEC, konieczne jest ustanowienie modelu in vitro do ich badania. W związku z tym w ramach tego badania opracowano kompleksowy protokół izolacji i pierwotnej hodowli LLEC.
Myszy są preferowanym modelem zwierzęcym ze względu na ich przydatność do manipulacji genetycznych w badaniach nad chorobami. Poprzednie badania z powodzeniem wyizolowały komórki śródbłonka limfatycznego z różnych tkanek myszy, w tym węzłów chłonnych3, tkanka krezkowa4, tkanka skórna5, zbierająca limfatykę6, oraz lung tissue7. Te procedury izolacji opierały się przede wszystkim na technikach takich jak sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) i sortowanie metodą cytometrii przepływowej8,9,10. Ponadto wysiłki badawcze doprowadziły do ustanowienia linii komórek pajęczynówki szczura i linii komórek naczyń włosowatych limfatycznych szczurów11,12. Pomimo istnienia technik hodowli eksplantatów dla opon mózgowo-rdzeniowych13, istnieje pilna potrzeba ustandaryzowanego protokołu izolacji i hodowli LLEC. W związku z tym w badaniu tym udało się zebrać i wyhodować LLEC poprzez skrupulatne dysocjowanie opon mózgowych pod kierunkiem mikroskopu i promowanie ekspansji LLEC poprzez zastosowanie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-C (VEGF-C). Charakterystycznym markerem komórek śródbłonka limfatycznego jest receptor hialuronowy naczynia limfatycznego-1 (LYVE-1)14. Ten wieloetapowy protokół selektywnie izoluje LYVE-1-dodatnie LLEC za pomocą MACS, a następnie weryfikuje ich czystość poprzez analizę cytometrii przepływowej i barwienie immunofluorescencyjne.
Podstawowe kroki tego wieloetapowego protokołu można podsumować w następujący sposób: powlekanie kolby, dysocjacja opon mózgowych, trawienie enzymatyczne opon mózgowych, ekspansja komórek, selekcja magnetyczna komórek i późniejsza hodowla LLEC. Wreszcie, czystość wyizolowanych LLEC potwierdza się za pomocą analizy cytometrii przepływowej i barwienia immunofluorescencyjnego. Nadrzędnym celem tego badania jest przedstawienie powtarzalnego, wieloetapowego protokołu izolacji LLEC z mysich opon mózgowo-rdzeniowych i ich późniejszej hodowli in vitro. Protokół ten może znacznie ułatwić badania nad funkcjami komórkowymi i implikacjami klinicznymi LLEC.

<table><tbody><tr><td>Bufor blokowy</td><td>Beyotime</td><td>P0102</td><td>Przechowuj alikwoty w &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td>Solarbio</td><td>C8140</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1041</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>C-3202</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Solarbio</td><td>S9010</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Solarbio</td><td>F8180&nbsp;</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td>V10.8.1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało LYVE-1</td><td>eBioscience</td><td>12-0443-82</td><td>Przechowuj podwielokrotności w &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Separator magnetyczny</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302</td><td>Sterylny przed użyciem</td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak separatora</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>Sterylny przed użyciem</td></tr><tr><td>Mikrogranulki</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Solarbio</td><td>G8430-25g</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1040</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało PDPN</td><td>Santa</td><td>sc-53533</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 4 & stopnie; Przeciwciało C</td></tr><tr><td>PROX1</td><td>Santa</td><td>sc-81983</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Kolumna wyboru&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Sterylny przed użyciem</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>VEGF-C&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab51947</td><td>Przechowuj porcje pod adresem &ndash; 20 &stopni; Przeciwciało C</td></tr><tr><td>VEGFR-3</td><td>Santa</td><td>sc-514825</td><td>Przechowuj porcje w &ndash; 4 & stopnie; Z</td></tr></tbody></table>

zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Komórki śródbłonka limfatycznego (LLEC) to niedawno odkryta populacja komórek wewnątrzczaszkowych o unikalnym rozmieszczeniu, wyraźnie różniącym się od obwodowych komórek śródbłonka limfatycznego. Ich funkcja komórkowa i implikacje kliniczne pozostają w dużej mierze nieznane. W związku z tym dostępność zapasu LLEC ma zasadnicze znaczenie dla prowadzenia badań funkcjonalnych in vitro. Jednak obecnie nie istnieje żaden protokół dotyczący pozyskiwania i hodowli LLEC in vitro.
To badanie z powodzeniem zebrało LLEC za pomocą wieloetapowego protokołu, który obejmował pokrycie kolby fibronektyną, wypreparowanie opon mózgowych za pomocą mikroskopu, enzymatyczne trawienie opon mózgowych w celu przygotowania zawiesiny jednokomórkowej, indukowanie ekspansji LLEC za pomocą czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-C (VEGF-C) i selekcję komórek dodatnich receptora hialuronowego naczyń limfatycznych 1 (LYVE-1) poprzez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Proces ten ostatecznie doprowadził do powstania kultury pierwotnej. Czystość LLEC potwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej, przy czym poziom czystości przekroczył 95%. Ten wieloetapowy protokół wykazał powtarzalność i wykonalność, co znacznie ułatwi badanie funkcji komórkowych i implikacji klinicznych LLEC.

Niniejsze badanie przedstawia powtarzalny, wieloetapowy protokół izolacji limfatycznych komórek śródbłonkowych (LLECs) z myszy i ich późniejszego hodowania w kulturze pierwotnej. in vitroKluczowe etapy obejmują przygotowanie kolby i powlekanie fibronektyną, dysocjację opon miękkich, uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek poprzez trawienie enzymatyczne oraz indukcję ekspansji LLEC za pomocą VEGF-C. Następnie LLEC wykazujące ekspresję LYVE-1 są selektywnie izolowane przy użyciu magnetycznego sortowania komórek (...

Komórki śródbłonka limfatycznego (LLEC), niedawno zidentyfikowany typ komórek wewnątrzczaszkowych, mają słabo poznane funkcje. W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół zbierania LLEC od myszy i tworzenia kultur pierwotnych in vitro. Protokół ten ma na celu umożliwienie naukowcom zagłębienia się w funkcje komórkowe i potencjalne implikacje kliniczne LLEC.

Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Ten innowacyjny protokół został zaprojektowany do uprawy LLEC przez innych badaczy, tylko wynaczynionych. Opracowaliśmy wielozadaniową procedurę do zbioru i hodowli pierwotnych LLEC in vitro. Nasz protokół ostatecznie doprowadził do ustanowienia pierwotnej hodowli LLEC o poziomie czystości przekraczającym 95%Obecnie nie istnieje żaden protokół zbioru i hodowli LLEC in vitro.Nasze wyniki torują drogę do dalszych badań nad podobną funkcją LLEC in vitro. LLEC są powodem do odkrycia wewnątrzczaszkowej populacji komórkowej, biologicznego znaczenia LLEC bezpiecznego roku. Przeprowadzimy dalsze badania nad funkcją komórkową i ujawnimy ich implikacje kliniczne.Na początek ostrożnie naciąć skórę ofiarowanej myszy, zaczynając od otworu czaszki i rozciągając się w kierunku obszaru czołowego. Za pomocą nożyczek delikatnie podnieś i wyjmij czaszkę, nie uszkadzając opon mózgowych, zbierając cały mózg. Zanurz cały mózg w buforze płuczącym i delikatnie go przepłucz, aby usunąć krew z powierzchni.Przenieś mózg na sterylną szalkę Petriego bez siekania. Następnie, pod mikroskopem, użyj cienkiej pęsety, aby wydobyć opony mózgowe z powierzchni mózgu. Za pomocą sterylnych mikronożyczek pokrój tkankę opon mózgowo-rdzeniowych na fragmenty.Przygotuj mieszankę enzymów trawiennych przy użyciu podanych składników. Dodaj 10 mililitrów mieszanki do fragmentów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Delikatnie zamieszaj, aby oderwać fragmenty od dna tuby.Następnie dodaj 10 mililitrów buforu zatrzymującego. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I za pomocą pipety ostrożnie usuń supernatant.Dodaj 10 mililitrów zimnego PBS i przefiltruj wszelkie grudki przez sitko o średnicy 70 mikronów do sterylnej probówki o średnicy 50 mililitrów. Płytkę od 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy do kolby T25 pokrytej fibronektyną z pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.Po inkubacji zastąp pożywkę świeżą pożywką, aby wyeliminować nieprzyłączone komórki. Zacznij od przymocowania separatora magnetycznego do podstawy. Podłącz kolumnę selekcyjną do separatora magnetycznego i umieść sitko o średnicy 70 mikronów na górze kolumny selekcyjnej.Umieść rurkę o pojemności 50 mililitrów pod kolumną wyboru, aby zebrać przepływ. Gdy komórki mózgowe myszy osiągną 80% konfluencji, odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS. Dodaj 0,25% trypsyny, aby oderwać przylegające komórki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie dodaj bufor zatrzymujący. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 g przez pięć minut i usunąć supernatant. W przypadku barwienia przeciwciał ponownie zawieś od 10 do 7 komórek w 100 mikrolitrach PBS.Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu przeciwciała LYVE-1 i dokładnie wymieszaj. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji odwirować komórki i wyrzucić supernatant.Następnie przepłucz komórki, dodając jeden mililitr PBS i odwirowując przy 300 g przez pięć minut. W przypadku etykietowania mikrogranulek należy ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach PBS i 20 mikrolitrach mikrogranulek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie odwirować zawiesinę i przepłukać granulat jednym mililitrem PBS. Ponownie odwiruj i ponownie zawieś osad w czterech mililitrach PBS w celu wykluczenia ujemnego magnetycznie. Przepuść zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 mikronów, aby wyeliminować grudki.Przygotuj kolumnę selekcyjną, przepłukując ją trzema mililitrami PBS. Następnie dodaj zawieszenie komórek do kolumny wyboru. Umyj kolumnę trzema mililitrami PBS i zbierz ujemne komórki LYVE-1 do 50-mililitrowej probówki.W celu pozytywnej selekcji magnetycznej należy odpipetować sześć mililitrów PBS do kolumny selekcyjnej. Następnie przepłucz magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny selekcyjnej, aby uzyskać dodatnie LLEC LYVE-1. Następnie odwirować dodatnią zawiesinę komórek i usunąć supernatant.Płytkę od 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy do kolby T-25 z pięcioma mililitrami pożywki hodowlanej. Utrzymuj kulturę, wymieniając 50% pożywki co drugi dzień. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, odłącz je, jak wykazano wcześniej, przed wykonaniem pasażu komórkowego.Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że odsetek komórek LYVE-1 dodatnich w pasażu drugim nie różnił się znacząco od pasażu trzeciego po maksimum, co wskazuje na czystość większą niż 95%Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło barwienie LYVE-1 z PDPN, VEGFR-3 i PROX1, ustalając tożsamość LLEC. Komórki LYVE-1 dodatnie nie wykazywały ekspresji F4/80 i płytkowego czynnika wzrostu beta. Skuteczne odróżnianie LLEC od makrofagów i fibroblastów.Komórki opon mózgowo-rdzeniowych przed maksimum wykazywały niejednorodną morfologię, od okrągłych kulek po zrośnięte kształty włókien. Jednak post max, LLEC wykazywały typowe cechy przypominające śródbłonek, takie jak kształty wrzeciona i kostki brukowej.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Protokół hodowli eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego jest technicznie solidnym i prostym sposobem na uzyskanie fibronektynowo-dodatnich fibroblastów opon mózgowych w ciągu 6-8 tygodni i kriokonserwację około 20-30 milionów komórek.

Pochodzenie kultur eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu

Opisujemy iniekcję domostkową, która wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, która może być stabilizowana do czaszki, eliminując w ten sposób ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Podejście to może być wykorzystane do genetycznego mapowania losów i manipulacji komórkami opon mózgowo-rdzeniowych oraz do śledzenia ruchów płynu mózgowo-rdzeniowego.

Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie domostkowe

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Opisany tutaj protokół podkreśla główne etapy różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z mózgo-podobnych komórek śródbłonka, przygotowanie Neisseria meningitidis do infekcji oraz pobieranie próbek do innych analiz molekularnych.

Neisseria meningitidis Zakażenie indukowanych pluripotencjalnych komórek śródbłonka mózgu pochodzących z komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Ten artykuł opisuje protokół namnażania komórek nowotworowych krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF-CTC) pobranych od pacjentów z chorobą oponowo-rdzeniową związaną z czerniakiem (M-LMD) w celu opracowania modeli przedklinicznych do badania M-LMD.

Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych z myszy. Protokół zapewnia czystość powyżej 95%, umożliwiając badanie funkcji komórkowych LLEC in vitro.

Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Przeglądaj więcej filmów