Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją
May 1st, 2015
Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego o wysokiej czystości, które wyściełają naczynia limfatyczne ludzkich malformacji limfatycznych i napletków, przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Osiąga się to najpierw poprzez enzymatyczne trawienie próbki tkanki pacjenta. W drugim etapie zawiesina jednokomórkowa jest hodowana w celu wzbogacenia liczby komórek śródbłonka limfatycznego.
W próbie. Komórki są następnie znakowane przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki będącym przedmiotem zainteresowania i sortowane za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Ostatecznie napletek i malformacje limfatyczne, komórki śródbłonka limfatycznego mogą być namnażane w hodowli komórkowej w celu dalszej analizy.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że sortowanie komórek aktywowane fluorescencją sprawia, że komórki mają czystość większą niż 99%, co pozwala uniknąć problemów związanych z utratą komórek śródbłonka limfatycznego z powodu przerostu przez zanieczyszczenie komórek. Zacznij od zważenia 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki, uzupełnionej antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym. Następnie przenieś malformację limfatyczną lub cztery próbki skóry do probówki i ponownie zważyć probówkę, aby określić masę tkanki.
Następnie, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej, użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść tkankę i pożywkę do 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej za pomocą sterylnych nożyczek. Na koniec zmiel tkankę na milimetrowe kawałki sześcienne. Następnie przenieś kawałki do 50-mililitrowej probówki z 10 mililitrami świeżego antybiotyku przeciwgrzybiczego. Średni.
Zakręć probówką kilka razy, aby ponownie zawiesić tkankę, a następnie odwiruj próbkę. Po usunięciu supernatantu dodać jeden mililitr roztworu do wstępnego roztwarzania na 100 miligramów tkanki mielonej i inkubować tkankę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wytrząsaniem przy 200 obr./min W celu pomyślnego wzbogacenia komórek śródbłonka limfatycznego. Bardzo ważne jest, aby rozpoznać, kiedy komórki zostały wystarczająco wystawione na reakcję kolagenazy i dysprzestrzeni, aby przetrwały izolację.
Osiąga się to poprzez dokładne monitorowanie procesu trawienia tkanek i zatrzymywanie reakcji, gdy większość tkanek zostanie strawiona na drobne fragmenty. Pod koniec inkubacji upewnij się, że prawie cała tkanka została strawiona na małe fragmenty i przefiltruj zawiesinę tkankową przez sitko o średnicy 70 mikronów do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Teraz użyj trzymililitrowego tłoka strzykawki z gumowym tłokiem, aby zmielić pozostałą tkankę, aż zaobserwuje się tylko niewielkie ślady macierzy zewnątrzkomórkowej.
Następnie umyj sitko komórkowe objętością pożywki z komórek śródbłonka równą objętości pożywki enzymu dysocjującego i odwiruj komórki reus. Zawiesić osad w maksymalnie 20 mililitrach podłoża z komórek śródbłonka, w zależności od wielkości próbki. Następnie po policzeniu nasion, dwa razy 10 do sześciu komórek w kolbie o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych wstępnie zakodowanej fibronektyną w końcowej objętości 20 mililitrów pożywki z komórek śródbłonka do hodowli przez noc
.Następnego ranka zmyj niezwiązane komórki trzema płukaniami PBS uzupełnionym antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym. Następnie, aby zwiększyć liczbę komórek śródbłonka limfatycznego, dodaj świeże podłoże z komórek śródbłonka do komórek i inkubuj kulturę przez pięć do siedmiu dni, aż kultura będzie zlewać się w około 80%. Barwienie komórek do sortowania za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.
Najpierw usuń pożywkę komórkową, umyj komórki trzy razy w PBS. Następnie dodać siedem mililitrów roztworu oddzielającego po pięciu do siedmiu minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zbierz zdysocjowane komórki, dezaktywuj enzymy za pomocą trzech objętości pożywki dla komórek śródbłonka i przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej probówki.
Odwirować komórki trzykrotnie, przemywając osad w pięciu mililitrach PBS na drugi i trzeci wir po ostatnim praniu. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżego PBS i policzyć liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trianowego. Po zliczaniu komórek.
W asepcie przenieś komórki do probówek barwiących cytometrii przepływowej i odwiruj komórki, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Ponownie zawiesić komórki w 5% F-B-S-P-B-S i inkubować na lodzie przez 20 minut. Po zablokowaniu wirówki komórki usuwają supernatant i resus.
Zawiesić osad w CD 34, CD 31 potaninie i koktajlu przeciwciał trzech receptora VEGF. Po 20 minutach na lodzie umyj komórki trzy razy w dwóch mililitrach F-B-S-P-B-S, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała i resus. Zawiesić osad w 300 mikrolitrach jodku propydyny w roztworze F-B-S-P-B-S na lodzie.
Na koniec posortuj oczyszczone ludzkie komórki śródbłonka limfatycznego na wieloparametrowym przyrządzie do sortowania komórek aktywowanym fluorescencją. Następnie odwiruj posortowane komórki i ponownie zawiesij granulki w odpowiednim podłożu do wysiewu kultur komórkowych. Tutaj pokazano normalne ludzkie naczynia limfatyczne i malformacje limfatyczne oznaczone przeciwciałem przeciwko deplane doniczki, zwracając uwagę na wyraźne rozszerzenie i znaczną różnicę wielkości światła w ludzkich naczyniach malformacji limfatycznej.
Rzeczywiście, większość malformacji limfatycznych zawiera zarówno małe lub mikrotorbielowate, jak i duże lub makrotorbielowate nieprawidłowe struktury torbielowate po początkowym trawieniu tkanek i 24-godzinnej hodowli w niefrakcjonowanych próbkach. Oprócz komórek podobnych do fibroblastów i komórek mięśni gładkich można zaobserwować odrębne kolonie komórek śródbłonka po sortowaniu i kolejnych 24 godzinach w hodowli komórkowej. Jednak CD 34, niski CD 31-dodatni receptor VEGF trzy dodatnie komórki podo i dodatnie komórki przyczepione do pojemnika hodowlanego i wykazują typową morfologię bruku obserwowaną na tych obrazach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować z wysoką czystością komórkę śródbłonka limfatycznego, która wyściela ludzką malformację limfatyczną i naczynia limfatyczne całej skóry za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Nie zapominaj, że praca z pierwotną tkanką ludzką może być niebezpieczna, ponieważ może zawierać czynniki zakaźne szkodliwe dla zdrowia ludzkiego. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować standardowe środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół ma na celu izolację komórek śródbłonka limfatycznego o wysokiej czystości z ludzkich malformacji limfatycznych i napletków za pomocą sortowania komórek z aktywacją fluorescencji (FACS). Proces obejmuje enzymatyczne trawienie próbek tkankowych i następującą hodowlę komórek w celu wzbogacenia śródbłonka limfatycznego do dalszej analizy.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Biologia naczyń
Tło
- Komórki śródbłonka limfatycznego są kluczowe dla zrozumienia malformacji limfatycznych.
- Sortowanie komórek z aktywacją fluorescencji (FACS) pozwala na izolację określonych typów komórek.
- Techniki hodowli komórek umożliwiają ekspansję izolowanych komórek dla badań.
- Zrozumienie tych komórek może prowadzić do wnikliwszego poznania różnych chorób.
Cel badania
- Izolacja komórek śródbłonka limfatycznego z ludzkich tkanek.
- Ulepszenie podejść eksperymentalnych do badania cech genetycznych i proteomicznych.
- Ułatwienie badań funkcjonalnych i różnicowania komórek.
Stosowane metody
- Enzymatyczne trawienie próbek tkankowych w celu utworzenia zawiesiny pojedynczych komórek.
- Hodowla zawiesiny pojedynczych komórek w celu wzbogacenia komórek śródbłonka limfatycznego.
- Oznaczanie komórek przeciwciałami ukierunkowanymi na określone markery powierzchniowe.
- Sortowanie komórek za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek z aktywacją fluorescencji.
Główne wyniki
- Udana izolacja komórek śródbłonka limfatycznego o wysokiej czystości.
- Wzbogacanie komórek śródbłonka limfatycznego poprzez techniki hodowli.
- Przygotowanie komórek do dalszej analizy.
- Możliwość dalszych badań nad malformacjami limfatycznymi.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę izolacji komórek śródbłonka limfatycznego.
- Izolowane komórki mogą być wykorzystywane do różnych badań eksperymentalnych.
- To podejście zwiększa zrozumienie zaburzeń układu limfatycznego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells enables mechanistic de-risking of lymphatic malformation targets and supports predictive confidence in early discovery. This method provides a disease-relevant system for target validation and assay development in vascular biology. The high-purity output facilitates translational biomarker screening and preclinical model generation for rare lymphatic disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lymphatic endothelial phenotype in diseased and healthy human tissue.
- Operational Value: Provides a purified cellular substrate for target engagement and pathway analysis.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation in rare vascular disorders with limited biological insight.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized lymphatic endothelial cells for reproducible assay formats.
- Operational Value: Yields >99% pure cells, reducing variability in downstream compound screening.
- Strategic Value: Enables scalable production of disease-relevant cells for high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of lymphatic malformation pathophysiology.
- Operational Value: Provides expanded cells for functional validation and biomarker discovery.
- Strategic Value: Facilitates preclinical de-risking of lymphatic-targeted therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated lymphatic endothelial cells serve as a discovery biology tool that enables target validation and pathway clarification in vascular therapeutics.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by providing pure human lymphatic endothelial cells for target interrogation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, high-purity cell production for compound evaluation.
- Analytics: Facilitates quantitative readouts via flow cytometry and functional assays on sorted populations.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through expanded cells for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for lymphatic endothelial cell sourcing across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through disease-relevant human cellular models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via FACS-based isolation with >99% purity.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk through early mechanistic de-risking of lymphatic targets.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of lymphatic malformation therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation and multi-parameter flow cytometry.
- Dependent on access to FACS instrumentation and antibody panels for CD34, CD31, VEGFR-3, and PODOPLANIN.
- Necessitates sterile tissue handling and biosafety cabinet protocols for primary human samples.
- Requires optimization of digestion times to balance cell yield and viability across tissue types.
- Dependent on fibronectin-coated culture surfaces for lymphatic endothelial cell adhesion and expansion.
