Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie o wysokiej czystości komórek śródbłonka limfatycznego wyścielających naczynia limfatyczne w malformacjach limfatycznych człowieka oraz w skórkach Stuleya, przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Jest to osiągane najpierw poprzez enzymatyczne trawienie próbki tkanki pacjenta. W drugim kroku zawiesina pojedynczych komórek jest hodowana w celu zwiększenia liczby komórek śródbłonka limfatycznego.

W próbce. Następnie komórki znakuje się przeciwciałami przeciwko interesującym markerom powierzchni komórkowych i sortuje za pomocą wieloparametrycznego sortowania komórek metodą fluorescencyjnej aktywacji. Ostatecznie komórki śródbłonka limfatycznego z napletka i malformacji limfatycznej mogą być namnażane w hodowli komórkowej w celu dalszych analiz.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że sortowanie komórek aktywowane fluorescencją pozwala na uzyskanie populacji komórek o czystości przekraczającej 99%, co eliminuje problemy związane z utratą limfatycznych komórek śródbłonkowych na skutek przerostu komórek zanieczyszczających. Należy rozpocząć od zważenia probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki uzupełnionej o roztwór antybiotyk-antymykotyk. Następnie należy przenieść malformację limfatyczną lub próbkę skóry do probówki i ponownie zważyć probówkę, aby określić masę tkanki.

Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, za pomocą sterylnej pęsety i sterylnych nożyczek przenieś tkankę oraz pożywkę do 100 mm szalki do hodowli tkanek. Na koniec posiekaj tkankę na fragmenty o wielkości 1 mm³. Następnie przenieś te fragmenty do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml świeżej pożywki z antybiotykiem i antymykotykiem.

Kilka razy zakręć probówką, aby resuspender tkankę, a następnie odwiruj próbkę. Po usunięciu supernatantu dodaj jeden mililitr uprzednio podgrzanego roztworu do trawienia na każde 100 miligramów rozdrobnionej tkanki i inkubuj tkankę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy stałym wstrząsaniu z prędkością 200 RPM w celu skutecznego wzbogacenia w komórki śródbłonka limfatycznego. Kluczowe jest rozpoznanie momentu, w którym komórki były wystawione na działanie kolagenazy i reakcji dyspazji wystarczająco długo, aby przetrwały proces izolacji.

Osiąga się to poprzez uważne monitorowanie procesu trawienia tkanki i przerwanie reakcji w momencie, gdy większość tkanki zostanie rozłożona na drobne fragmenty. Po zakończeniu inkubacji należy potwierdzić, że prawie cała tkanka została strawiona do postaci małych fragmentów, a następnie przefiltrować zawiesinę tkankową przez sito o oczkach 70 µm do sterylnej probówki o pojemności 50 mL. Następnie należy użyć tłoka strzykawki 3 mL z gumowym tłoczkiem, aby rozetrzeć pozostałą tkankę, aż do momentu, gdy zaobserwowane zostaną jedynie niewielkie ślady macierzy zewnątrzkomórkowej.

Następnie przemyj sitko do komórek objętością pożywki dla komórek śródbłonka równą objętości pożywki z enzymem dysocjującym i ponownie odwiruj komórki. Resuspenduj osad w maksymalnie 20 ml pożywki dla komórek śródbłonka, w zależności od wielkości preparatu. Następnie, po policzeniu, wysiej 2 × 10⁶ komórek do kolby o powierzchni 150 cm², uprzednio pokrytej fibonektyną, w końcowej objętości 20 ml pożywki dla komórek śródbłonka i inkubuj przez noc.

Następnego dnia należy wypłukać niezwiązane komórki, trzykrotnie płucząc je buforem PBS z dodatkiem roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Następnie, aby zwiększyć liczbę komórek śródbłonka limfatycznego, należy dodać do komórek świeżą pożywkę dla komórek śródbłonka i inkubować hodowlę przez pięć do siedmiu dni, aż osiągnie ona około 80% konfluencji. Następnie należy poddać komórki barwieniu w celu sortowania za pomocą wieloparametrycznej fluorescencyjnej aktywowanej sorterem komórek.

Najpierw usunąć medium hodowlane i trzykrotnie przemyć komórki w PBS. Następnie dodać siedem mililitrów roztworu do odrywania po inkubacji przez pięć do siedmiu minut w temperaturze 37 °C. Zebrać zdysocjowane komórki, inaktywować enzymy za pomocą trzech objętości medium do komórek śródbłonka i przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki.

Odwiruj komórki trzykrotnie, płukając osad w 5 ml PBS podczas drugiego i trzeciego wirowania po ostatnim płukaniu. Resuspenduj osad w 5 ml świeżego PBS i policz liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu. Po policzeniu komórek.

Aseptycznie przenieś komórki do probówek do barwienia w cytometrii przepływowej i odwiruj je, aby zablokować nieswoiste wiązanie. Resuspenduj komórki w 5% F-B-S-P-B-S i inkubuj na lodzie przez 20 minut. Po wirowaniu blokującym usuń nadsącz i resuspenduj komórki.

Resuspend osad w koktajlu przeciwciał przeciwko CD 34, CD 31 i receptorowi VEGF 3. Po 20 minutach w temperaturze lodowej przemyj komórki trzykrotnie w dwóch mililitrach roztworu F-B-S-P-B-S, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, i ponownie zcentryfuguj. Resuspend osad w 300 µL jodku propidyny w roztworze F-B-S-P-B-S w temperaturze lodowej.

Na koniec przeprowadź sortowanie oczyszczonych ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrycznego sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Następnie odwirowuj posortowane komórki i resuspenduj osad w odpowiednim medium do wysiewu kultur komórkowych. Tutaj przedstawiono normalne ludzkie naczynia limfatyczne oraz naczynia z malformacją limfatyczną, znakowane przeciwciałem przeciwko podplaninie; zwróć uwagę na wyraźne rozszerzenie i znaczne zróżnicowanie wielkości światła w obrębie ludzkich naczyń z malformacją limfatyczną.

Rzeczywiście, większość malformacji limfatycznych zawiera zarówno małe lub mikrocystyczne, jak i duże lub makrocystyczne nieprawidłowe struktury cystyczne po początkowym trawieniu tkanki i 24 godzinach hodowli w próbkach niefrakcjonowanych. Po sortowaniu i kolejnych 24 godzinach hodowli komórkowej można zaobserwować wyraźne kolonie komórek śródbłonka oprócz komórek fibroblastopodobnych i komórek mięśni gładkich. Jednak komórki CD 34, nisko CD 31 dodatnie, VEGF receptor three dodatnie, podoplanina dodatnie przylegają do naczynia hodowlanego i wykazują typową morfologię brukowaną widoczną na tych obrazach.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat tego, jak z wysoką czystością wyizolować komórki śródbłonka naczyń limfatycznych wyściełające ludzkie malformacje limfatyczne oraz pełne naczynia limfatyczne skóry, wykorzystując fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS). Należy pamiętać, że praca z pierwotną tkanką ludzką może być niebezpieczna, ponieważ może ona zawierać czynniki zakaźne szkodliwe dla zdrowia ludzi. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać standardowych środków ostrożności, takich jak stosowanie rękawiczek, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.