Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Badania naszej grupy koncentrują się na nakreśleniu mechanizmów regulujących fizjologię komórek śródbłonka. Protokół ten opisuje metodę izolacji komórek śródbłonka nerki za pomocą kulek magnetycznych, w szczególności z termicznych naczyń włosowatych limfatycznych w obiektach, w których sortowanie komórek aktywowane fluorescencją nie jest dostępne. Protokół pozwala na izolację komórek śródbłonka limfatycznego od myszy transgenicznych w celu zbadania ich fizjologii in vitro.

Jest szczególnie przydatny tam, gdzie czystość komórek śródbłonka limfatycznego może być zagrożona w dalszych zastosowaniach. Proces ten zapewnia wysoką wydajność komórek śródbłonka limfatycznego pozyskiwanych z naczyń włosowatych limfatycznych, a nie z innych naczyń zbiorczych. Jest to również fajna alternatywa w przypadku braku urządzeń do sortowania komórek.

Wykonaj protokół w komorze bezpieczeństwa biologicznego na uśpionej myszy, odpowiednio ogolonej i zdezynfekowanej 70% etanolem. Wykonaj 0,5-calowe powierzchowne nacięcie w brzuchu zwierzęcia za pomocą nożyczek. Przeciąć wzdłuż linii środkowej w kierunku szyi i podbrzusza.

Dodatkowo wykonaj boczne nacięcia, aby otworzyć klapę skóry. Za pomocą kleszczy delikatnie oddziel skórę od otaczających tkanek, jednocześnie okrążając tułów zwierzęcia, przecinając skórę bocznie wokół szyi i podbrzusza. Ostrożnie umieść skórę stroną ze skórą właściwą skierowaną w dół w 100-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej i upewnij się, że skóra jest tak rozciągnięta, jak to możliwe.

Na sześć mililitrów roztworu dispazy do płytki, upewniając się, że skóra jest całkowicie pokryta, a następnie przykryj płytkę. Owiń płytkę Parafilmem. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby spłaszczyć eksplantat.

Następnego dnia za pomocą pipety usunąć płyn z płytki zawierającej odizolowaną skórę. Następnie za pomocą kleszczy oddzielić skórę właściwą od naskórka, usuwając z niej widoczną tkankę tłuszczową, a izolowaną skórę właściwą umieścić na czystej płytce do hodowli tkankowej. Dodaj jeden mililitr DMEM zawierającego 1x antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy do skóry właściwej na płytce hodowlanej.

Przechyl płytkę, aby zgromadzić płyn po jednej stronie płytki. Następnie zmiel skórę właściwą na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów kwadratowych i przenieś je do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 10 mililitrów roztworu kolagenazy typu II do probówki.

Inkubuj go przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym mieszaniem przy 30 do 50 obr./min, aby strawić skórę właściwą. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 mikronów i odwirować je w temperaturze 250 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM zawierającego antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy.

Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 mikronów przed odwirowaniem, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić powstałą osadkę komórkową w jednym mililitrze kompletnego podłoża LEC. Następnie umieść komórki w kompletnych pożywkach LEC na pokrytej kolagenem 60-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej.

Wymieniaj pożywkę co dwa dni, dwukrotnie myjąc ogniwa PBS i dodając świeże podłoże LEC. Obrazy o małym powiększeniu komórek wyizolowanych z mysiej skóry właściwej wykazały mieszaną populację komórek. Aby oczyścić mysie komórki śródbłonka limfatycznego, użyj komórek wyizolowanych z mysiej skóry właściwej po osiągnięciu około 80 do 90% zbiegu.

Zacznij od umycia wstępnie powlekanych kulek magnetycznych w separatorze magnetycznym przy użyciu jednego mililitra roztworu do powlekania kulek magnetycznych. Ponownie zawiesić kulki w 150 mikrolitrach DMEM, zawierających 0,1% BSA. Następnie umyj komórki na 60-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej dwukrotnie za pomocą PBS.

Wymieszaj 50 mikrolitrów kulek sprzężonych z przeciwciałami z trzema mililitrami DMEM zawierającymi 0,1% BSA i dodaj do komórek. Uszczelnij naczynie parafilmem. Następnie inkubuj naczynie na shakerze, mieszając z prędkością 10 obr./min w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut.

Wyrzuć pożywkę przed jednokrotnym umyciem komórek PBS. Szybko sprawdź komórki, aby zweryfikować obecność kolonii LEC na płytce. Dodaj jeden mililitr trypsyny EDTA do komórek i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby trypsynizować komórki.

Sprawdź komórki pod kątem pomyślnego odłączenia komórek. Po zneutralizowaniu roztworu dwoma mililitrami kompletnej pożywki LEC, przenieś roztwór komórek do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności pięciu mililitrów. Za pomocą separatora magnetycznego umyj komórki trzema mililitrami DMEM zawierającym 0,1% BSA, aby usunąć niezwiązane komórki.

Ponownie zawiesić pozostałe komórki związane z kulkami w kompletnych pożywkach LEC i umieścić je na pokrytych kolagenem 60-milimetrowych płytkach do hodowli tkankowych. Obrazowanie w jasnym polu i fluorescencji z łatwością zidentyfikowało komórki śródbłonka limfatycznego LYVE1 dodatnie po oczyszczeniu i wykazało kilka przymocowanych do nich koralików. Komórki wykazywały niską konfluencję 24 godziny po oczyszczeniu, podczas gdy były wysoce zlewające się siedem dni po oczyszczeniu.