Name: Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek nowotworowych z płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów z czerniakiem. Technika ta umożliwia badanie biologii choroby opon mózgowo-rdzeniowych i rozwój nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować pacjentom i ich rodzinom za niezwykłą hojność w oddawaniu tkanek do tego badania naukowego. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health: granty P50 CA168536, R21 CA256289, R21 CA216756 (dla KSMS i PAF), K99 CA226679 (dla IS). Moffitt Foundation Research Accelerate Fund (do BC i PAF), Moffitt Chemical Biology & Molecular Medicine Program (PAF i DD), Moffitt Foundation (PAF). Molecular Genomics, Tissue, and Bioinformatics & Biostatistics Shared Resource Cores w Moffitt jest częściowo wspierany przez National Cancer Institute poprzez Cancer Center Support Grant (P30-CA076292) oraz Moffitt Foundation.

Zbiór zanonimizowanych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Południowej Florydy (MCC 50103, 50172 i 19332). Pacjenci z M-LMD mogą być zdiagnozowani na kilka sposobów, w tym dodatnia cytologia płynu mózgowo-rdzeniowego, charakterystyczny rezonans magnetyczny (MRI) mózgu i/lub kręgosłupa lub połączenie objawów klinicznych z sugestywnymi wynikami MRI. Płyn mózgowo-rdzeniowy od tych pacjentów z M-LMD był rutynowo pobierany w ramach ich standardowej opieki klinicznej. Żaden zabieg nie jest wykonywany, chyba że istnieją wskazania kliniczne. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów na pobranie próbek i wykorzystanie ich do badań i publikacji. Generacja mysich modeli LMD in vivo została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Florydy (IACUC# IS00010398). Ogólny schemat tego protokołu jest podsumowany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie nośnika kondycjonowanego przez HMC
<ol>
	<li>Wstępnie pokryć kolbę T175 poli-l-lizyną w stężeniu 2 μg/cm2.</li>
	<li>Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Odessać roztwór poli-l-lizyny za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Nie jest wymagane płukanie kolby i jest ona gotowa do posiewu HMC.</li>
	<li>Posiew około 1,0 x 106 HMC w 30 ml kompletnej pożywki do hodowli opon mózgowo-rdzeniowych (MenCM), która zawiera 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1% suplementu wzrostu komórek oponowych i 100 j.m./ml roztworu antybiotyku penicylina-streptomycyna w kolbie. Hodować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w standardowych warunkach hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj nośniki co 3 dni.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną około 75%-80% konfluencji, zbierz i zapisz pożywkę hodowlaną HMC w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Podziel HMC na nowe kolby T175 i świeże kompletne MenCM, jeśli potrzeba więcej pożywek do hodowli HMC.</li>
	<li>Do pożywek hodowlanych HMC dodaj stosunek 1:1 kompletnego MenCM.</li>
	<li>Dodaj 20 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) i 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), które staną się pożywką kondycjonowaną przez HMC dla CSF-CTCs. 
	UWAGA: Zaleca się dodawanie świeżych FGF i EGF, gdy CTC są gotowe do hodowli.</li>
	<li>Przechowywać pożywki kondycjonowane pod kątem HMC w podwielokrotnościach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zaleca się, aby podłoża kondycjonowane przez HMC w porcjach były przechowywane w temperaturze 4 °C, ale nie dłużej niż 4 tygodnie.</li>
</ol>
2. Zbieranie płynu mózgowo-rdzeniowego i przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Odwirować wstępnie schładzać, ustawiając ją na 4 °C.</li>
	<li>Po pobraniu od pacjenta natychmiast umieść próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie, aby była chłodna. 
	UWAGA: Nasz zatwierdzony przez IRB protokół umożliwia pobranie 7,5 ml płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjenta, który wyraził na to zgodę.</li>
	<li>Odwirować płyn mózgowo-rdzeniowy przy 257 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń, zapisz i wykonaj porcje supernatantu płynu mózgowo-rdzeniowego bez naruszania osadu komórkowego na dnie. Podwielokrotności supernatantu płynu mózgowo-rdzeniowego można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C, jeśli jest to konieczne do dalszej analizy. 
	UWAGA: Śrut może nie być widoczny gołym okiem; dlatego sugeruje się pozostawienie ~40-50 μL na dnie tuby.</li>
	<li>Do tej samej probówki dodać 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w celu ponownego zawieszenia i przepłukania komórek, a następnie powtórzyć wirowanie przy 257 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: (Opcjonalnie) Wykonaj lizę krwinek czerwonych (RBC), jeśli próbka zawiera zanieczyszczenie krwi. Należy jednak pamiętać, że niektóre komórki mogą zostać utracone podczas procesu, w tym CTC. CTC mogą być rozmnażane bez procedury lizy RBC.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć PBS bez naruszania osadu komórkowego i pozostaw ~50 μl na dnie.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek, aby określić ich żywotność. W tym miejscu istnieją dwie opcje kontynuowania hodowli CSF-CTC: hodowla in vitro (krok 3) lub próba ekspansji ksenoprzeszczepu in vivo pochodzącego od pacjenta (krok 4). 
	UWAGA: Jeśli CSF-CTC mają być hodowane w późniejszym czasie, należy kriokonserwować komórki w pożywce do zamrażania kultur komórkowych, aż będą gotowe do rozmnażania. Pożywki do zamrażania kultur komórkowych można wykonać przy użyciu 90% FBS + 10% DMSO. Jeśli nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego jest dostępny (tj. więcej niż jeden pobrany płyn mózgowo-rdzeniowy od pacjentów lub płyn mózgowo-rdzeniowy jest pobierany podczas autopsji), CTC można ocenić, przesyłając próbkę do testu liczenia CTC 17 lub barwienia immunofluorescencyjnego (IF) dla markera czerniaka (tj. anty-MLANA), co może dostarczyć informacji na temat ilości i żywotności CTC. Komórki nie mogą być odzyskane po przeprowadzeniu tych eksperymentów. Dlatego nie zaleca się, jeśli nie ma zapasowych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjenta.</li>
</ol>
3. Hodowla in vitro i ekspansja CSF-CTC
<ol>
	<li>Ponowne zawieszenie CSF-CTC w nośniku kondycjonowanym przez konsolę HMC. Jeśli CSF-CTC są kriokonserwowane, rozmrozić komórki, obrócić je i delikatnie umyć PBS.</li>
	<li>Podziel wszystkie komórki w potrójnych dołkach na 96-dołkowej płytce o objętości 150 μl na studzienkę. Tylko żywe komórki będą lekko przylegać do powierzchni przez noc. 
	UWAGA: Liczba płynów mózgowo-rdzeniowych może się znacznie różnić w zależności od próbki pobranej przez jednego pacjenta (Tabela 1). W przypadku pacjentów z niską liczbą CTC jako punkt wyjścia do hodowli stosuje się 96-dołkową płytkę, a cały osad jest posiewany bez liczenia w obawie przed utratą CTC. Jeśli jednak ilość płynu mózgowo-rdzeniowego jest większa (tj. uzyskana z autopsji), możliwe jest policzenie komórek. Nie wszystkie komórki nowotworowe mogą rosnąć ex vivo; Niektóre będą się powoli rozszerzać przez kilka przejść, zanim staną się statyczne. Obecnie szansa na powodzenie hodowli czerniaka CSF-CTC ex vivo wynosi około 60%7.</li>
	<li>Co 3 dni uzupełniaj, dodając świeże podłoże kondycjonowane przez konsolę HMC lub delikatnie usuń pożywkę, umieszczając końcówkę pipety z boku studzienki, pozostawiając trochę płynu bez naruszania dna studzienki, a następnie zastąp ją świeżą pożywką kondycjonowaną przez konsolę HMC.</li>
	<li>Gdy ex vivo CSF-CTC rozszerzają się i stają się zlewające w 90%, trypsynizuj i przenieś całą studzienkę do nowej studzienki na 24-dołkowej płytce. Gdy studzienka w 24-dołku zlewa się, przenieś ją na płytkę 12-dołkową, a następnie na płytkę 6-dołkową i tak dalej. 
	UWAGA: Po trypsynizacji należy rozważyć kriokonserwację niewielkiego podzbioru CTC w pożywkach do zamrażania kultur komórkowych (10% DMSO + 90% FBS) przed posiewem jako zapasowym.</li>
	<li>Kontynuuj hodowlę CTC. Niektóre komórki mogą rozmnażać się przez krótki czas i ostatecznie stać się statyczne. Jednak jeden lub więcej klonów może przekształcać się i rozszerzać wykładniczo (Rysunek 2A). Wybierz te klony, które staną się hodowlami CSF-CTC (PD-CSF-CTCs) pochodzącymi od pacjenta in vitro. 
	UWAGA: Jeśli te klony staną się przepełnione lub skupią się, trypsynizuj i ponownie umieść komórki na świeżej płytce/kolbie do hodowli tkankowej.</li>
</ol>
4. Inokulacja in vivo CSF-CTC w celu wygenerowania modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego z linii komórkowej (CDX) lub ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX)
UWAGA: Model PDX polega na wszczepieniu komórek nowotworowych bezpośrednio od pacjenta z rakiem (bez hodowli ex vivo), podczas gdy model CDX wykorzystuje linie komórek rakowych lub, w tym przypadku, CTC, które zostały rozmnożone i unieśmiertelnione18.
<ol>
	<li>Użyj 6-8 tygodni samic myszy NOD SCID gamma (NSG) w wieku 6-8 tygodni do inokulacji CSF-CTC. NSG są używane, ponieważ mają poważny niedobór odporności i są bardzo podatne na wszczepienie ludzkich komórek nowotworowych19. Ze względu na niedobory odporności myszy te powinny być trzymane w ściśle kontrolowanym środowisku higienicznym i powinny być trzymane w izolacji od innych szczepów myszy. Metoda renderowania mysiego LMD została szczegółowo opisana w innym miejscu20. 
	UWAGA: do wygenerowania modelu PDX wykorzystuje się komórki ex vivo (CSF-CTC pacjentów, które zostały przetworzone tylko w kroku 2 bez hodowli); fizyczna obserwacja zwierzęcia i rezonans magnetyczny mózgu są potrzebne do określenia progresji LMD. Z drugiej strony, dzięki modelowi CDX wykorzystującemu in vitro, PD-CSF-CTC mogą być znakowane reporterem lucyferazy, a status LMD można ocenić za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). System znakowania komórek zastosowany w tym raporcie to reporter NanoLuc (NL), który wykorzystuje furimazynę jako substrat, który, jak wykazano, zwiększa czułość proporcjonalnie do wzrostu guza21. Nie zaobserwowano interferencji wzrostu komórek CTC (in vitro lub in vivo) przez ekspresję NL.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma oznak progresji LMD, stosując następujące metody: obserwacja fizyczna: utrata masy ciała, pochylenie głowy i zgarbienie się. MRI: powiększone komory i objawy wodogłowia (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B). BLI: dodatnie sygnały bioluminescencyjne w obszarze OUN (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
5. Pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy z LMD w celu późniejszej ekspansji klonu
<ol>
	<li>Znieczulij mysz NSG LMD 4% izofluranem (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami), aż nie wykaże żadnych oznak odruchu prostowania.</li>
	<li>Przygotuj mysz, goląc sierść na całej brzusznej powierzchni głowy i przygotuj skórę za pomocą sterylnej techniki.</li>
	<li>Ustaw nos za pomocą zmodyfikowanego stożka nosowego w kształcie litery L aparatu stereotaktycznego, upewniając się, że nozdrza pozostają drożne. Zabezpiecz skórę, delikatnie pociągając ją do przodu po brzusznych powierzchniach obu małżowin usznych za pomocą taśmy, przymocowując ją do stożka nosowego, a następnie zginając szyję pod kątem około 90° po zabezpieczeniu. Podawaj 1,5%-3% izofluranu, aby utrzymać znieczulenie.</li>
	<li>Całkowicie rozciągając szyję i zaczynając tuż między małżowinami usznymi, poprowadź końcówki nożyczek chirurgicznych w dół po kości potylicznej z lekkim naciskiem. 
	UWAGA: W tej pozycji linii środkowej dostrzegalne jest subtelne wgłębienie, gdy końcówki nożyc wchodzą we wklęsły obszar nad cisterna magna.</li>
	<li>Utwórz małe nacięcie w linii środkowej o wymiarach 5-7 mm tuż nad wyczuwalną palpacyjnie wklęsłością.</li>
	<li>Użyj kleszczyków z końcówkami z końcówkami 1-2 mm, aby delikatnie wywrzeć nacisk na cisterna magna. Umieść końcówki w pozycji zamkniętej i otwórz je, wywierając nacisk w dół na oponę twardą.</li>
	<li>Powtarzaj proces rozwarstwienia, jak opisano w kroku 6, aż błona opony twardej będzie wyraźnie widoczna, a związane z nią naczynia krwionośne będą widoczne w odsłoniętym obszarze.</li>
	<li>Trzymając kleszcze otwarte, aby cofnąć otaczające mięśnie, włóż igłę 27-29 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml pod oponą twardą, aby uwidocznić skos. Upewnij się, że igła przebija się tuż poza skos. Stopniowo wycofywać tłok strzykawki.</li>
	<li>Zbierz jak najwięcej płynu mózgowo-rdzeniowego (zwykle od 15 do 30 μl) przed eutanazją myszy. 
	UWAGA: Eutanazja jest dokonywana zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami, poprzez wystawienie pacjenta na eskalację stężeń sprężonego gazu CO2 . Na przykład szybkość przemieszczenia od 30% do 70% objętości komory na minutę zostanie zastosowana, aby zapobiec lub zmniejszyć dyskomfort lub niepokój. Następnie należy zapewnić ustanie ruchów sercowo-naczyniowych i oddechowych poprzez długotrwałą obserwację w powietrzu w pomieszczeniu przez okres dłuższy niż 10 minut.</li>
	<li>Umieścić płyn mózgowo-rdzeniowy ze strzykawki w probówce do mikrowirówki i umieścić go na lodzie.</li>
	<li>Wirować próbkę w temperaturze 257 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie usunąć płyn (w razie potrzeby zamrozić próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego myszy w temperaturze -80 °C do dalszej analizy), nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodać 500 μl sterylnego PBS i umyć osad komórek; powtarzać wirowanie przy 257 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić komórki w pożywce kondycjonowanej przez HMC na płytce 96-dołkowej. 
	UWAGA: CSF-CTC, które zostały wszczepione in vivo i pomyślnie wyhodowane w LMD, powinny być w stanie rosnąć jak normalne hodowle komórkowe. Kontynuuj rozwój, zmieniając media co 3 dni. Trypsynizuj i przenieś komórki do większego aparatu do hodowli komórek, gdy komórki się zlewają. Komórki te staną się hodowlami in vivo PD-CSF-CTC. W bieżącym raporcie odnotowano 100% wskaźnik sukcesu z modelem CDX i nie wygenerowałem jeszcze PDX M-LMD.</li>
</ol>

Murine Model for Studying Leptomeningeal Disease Using Circulating Tumor Cells

<ol><li>Glitza, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+disease+in+melanoma+patients%3A+An+update+to+treatment%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 33 (4), 527-541 (2020).</li>
<li>Khaled, M. L., Tarhini, A. A., Forsyth, P. A., Smalley, I., Pina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+disease+%28LMD%29+in+patients+with+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal disease (LMD) in patients with melanoma metastases.</a> Cancers (Basel). 15 (6), 1884(2023).</li>
<li>Smalley, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+CSF+from+patients+with+leptomeningeal+melanoma+metastases+identifies+signatures+associated+with+disease+progression+and+therapeutic+resistance%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of CSF from patients with leptomeningeal melanoma metastases identifies signatures associated with disease progression and therapeutic resistance).</a> Clin Cancer Res. 26 (9), 2163-2175 (2020).</li>
<li>Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-year+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 381, 1535-1546 (2019).</li>
<li>Boire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+component+3+adapts+the+cerebrospinal+fluid+for+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complement component 3 adapts the cerebrospinal fluid for leptomeningeal metastasis.</a> Cell. 168 (6), 1101-1113 (2017).</li>
<li>Chi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+deploy+lipocalin-2+to+collect+limiting+iron+in+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer cells deploy lipocalin-2 to collect limiting iron in leptomeningeal metastasis.</a> Science. 369 (6501), 276-282 (2020).</li>
<li>Law, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+model+of+patient-derived+cerebrospinal+fluid+circulating+tumor+cells+for+experimental+therapeutics+in+leptomeningeal+disease+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A preclinical model of patient-derived cerebrospinal fluid circulating tumor cells for experimental therapeutics in leptomeningeal disease from melanoma.</a> Neuro Oncol. 24 (10), 1673-1686 (2022).</li>
<li>Carmona-Ule, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+ex+vivo+culture+of+CTCs+from+advance+breast+cancer+patients%3A+Clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Short-term ex vivo culture of CTCs from advance breast cancer patients: Clinical implications.</a> Cancers (Basel). 13 (11), 2668(2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+characterization+of+breast+cancer+CTCs+competent+for+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The identification and characterization of breast cancer CTCs competent for brain metastasis.</a> Sci Transl Med. 5 (180), (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy%3A+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy: Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
<li>Mohamed, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+circulating+tumour+cells+%28CTCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of circulating tumour cells (CTCs).</a> Sci Rep. 13 (1), 3704(2023).</li>
<li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+From+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: From protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Mercier, F., Hatton, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+26+and+basic+fibroblast+growth+factor+are+expressed+primarily+in+the+subpial+and+subependymal+layers+in+adult+brain+parenchyma%3A+Roles+in+stem+cell+proliferation+and+morphological+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Connexin 26 and basic fibroblast growth factor are expressed primarily in the subpial and subependymal layers in adult brain parenchyma: Roles in stem cell proliferation and morphological plasticity.</a> J Comp Neurol. 431 (1), 88-104 (2001).</li>
<li>Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+insulin-like+growth+factor+II+gene+in+the+choroid+plexus+and+the+leptomeninges+of+the+adult+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1), 141-145 (1988).</li>
<li>Nordqvist, A. C., Mathiesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+IGF-II%2C+IGFBP-2%2C+-5%2C+and+-6+in+meningiomas+with+different+brain+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Expression of IGF-II, IGFBP-2, -5, and -6 in meningiomas with different brain invasiveness.</a> J Neurooncol. 5, 19-26 (2002).</li>
<li>Zumkeller, W., Westphal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IGF%2FIGFBP+system+in+CNS+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The IGF/IGFBP system in CNS malignancy.</a> Mol Pathol. 54 (4), 227-229 (2001).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promise+and+limits+of+the+CellSearch+platform+for+evaluating+pharmacodynamics+in+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Promise and limits of the CellSearch platform for evaluating pharmacodynamics in circulating tumor cells.</a> Semin Oncol. 43 (4), 464-475 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+in+cancer+therapy%3A+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications.</a> Signal Transduct Target Ther. 8, 160(2023).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+improvement+of+immunodeficient+mice+and+humanized+immune+system+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and improvement of immunodeficient mice and humanized immune system mouse models.</a> Front Immunol. 13, 1007579(2022).</li>
<li>Law, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Murine+Ommaya+xenograft+model+to+study+direct-targeted+therapy+of+leptomeningeal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease.</a> J Vis Exp. (167), e62033(2021).</li>
<li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).</li>
<li>Luo, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viable+circulating+tumor+cells+with+cancer+stem+cells+feature%2C+where+is+the+way+out%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The viable circulating tumor cells with cancer stem cells feature, where is the way out.</a> J Exp Clin Cancer Res. 37, 38(2018).</li>
<li>Stumm, R., Kolodziej, A., Schulz, S., Kohtz, J. D., Hollt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+SDF-1alpha+and+SDF-1gamma+mRNAs%2C+migration+pathways%2C+and+phenotypes+of+CXCR4-expressing+neurons+in+the+developing+rat+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Patterns of SDF-1alpha and SDF-1gamma mRNAs, migration pathways, and phenotypes of CXCR4-expressing neurons in the developing rat telencephalon.</a> J Comp Neurol. 502 (3), 382-399 (2007).</li>
<li>Aviezer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((basal+lamina+proteoglycan%2C+promotes+basic+fibroblast+growth+factor-receptor+binding%2C+mitogenesis%2C+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">basal lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis, and angiogenesis.</a> Cell. 79 (6), 1005-1013 (1994).</li>
<li>Tiwary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERBB3+is+required+for+metastasis+formation+of+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">ERBB3 is required for metastasis formation of melanoma cells.</a> Oncogenesis. 3 (7), e110(2014).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7+reverses+the+resistance+to+BRAFi+in+melanoma+by+targeting+EGFR%2FIGF-1R%2FCRAF+and+inhibiting+the+MAPK+and+PI3K%2FAKT+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">miR-7 reverses the resistance to BRAFi in melanoma by targeting EGFR/IGF-1R/CRAF and inhibiting the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways.</a> Oncotarget. 7 (33), 53558-53570 (2016).</li>
<li>Satyamoorthy, K., Li, G., Vaidya, B., Patel, D., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-1+induces+survival+and+growth+of+biologically+early+melanoma+cells+through+both+the+mitogen-activated+protein+kinase+and+beta-catenin+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-1 induces survival and growth of biologically early melanoma cells through both the mitogen-activated protein kinase and beta-catenin pathways.</a> Cancer Res. 61 (19), 7318-7324 (2001).</li>
<li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tucatinib+vs+Placebo%2C+both+in+combination+with+Trastuzumab+and+Capecitabine%2C+for+previously+treated+ERBB2+%28HER2%29-positive+metastatic+breast+cancer+in+patients+with+brain+metastases%3A+Updated+exploratory+analysis+of+the+HER2CLIMB+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tucatinib vs Placebo, both in combination with Trastuzumab and Capecitabine, for previously treated ERBB2 (HER2)-positive metastatic breast cancer in patients with brain metastases: Updated exploratory analysis of the HER2CLIMB randomized clinical trial.</a> JAMA Oncol. 9 (2), 197-205 (2023).</li>
<li>Russo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceritinib-induced+regression+of+an+insulin-like+growth+factor-driven+neuroepithelial+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ceritinib-induced regression of an insulin-like growth factor-driven neuroepithelial brain tumor.</a> Int J Mol Sci. 20 (17), 4267(2019).</li>
<li>Ohsie, S. J., Sarantopoulos, G. P., Cochran, A. J., Binder, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characteristics+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cutan+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characteristics of melanoma.</a> J Cutan Pathol. 35 (5), 433-444 (2008).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+ex-vivo+expansion+of+circulating+head+and+neck+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Short term ex-vivo expansion of circulating head and neck tumour cells.</a> Oncotarget. 7 (37), 60101-60109 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+detecting+CSF-derived+tumor+cells+in+breast+cancer+patients+with+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of detecting CSF-derived tumor cells in breast cancer patients with leptomeningeal metastasis.</a> Oncotarget. 9 (2), 2705-2714 (2018).</li>
<li>Lelliott, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunogenic+mouse+model+of+melanoma+for+the+preclinical+assessment+of+combination+targeted+and+immune-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel immunogenic mouse model of melanoma for the preclinical assessment of combination targeted and immune-based therapy.</a> Sci Rep. 9 (1), 1225(2019).</li>
</ol>

Peter Forsyth zasiada w radach doradczych firm Abvie Inc, Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen i Ziopharm. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

M-LMD jest wyniszczającą, powszechnie śmiertelną chorobą i istnieje pilna potrzeba znalezienia lepszych strategii leczenia. Jedną z głównych barier w badaniu M-LMD jest niemożność pozyskania wystarczającej liczby płynów mózgowo-rdzeniowych do przeprowadzenia badań molekularnych i funkcjonalnych 1,7. Chociaż istnieją metody hodowli CTC z krwi obwodowej i płynu mózgowo-rdzeniowego innych typów raka, takich jak rak piersi i jajnika 11,31,32, te metody propagacji CTC są zwykle krótkoterminowe i nie odnotowano sukcesu w hodowli CSF-CTC z czerniaka. Ponadto obecne metodologie namnażania CTC istnieją w krótkoterminowych warunkach ex vivo i nie przyniosły jeszcze modelu LMD in vivo uzyskanego z komórek LMD pacjenta. W tym miejscu przedstawiono nowy protokół hodowli tych komórek in vitro i in vivo, co prowadzi do uzyskania unikalnych linii komórkowych pochodzących od pacjentów. Obecnie, spośród 11 pacjentów z M-LMD w badaniu, istniało około 60% (7 z 11) szans na sukces w propagacji M-LMD CSF-CTC in vitro, a podczas gdy wartość ta została obniżona do ~20% (2 z 11) in vivo przy użyciu metody CDX7.
Oczywiste jest, że warunki in vitro nie podsumowują mikrośrodowiska płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednak podejścia proteomiczne zostały wcześniej przeprowadzone w celu zbadania składników białkowych w płynie mózgowo-rdzeniowym i dostarczyły pewnych informacji na temat kluczowych czynników, które były wymagane do wzrostu CTC ex vivo3. Na przykład stwierdzono, że jeden z głównych szlaków promujących przeżycie CTC u pacjentów z M-LMD był związany ze zwiększoną aktywnością związaną z IGF 3,7. Ponadto badania wykazały, że opony mózgowo-rdzeniowe wydzielają do płynu mózgowo-rdzeniowego różne cytokiny / czynniki wzrostu, w tym FGF-2, EGF, GM-CSF i białka związane z sygnalizacją IGF12. Rzeczywiście, zostało to podsumowane w mediach hodowanych za pomocą HMC, co potwierdza potencjalną rolę tych czynników wzrostu w promowaniu wzrostu CSF-CTC.
Główną zaletą generowania modelu PDX (lub CDX) jest możliwość uzyskania głębszego wglądu w patologię choroby, czego brakuje w warunkach in vitro . Najlepiej byłoby zastosować podejście PDX, ponieważ płyn mózgowo-rdzeniowy pochodziłby bezpośrednio od pacjentów bez hodowli ex vivo . Początkowo podejmowano próby stworzenia M-LMD przy użyciu tego podejścia, jednak jak dotąd nie zakończyły się one sukcesem. Trudność w generowaniu myszy PDX jest prawdopodobnie związana z obfitością i integralnością materiału wyjściowego (tj. bardzo mało żywotnych CTC w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjenta podczas rutynowego pobierania w klinice). To może wyjaśniać, dlaczego odnieśliśmy większy sukces w hodowli CTC z płynu mózgowo-rdzeniowego pobranego podczas autopsji7. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo propagacji in vivo , protokół ten został zmodyfikowany, aby zapewnić alternatywne podejście CDX. CSF-CTC można najpierw namnażać in vitro (krok 3) w celu wytworzenia linii PD-CSF-CTC, które mają długoterminowy i większy potencjał wzrostu. Komórki te są następnie inokulowane u myszy w celu wytworzenia M-LMD. Chociaż obecna metoda wygenerowała ograniczoną liczbę modeli in vivo CDX M-LMD (~ 20%), może to odzwierciedlać różnorodność transkrypcyjną CSF-CTC, złożoność mikrośrodowiska CSF i ogólnie trudności w hodowli tych komórek. Zakładamy, że przyszły rozwój humanizowanego modelu myszy może zwiększyć wskaźnik powodzenia przeszczepu, biorąc pod uwagę znaczenie mikrośrodowiska we wspieraniu żywotności komórek rakowych33. 
Ograniczeniem podejścia CDX jest to, że tylko niektóre klony zostały wybrane z próbek pacjentów, a dryf genetyczny komórek rakowych poprzez hodowlę ex vivo może już nie odzwierciedlać profilu transkrypcyjnego oryginalnego źródła. Doniesiono jednak, że pomimo hodowli in vitro , linie PD-CSF-CTC zachowały około 97% podobieństwa ekspresji genów do izolowanych, niehodowanych pacjentów CSF-CTC7. W tym badaniu analizy sekwencyjne scRNA ujawniły nakładające się na siebie wzbogacone sygnatury genów między niehodowanymi PD-CSF-CTC in vitro i in vivo PD-CSF-CTC, takimi jak SOX9, ErbB3 i IGF-1R7, co sugeruje, że mogą to być potencjalne cele terapeutyczne. Ponadto te powszechnie wzbogacone geny są zaangażowane w szlaki biologiczne związane z regulacją transkrypcji i metabolizmem7. Podsumowując, podkreśla to wartość translacyjną kultur PD-CSF-CTC dla lepszego zrozumienia biologii M-LMD, identyfikacji docelowych mechanizmów molekularnych i szlaków napędzających chorobę oraz projektowania racjonalnych terapii w przyszłych badaniach.
Chociaż obecna metodologia pozostaje niedoskonała, ponieważ nie ma sposobu, aby z góry określić stan i żywotność CSF-CTC u pacjentów z M-LMD, dokonano kilku obserwacji, które zwiększyłyby prawdopodobieństwo sukcesu, ponieważ CTC są mało liczne i dość delikatne. Te krytyczne kroki obejmują koordynację z kliniką w celu umieszczenia próbek płynu mózgowo-rdzeniowego na lodzie zaraz po ich pobraniu i szybkiego transportu do laboratorium, aby zachować integralność komórkową. Następnie płyny mózgowo-rdzeniowe należy natychmiast przetworzyć, albo poprzez posiew w hodowli, albo kriokonserwację komórek. 
Ogólnie rzecz biorąc, hodowla i ekspansja CSF-CTC była procesem prób i błędów, ale ustanowienie tego protokołu w celu generowania komórek M-LMD pochodzących od pacjentów zapewni naukowcom zasoby niezbędne do przeprowadzania eksperymentów na próbkach od pacjentów, co nie było możliwe wcześniej. Głównym celem na przyszłość jest wykorzystanie M-LMD PD-CSF-CTC do przeprowadzenia charakterystyki molekularnej, wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków oraz badań skuteczności leków in vivo w celu zaprojektowania racjonalnych terapii w leczeniu M-LMD. Uważa się, że takie podejście doprowadzi do strategii leczenia, które znacznie zmniejszą zachorowalność i śmiertelność związaną z tym obecnie śmiertelnym aspektem zaawansowanego czerniaka z przerzutami.

Choroba opon mózgowo-rdzeniowych (LMD) występuje, gdy krążące komórki nowotworowe (CTC) przenikają do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i tworzą w oponach mózgowych błonę otaczającą mózg i rdzeń kręgowy1,2. LMD może wystąpić w wielu nowotworach, ale jest szczególnie rozpowszechnione w czerniaku. W zaawansowanych stadiach czerniaka u około 5% pacjentów rozwinie się związany z czerniakiem M-LMD2,3. Chociaż w przypadku innych miejsc przerzutów jest stosunkowo niskie, konsekwencje M-LMD są druzgocące, a całkowite przeżycie waha się od tygodni do miesięcy i w znacznym stopniu przyczynia się do zachorowalności pacjentów1,3,4. Wynika to przede wszystkim z niedostatku skutecznych opcji leczenia w połączeniu z poważnymi lukami w naszej wiedzy na temat tego, w jaki sposób opony mózgowe są kolonizowane przez komórki czerniaka2. W związku z tym zrozumienie biologii M-LMD ułatwi projektowanie nowych terapii w celu poprawy wyników klinicznych.
Ostatnie raporty pokazują, jak CTC kolonizują unikalne mikrośrodowisko płynu mózgowo-rdzeniowego. Na przykład dopełniacz C3 sprzyja inwazji komórek nowotworowych do płynu mózgowo-rdzeniowego przez splot naczyniówkowy, skomplikowaną sieć naczyń krwionośnych w każdej komorze mózgu5. Ponadto, w odpowiedzi na niedobór mikroelementów w płynie mózgowo-rdzeniowym, CTC mogą zwiększać poziom lipokaliny-2, białka wymiatającego żelazo, i jego receptora SLC22A17 w celu zwiększenia przeżywalności6. Korzystając z analiz płynu mózgowo-rdzeniowego opartych na omii, nasza grupa odkryła również, że płyn mózgowo-rdzeniowy jest wzbogacony w białka, które regulują sygnalizację insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF), a także odporność wrodzoną3. Łącznie dane te podkreślają wartość płynnych biopsji płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF-CTC) w badaniu M-LMD.
Chociaż czasami można zidentyfikować CSF-CTC poprzez pobranie próbki płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta za pomocą nakłucia lędźwiowego, zbiornika Ommaya lub szybkich autopsji, głównym ograniczeniem jest uzyskanie wystarczającej liczby tych rzadkich i delikatnych komórek1,7. Na przykład, przy użyciu techniki liczenia CTC, tylko od kilkuset do kilku tysięcy komórek nowotworowych jest możliwych do zidentyfikowania na próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta7, co utrudnia przeprowadzanie analiz molekularnych i funkcjonalnych in vitro lub in vivo. Chociaż istnieją doniesienia o sukcesie w krótkotrwałym wzroście CTC ex vivo z krwi obwodowej (tj. CTC raka piersi)8,9,10, komórki te zwykle rosną tylko przez krótki okres i nie zgłoszono przypadków możliwości wyhodowania CTC czerniaka w płynie mózgowo-rdzeniowym. W związku z tym znalezienie sposobów na rozmnażanie czerniaka CSF-CTC lub CTC w ogóle, będzie bardzo korzystne dla badania biologii M-LMD7,11.
Po raz pierwszy opisano nowatorską technikę namnażania CSF-CTC od pacjentów z M-LMD ex vivo. W niniejszym raporcie opracowano szczegółowy protokół, który pozwala na hodowlę i ekspansję CSF-CTC od pacjentów z M-LMD. Ponieważ opony wydzielają różne czynniki wzrostu, takie jak FGF, IGF, VEGF-A i IGFBP, które wspierają wzrost otaczający środowisko12,13,14,15,16, zracjonalizowano, że CSF-CTC mogą wymagać tych składników do wzrostu ex vivo Warunki. W związku z tym protokół ten wykorzystuje kondycjonowane pożywki generowane przez hodowlę ludzkich komórek opon mózgowych (HMC) in vitro. W przypadku inokulacji in vivo komórki pochodzące od pacjenta są inokulowane myszom z niedoborem odporności w celu wytworzenia linii CSF-CTC (PD-CSF-CTC) pochodzących od pacjenta. Dostępność komórek M-LMD pochodzących od pacjentów będzie wspierać testy komórkowe, molekularne i funkcjonalne w celu zbadania M-LMD i zaproponowania nowych strategii leczenia tej śmiertelnej choroby.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml Igły 27 - 29 G</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td>nie</td><td>dotyczy 0,1 mm Sterylne filtrowane</td></tr><tr><td>probówki Eppendorfa 1,5 ml</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml i 50 ml probówek wirówkowych z polistyrenu</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>6 -&nbsp; 8 tygodni samice NOD SCID gamma (NSG)</td> myszy <td>Charles River</td><td></td><td>Samce opcjonalnie</td></tr><tr><td>Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu (Bup-SR)</td><td>Zoopharma&nbsp;</td><td></td><td>Kontrolowana przez DEA</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ScienCell</td><td>#0010</td><td></td></tr><tr><td>System anestehsji do inhalacji gazowej</td><td>VeteEquip</td><td>#</td><td>901812 COMPAC5</td></tr><tr><td>Strzykawki mikrolitrowe Hamilton</td><td></td><td>10, 25, 50 i 100</td><td>ml 30 G do wstrzykiwań cisterna magna</td></tr><tr><td>Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td> <td>Milipore Sigma (lub dowolny sprzedawca)</td><td>#F0291</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Milipore Sigma (lub dowolny sprzedawca)</td><td>#SRP3027</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki opon mózgowo-rdzeniowych (HMC) wyizolowane z ludzkich opon mózgowo-rdzeniowych</td> System obrazowania <td>ScienCell</td><td>#1400</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Szkło powiększające ze światłem</td><td>Dowolny dostawca</td><td>, nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do hodowli komórek opon mózgowych (MenCM)</td><td>ScienCell</td><td>#1401</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek opon mózgowych (MCGS)</td><td>ScienCell</td><td>#1452</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie MRI</td> Seria <td>Bruker</td><td>BioSpec</td><td>Opcjonalne</td></tr><tr><td>pipety/końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet P1000, P200, P20</tr><tr><td>Roztwór antybiotyku penicylina-streptomycyna</td><td>ScienCell (lub dowolny sprzedawca)</td><td>#0503</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td>nie dotyczy</td> sterylnych narzędzi chirurgicznych dla gryzoni <td>z filtrem 0,1 mm</td></tr><tr><td>(nożyczki, kleszcze)</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz (lub dowolny dostawca)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki kriogeniczne z nakrętką&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny niebieski papier / zasłona</td><td>pokrywająca Dowolny sprzedawca</td><td>nie</td><td>dotyczy Nie</td></tr> dotyczy <tr><td>Sterylne patyczki bawełniane</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Płytki/kolby do hodowli tkankowych (96-dołkowe, 24-dołkowe, 12-dołkowe, 6-dołkowe, T175 itp.)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Ex Vivo Culture of Circulating Tumor Cells in the Cerebral Spinal Fluid from Melanoma Patients to Study Melanoma&#45;Associated Leptomeningeal Disease

Choroba oponowo-rdzeniowa związana z czerniakiem (M-LMD) występuje, gdy krążące komórki nowotworowe (CTC) dostają się do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i kolonizują opony mózgowe, warstwy błony chroniące mózg i rdzeń kręgowy. Po ustaleniu, rokowanie dla pacjentów z M-LMD jest ponure, a całkowite przeżycie waha się od tygodni do miesięcy. Wynika to przede wszystkim z niedostatku w naszej wiedzy na temat choroby, a co za tym idzie, dostępności skutecznych opcji leczenia. Zdefiniowanie biologii leżącej u podstaw M-LMD znacznie poprawi zdolność do adaptacji dostępnych terapii do leczenia M-LMD lub projektowania nowych inhibitorów tej powszechnie śmiertelnej choroby. Główną przeszkodą jest jednak uzyskanie wystarczającej ilości CTC z płynu mózgowo-rdzeniowego pochodzącego od pacjenta (CSF-CTC) w celu przeprowadzenia eksperymentów przedklinicznych, takich jak charakterystyka molekularna, analiza funkcjonalna i badania skuteczności in vivo. Hodowla CSF-CTC ex vivo również okazała się wyzwaniem. Aby rozwiązać ten problem, opracowano nowatorski protokół hodowli M-LMD CSF-CTC pochodzących od pacjentów ex vivo i in vivo. Stwierdzono, że włączenie kondycjonowanych pożywek wytwarzanych przez ludzkie komórki oponowe (HMC) ma kluczowe znaczenie dla procedury. Analiza macierzy cytokin ujawnia, że czynniki wytwarzane przez HMC, takie jak białka wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu (IGFBP) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A), są ważne we wspieraniu przeżycia CSF-CTC ex vivo. W tym miejscu wykazano przydatność izolowanych linii CSF-CTC pochodzących od pacjentów w określaniu skuteczności inhibitorów, które celują w szlaki sygnałowe insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF) i kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK). Ponadto wykazano zdolność do dokanałowego inokulowania tych komórek in vivo w celu stworzenia mysich modeli M-LMD, które można wykorzystać do badań przedklinicznych zatwierdzonych lub nowatorskich terapii. Narzędzia te mogą pomóc w rozwikłaniu przyczyn biologicznych leżących u podstaw powstawania płynu mózgowo-rdzeniowego w oponach mózgowo-rdzeniowych i zidentyfikowaniu nowych terapii mających na celu zmniejszenie zachorowalności i śmiertelności związanej z M-LMD.

Zrozumienie wymagań niezbędnych do pomyślnego wzrostu CSF-CTCs ex vivo jest przedmiotem ciągłych badań. W związku z tym uważa się, że kluczowe znaczenie ma zapewnienie niezbędnych czynników naśladujących mikrośrodowisko płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)22. Ludzkie komórki oponowe (HMCs) wydzielają do CSF szereg czynników wzrostu, w tym FGF-2, EGF, IGFBP2 i IGFBP6, a jak wiadomo, wspierają one wzrost komórek CTC12,13,14,23,24. Dlatego w celu zidentyfikowania potencjalnie ważnych komponentów niezbędnych do przeżycia CTC przeprowadzono analizę tablicy cytokin ludzkich w pożywce warunkowanej przez HMC. Rzeczywiście, w pożywce hodowanej z HMC zaobserwowano zwiększoną ekspresję kilku czynników wzrostu (Rycyna 3A). Przykładem są czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), VEGF-A oraz białka wiążące IGF (IGFBP2, 3, 4 i 6).
Komponenty komórkowe płynu mózgowo-rdzeniowego pobrane od pacjentów mogą składać się z wielu typów komórek, takich jak CTC, komórki odpornościowe i fibroblasty. Komórki inne niż CTC z czasem przestaną się pasażować. Zazwyczaj komórki, które namnażają się pomyślnie i pozostają w fazie proliferacji, to komórki nowotworowe (M-LMD). Potwierdzenie, że komórki rosnące w hodowli są rzeczywiście komórkami M-LMD, można przeprowadzić za pomocą detekcji ekspresji MLANA metodą IF oraz analiz transkryptomicznych, co zostało wykazane we wcześniejszych badaniach7.
W celu przeprowadzenia dowodu koncepcji wykazującego potencjalne zastosowanie i użyteczność ustalonych linii PD-CSF-CTC in vitro oraz in vivo, wykorzystano analizę sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq); wyniki ujawniły kilka genów, które zostały wzbogacone i zachowane w porównaniu z niehodowanymi komórkami CSF-CTCs pobranymi od pacjentów7. Dwa z nich to receptorowa tyrozynowa kinaza białkowa ErbB3 oraz IGF-1R, które mają wpływ na progresję czerniaka i oporność na chemioterapię25,26,27.
Aby sprawdzić, czy odgrywają one rolę w przeżywalności PD-CSF-CTC, przeprowadzono test proliferacji z użyciem fioletu krystalicznego na komórkach PD-CSF-CTC traktowanych zatwierdzonymi przez FDA lekami: tukatynibem i ceritynibem, które celują odpowiednio w ErbB28 i IGF-1R7,29. Przeciwciało anty-IGFBP2 zastosowano jako kontrolę pozytywną, która powinna hamować wzrost kultur PD-CSF-CTC. Wyniki wykazały, że brak IGFBP2 lub IGF-1R był skuteczny w ograniczaniu proliferacji PD-CSF-CTCs (Rycyna 3B). Biorąc pod uwagę, że sygnalizacja MAPK znajduje się poniżej IGF-1R, w trzech liniach M-LMD PD-CSF-CTC przeprowadzono również barwienie żywych komórek kalceiną-AM oraz testy przeżywalności MTT, traktując je ceritynibem lub inhibitorami MAPK – dabrafenibem i trametynibem – lub kombinacją wszystkich trzech leków. Dane wykazały, że żywotność wszystkich trzech linii komórkowych została znacząco zredukowana przez ceritynib, podczas gdy dabrafenib i trametynib wywołały mieszane efekty (Rycyna 3C). Wynik traktowania dabrafenibem i trametynibem był zaskakujący. Wszystkie trzy linie PD-CSF-CTC pochodziły od pacjentów z M-LMD posiadających mutację BRAFV600E7. Może to sugerować efekt nabytej chemorezystencji CSF-CTC, co powinno zostać zbadane w przyszłości.
Następnie, jako przykład wykorzystania PD-CSF-CTCs in vivo, utworzono mysie modele M-LMD poprzez dokaleczenie dokanałowe różnej liczby PD-CSF-CTCs. Wyznaczono mediany czasu przeżycia myszy (Rycina 3D). Aby zwizualizować progresję M-LMD, linie PD-CSF-CTC oznaczono markerem bioluminescencyjnym, takim jak system reporterowy NL21, a następnie obrazowano za pomocą BLI (Rycina 2C). Lokalizację przerzutów LMD wykazano również metodą immunohistochemii, stosując białko melan-A (MLANA)30 jako marker komórek czerniaka (Rycina 3E). Jako dowód koncepcji w celu przetestowania strategii terapeutycznych przeciwko M-LMD in vivo, kohorty mysie z M-LMD otrzymywały codzienną doustną monoterapię ceritinibem lub trametinibem, bądź kombinację dabrafenibu i trametinibu lub ceritinibu i trametinibu. Kohorta kontrolna (nieleczona) w ramach porównania otrzymywała doustnie sól fizjologiczną. Wyniki wykazały istotnie wydłużone przeżycie (Rycina 3F) i opóźnione wykrycie choroby (Rycina 3G) w kohorcie leczonej ceritinibem i trametinibem (mediana przeżycia dla nieleczonego M-LMD: 28.5 dni vs. mediana przeżycia dla M-LMD leczonego ceritinibem i trametinibem: 38.5 dni; wartość P = 0.0052). Dane te podkreślają potencjalną użyteczność opracowanych linii M-LMD PD-CSF-CTC w prowadzeniu badań przedklinicznych w celu określenia skuteczności nowych środków terapeutycznych.
<img alt="Proces pozyskiwania CSF-CTC od pacjenta; schemat punkcji lędźwiowej, pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego, modeli PDX/CDX, hodowli in vitro." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66071/66071fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procesu tworzenia linii krążących komórek nowotworowych z płynu mózgowo-rdzeniowego pochodzących od pacjenta (PD-CSF-CTCs). Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) od pacjentów może być pobierany poprzez punkcję lędźwiową, zbiornik Ommaya lub szybką autopsję. Poprzez serię propagacji in vitro oraz in vivo, każdy etap generuje pośrednią hodowlę CSF-CTC (tj. CSF-CTC pacjenta, hodowlę in vitro, hodowlę in vivo) aż do ustanowienia linii PD-CSF-CTC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza obrazowania MRI mózgu w przekroju osiowym, schemat wstrzykiwania uprzednio oznakowanych CSF-CTC u myszy, wzrost guza w 6. i 9. tygodniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66071/66071fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykłady hodowli in vitro i in vivo CSF-CTC pochodzących od pacjentów z M-LMD. (A) Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym pokazujące wzrost kolonii CSF-CTC z M-LMD in vitro w 6. i 9. tygodniu w pożywce warunkowanej komórkami HMC. Pasek skali: 1000 µm. (B) Obrazy MRI w 4. i 8. tygodniu po inokulacji dokanałowej PD-CSF-CTC; pomyślne ustanowienie mysiego modelu M-LMD. Żółte strzałki wskazują powiększone komory i możliwy wodogłowie w tej myszy z M-LMD. (C) Reprezentatywna wizualizacja BLI rozwoju M-LMD u myszy. Rysunek został zaadaptowany z pracy Law et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat ekspresji białek, wykresy przeżywalności, obrazy mikroskopowe; analiza leczenia guzów, żywotność komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66071/66071fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Linie PD-CSF-CTC są wykorzystywane w różnych eksperymentach przedklinicznych do badania M-LMD. (A) Ludzki panel cytokinowy wykazujący wzrost różnych wydzielanych czynników wzrostu (np. IGFBPs, VEGF-A oraz GM-CSF) w pożywkach hodowlanych (MenCM) w obecności ludzkich komórek opon mózgowych (HMCs). (B) Zeskanowany obraz testu proliferacji komórek z użyciem fioletu krystalicznego w celu określenia skuteczności przeciwciała przeciwko IGFBP2, tucatynibu oraz ceritynibu wobec jednej z linii PD-CSF-CTC. W warunkach kontrolnych zastosowano podanie nośnika. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach. (C) Test przeżywalności komórek trzech różnych ustanowionych linii PD-CSF-CTC (od pacjentów 09, 12 i 16) in vitro. Komórki traktowano ceritynibem (cer), kombinacją dabrafenybu (dab) + trametynibu (tra), cer + tra lub wszystkimi trzema lekami. Komórki zebrano po 72 h od leczenia. Barwienie Calcein-AM wykorzystano do wizualizacji żywotności komórek, a test MTT do określenia przeżywalności komórek. Do analizy statystycznej zastosowano test t dla prób zależnych. Paski skali: 20 µm. (D) Krzywa przeżywalności w mysim modelu M-LMD. Myszy NSG inokulowano dostrojkowo (via cisterna magna) jedną z linii PD-CSF-CTC w dawkach 10 000, 20 000 i 50 000 komórek. Wyznaczono medianę przeżycia myszy z M-LMD. (E) Wykrywanie MLANA, markera czerniaka, metodą IHC w przekrojach mózgu myszy z M-LMD. Pozytywny sygnał MLANA stwierdzono w oponach mózgowych (zabarwienie na czerwono; wskazane żółtymi strzałkami), natomiast w normalnym (zdrowym) mózgu nie stwierdzono wzrostu nowotworu (negatywny wynik dla MLANA). Paski skali: 200 µm. (F) Reprezentatywny eksperyment dotyczący skuteczności w kohortach myszy z M-LMD, którym codziennie podawano doustnie sól fizjologiczną, cer, tra, dab/tra lub cer/tra. Wyznaczono przeżywalność myszy. Do analizy statystycznej zastosowano test log-rank (Mantela-Coxa). (G) Reprezentatywne obrazy BLI postępu M-LMD w ciągu 5 tygodni, porównujące kohorty myszy z M-LMD leczone solą fizjologiczną (kontrola) vs. leczone cer/tra. Panel (C) ryciny został zaadaptowany z pracy Law i wsp.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Podsumowanie klinicznych CSF-CTC uzyskanych do hodowli ex vivo u pacjentów z M-LMD. Tabela podsumowująca dane 11 pacjentów z M-LMD, u których podjęto próby propagacji CSF-CTC. Pacjenci wymienieni w tabeli zostali wcześniej opisani w pracy Law et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten artykuł opisuje protokół namnażania komórek nowotworowych krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF-CTC) pobranych od pacjentów z chorobą oponowo-rdzeniową związaną z czerniakiem (M-LMD) w celu opracowania modeli przedklinicznych do badania M-LMD.

Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Melanoma-associated leptomeningeal disease (M-LMD) occurs when circulating tumor cells (CTCs) enter into the cerebral spinal fluid (CSF) and colonize the ...

Choroba oponowo-rdzeniowa spowodowana czerniakiem lub M-LMD jest agresywną postacią przerzutów do opon mózgowych, w której krążące komórki nowotworowe lub CTC naciekają do płynu mózgowo-rdzeniowego. Niestety, nie ma skutecznych metod leczenia M-LMD, więc zrozumienie jego biologii pomoże opracować terapie zmniejszające śmiertelność. Ostatnie doniesienia wykazały, w jaki sposób CTC mogą kolonizować środowisko CSF ubogie w składniki odżywcze, na przykład wykorzystując zdolność wychwytywania żelaza w celu zwiększenia ich przeżywalności i uzupełnienia C3 w celu promowania inwazji do płynu mózgowo-rdzeniowego przez splot naczyniówkowy.Dlatego CTC są bardzo dobrymi narzędziami do badania M-LMD. Największym wyzwaniem w badaniu CTC płynu mózgowo-rdzeniowego jest ogólny brak modelu przedklinicznego i niedobór tych komórek. Znalezienie sposobów na wyhodowanie tych rzadkich i delikatnych komórek od pacjentów oraz wygenerowanie modelu ksenoprzeszczepu przyniesie naukowcom ogromne korzyści w zrozumieniu patologii M-LMD i zaprojektowaniu racjonalnych terapii.Opracowaliśmy metodę, która z powodzeniem rozmnożyła CTC płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z M-LMD in vitro i in vivo, co dało nam możliwość przeprowadzenia analiz molekularnych i funkcjonalnych komórek M-LMD, a także badania skuteczności w modelach ksenoprzeszczepów. Chociaż obecne metodologie są niedoskonałe, możliwość hodowli i rozszerzenia CTC płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z czerniakiem po raz pierwszy dała nam wgląd w znaczenie zrozumienia mikrośrodowiska płynu mózgowo-rdzeniowego. Aby rozpocząć, należy wstępnie pokryć kolbę T175 poli-l-lizyną.Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Teraz użyj sterylnej pipety serologicznej, aby odessać roztwór lizyny. Odpipetować 30 mililitrów kompletnej pożywki do hodowli opon mózgowo-rdzeniowych zawierającej ludzkie komórki opon mózgowo-rdzeniowych do kolby.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną około 75% do 80% konfluencji, zbierz i zapisz pożywkę hodowlaną HMC w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj do probówki kompletną pożywkę do hodowli opon mózgowo-rdzeniowych w stosunku jeden do jednego.Na koniec odpipetuj czynniki wzrostu do probówki, aby utworzyć pożywkę kondycjonowaną przez HMC. Aby przetworzyć płyn mózgowo-rdzeniowy, najpierw umieść go w 15-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie, aby go schłodzić. Odwirować płyn w wirówce ze wstępnie schłodzoną wodą o sile 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odpipetować supernatant bez naruszania osadu komórkowego i sporządzić jego porcje w różnych probówkach. Teraz dodaj jeden mililitr PBS do osadu komórkowego, aby go ponownie zawiesić. Odwirować komórki w temperaturze 1 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać supernatant PBS, pozostawiając około 50 mikrolitrów na dnie probówki. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą zawiesiny komórek przed hodowlą komórek. Kilka czynników wzrostu zostało podwyższonych w pożywkach hodowanych z ludzkimi komórkami opon mózgowych.Na początek obracaj rozmrożone kultury kriokonserwowanych CTC płynu mózgowo-rdzeniowego w temperaturze 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant za pomocą pipety. Dodaj jeden mililitr PBS, aby przepłukać osad komórkowy, ponownie odessać supernatant.Następnie ponownie zawieś komórki w 450 mikrolitrach pożywki kondycjonowanej HMC w trzech oddzielnych dołkach 96-dołkowej płytki. Odpipetować 150 mikrolitrów zawiesiny komórek do trzech różnych dołków na 96-dołkowej płytce. Nośnik kondycjonowany w konsoli HMC należy uzupełniać nowym nośnikiem co trzy dni.Gdy kultura komórkowa osiągnie 90% konfluencji, przenieś trypsynizowane komórki studzienki do pustej studzienki na 24-dołkowej płytce. Podczas ciągłej hodowli komórek nowotworowych wybierz klony komórek, które przekształcają się i rozszerzają wykładniczo, do dalszych eksperymentów. Na początek zidentyfikuj samice myszy NSG z niedoborem odporności z chorobą opon mózgowo-rdzeniowych lub LMD.Umieść znieczuloną mysz na stole operacyjnym. Umieść nos myszy w zmodyfikowanym stożku w kształcie litery L aparatu stereotaktycznego, upewniając się, że nozdrza pozostają niezatkane. Delikatnie ciągnąc skórę do przodu po brzusznych powierzchniach obu małżowin usznych.Następnie przymocuj go do stożka nosowego za pomocą taśmy. Poprowadź końcówki nożyczek chirurgicznych w dół od małżowin usznych przez kość potyliczną. Utwórz małe nacięcie w linii środkowej o wymiarach od pięciu do siedmiu milimetrów tuż nad wyczuwalną wklęsłością.Za pomocą pary kleszczy z końcówkami o długości od jednego do dwóch milimetrów, delikatnie dociśnij cisterna magna. Umieść końcówki w pozycji zamkniętej i otwórz je, wywierając nacisk w dół na oponę twardą. Kontynuuj wykonywanie sekcji, aż błona opony twardej będzie wyraźnie widoczna, a związane z nią naczynia krwionośne będą widoczne w odsłoniętym obszarze.Teraz trzymaj kleszcze otwarte, aby cofnąć otaczające mięśnie. Następnie przymocuj igłę o rozmiarze od 27 do 29 do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Włożyć strzykawkę pod oponę twardą, aby uwidocznić skos.Stopniowo cofać tłok strzykawki, aby zebrać jak najwięcej płynu mózgowo-rdzeniowego. Natychmiast przenieś płyn do mikroprobówki wirówkowej. Umieść go na lodzie.Odwirować próbkę o masie 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zaessaniu supernatantu odpipetować 500 mikrolitrów sterylnego PBS do osadu komórkowego. Odwirować osad o sile 257 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odrzucić supernatant, a następnie przenieść osad na 96-dołkową płytkę zawierającą pożywkę kondycjonowaną przez HMC.

ex-vivo-culture-circulating-tumor-cells-cerebral-spinal-fluid-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie opisujemy procedurę dostarczania komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego do cisterna magna mózgu myszy. Ortotopowy model myszy może być wykorzystany do badania przerzutowego rozprzestrzeniania się raka do opon mózgowo-rdzeniowych.

Chirurgiczne wstrzyknięcie Cisterna Magna: metoda podawania komórek nowotworowych bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego modelu mysiego

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Przerzuty odgrywają ogromną rolę w zjadliwości raka, odpowiadając za około 90% zgonów.  Przedstawiamy protokół dla modelu czerniaka z przerzutami u myszy, który jest przydatny do określenia skuteczności środków terapeutycznych przeciwko temu zjawisku klinicznemu.

Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Protokół hodowli eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego jest technicznie solidnym i prostym sposobem na uzyskanie fibronektynowo-dodatnich fibroblastów opon mózgowych w ciągu 6-8 tygodni i kriokonserwację około 20-30 milionów komórek.

Pochodzenie kultur eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu

Tutaj opisujemy model mysiego ksenoprzeszczepu, który funkcjonalnie przypomina rezerwuar Ommaya u pacjentów. Opracowaliśmy mysi Ommaya w celu zbadania nowych metod leczenia powszechnie śmiertelnej choroby opon mózgowo-rdzeniowych.

Mysi model ksenoprzeszczepu Ommaya do badania terapii ukierunkowanej na chorobę opon mózgowo-rdzeniowych

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Przedstawiono protokół wykorzystania mikrofiltra pokrytego poli(N-izopropylolakrylamidem) (PIPAAm) do skutecznego wychwytywania i termoresponsywnego uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych (CTC). Metoda ta umożliwia wychwycenie CTC z krwi pacjenta, a następnie uwolnienie żywego CTC do dalszej hodowli poza chipem, analiz i charakterystyki.

Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Poznaj metodę hodowli komórek nowotworowych z płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów z czerniakiem. Technika ta umożliwia badanie biologii choroby opon mózgowo-rdzeniowych i rozwój nowych terapii.

Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem (Wideo) | JoVE Journal

Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Przeglądaj więcej filmów