Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem
March 29th, 2024
Ten artykuł opisuje protokół namnażania komórek nowotworowych krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF-CTC) pobranych od pacjentów z chorobą oponowo-rdzeniową związaną z czerniakiem (M-LMD) w celu opracowania modeli przedklinicznych do badania M-LMD.
Choroba oponowo-rdzeniowa spowodowana czerniakiem lub M-LMD jest agresywną postacią przerzutów do opon mózgowych, w której krążące komórki nowotworowe lub CTC naciekają do płynu mózgowo-rdzeniowego. Niestety, nie ma skutecznych metod leczenia M-LMD, więc zrozumienie jego biologii pomoże opracować terapie zmniejszające śmiertelność. Ostatnie doniesienia wykazały, w jaki sposób CTC mogą kolonizować środowisko CSF ubogie w składniki odżywcze, na przykład wykorzystując zdolność wychwytywania żelaza w celu zwiększenia ich przeżywalności i uzupełnienia C3 w celu promowania inwazji do płynu mózgowo-rdzeniowego przez splot naczyniówkowy.
Dlatego CTC są bardzo dobrymi narzędziami do badania M-LMD. Największym wyzwaniem w badaniu CTC płynu mózgowo-rdzeniowego jest ogólny brak modelu przedklinicznego i niedobór tych komórek. Znalezienie sposobów na wyhodowanie tych rzadkich i delikatnych komórek od pacjentów oraz wygenerowanie modelu ksenoprzeszczepu przyniesie naukowcom ogromne korzyści w zrozumieniu patologii M-LMD i zaprojektowaniu racjonalnych terapii.
Opracowaliśmy metodę, która z powodzeniem rozmnożyła CTC płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z M-LMD in vitro i in vivo, co dało nam możliwość przeprowadzenia analiz molekularnych i funkcjonalnych komórek M-LMD, a także badania skuteczności w modelach ksenoprzeszczepów. Chociaż obecne metodologie są niedoskonałe, możliwość hodowli i rozszerzenia CTC płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z czerniakiem po raz pierwszy dała nam wgląd w znaczenie zrozumienia mikrośrodowiska płynu mózgowo-rdzeniowego. Aby rozpocząć, należy wstępnie pokryć kolbę T175 poli-l-lizyną.
Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Teraz użyj sterylnej pipety serologicznej, aby odessać roztwór lizyny. Odpipetować 30 mililitrów kompletnej pożywki do hodowli opon mózgowo-rdzeniowych zawierającej ludzkie komórki opon mózgowo-rdzeniowych do kolby.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną około 75% do 80% konfluencji, zbierz i zapisz pożywkę hodowlaną HMC w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj do probówki kompletną pożywkę do hodowli opon mózgowo-rdzeniowych w stosunku jeden do jednego.
Na koniec odpipetuj czynniki wzrostu do probówki, aby utworzyć pożywkę kondycjonowaną przez HMC. Aby przetworzyć płyn mózgowo-rdzeniowy, najpierw umieść go w 15-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie, aby go schłodzić. Odwirować płyn w wirówce ze wstępnie schłodzoną wodą o sile 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odpipetować supernatant bez naruszania osadu komórkowego i sporządzić jego porcje w różnych probówkach. Teraz dodaj jeden mililitr PBS do osadu komórkowego, aby go ponownie zawiesić. Odwirować komórki w temperaturze 1 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odessać supernatant PBS, pozostawiając około 50 mikrolitrów na dnie probówki. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą zawiesiny komórek przed hodowlą komórek. Kilka czynników wzrostu zostało podwyższonych w pożywkach hodowanych z ludzkimi komórkami opon mózgowych.
Na początek obracaj rozmrożone kultury kriokonserwowanych CTC płynu mózgowo-rdzeniowego w temperaturze 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant za pomocą pipety. Dodaj jeden mililitr PBS, aby przepłukać osad komórkowy, ponownie odessać supernatant.
Następnie ponownie zawieś komórki w 450 mikrolitrach pożywki kondycjonowanej HMC w trzech oddzielnych dołkach 96-dołkowej płytki. Odpipetować 150 mikrolitrów zawiesiny komórek do trzech różnych dołków na 96-dołkowej płytce. Nośnik kondycjonowany w konsoli HMC należy uzupełniać nowym nośnikiem co trzy dni.
Gdy kultura komórkowa osiągnie 90% konfluencji, przenieś trypsynizowane komórki studzienki do pustej studzienki na 24-dołkowej płytce. Podczas ciągłej hodowli komórek nowotworowych wybierz klony komórek, które przekształcają się i rozszerzają wykładniczo, do dalszych eksperymentów. Na początek zidentyfikuj samice myszy NSG z niedoborem odporności z chorobą opon mózgowo-rdzeniowych lub LMD.
Umieść znieczuloną mysz na stole operacyjnym. Umieść nos myszy w zmodyfikowanym stożku w kształcie litery L aparatu stereotaktycznego, upewniając się, że nozdrza pozostają niezatkane. Delikatnie ciągnąc skórę do przodu po brzusznych powierzchniach obu małżowin usznych.
Następnie przymocuj go do stożka nosowego za pomocą taśmy. Poprowadź końcówki nożyczek chirurgicznych w dół od małżowin usznych przez kość potyliczną. Utwórz małe nacięcie w linii środkowej o wymiarach od pięciu do siedmiu milimetrów tuż nad wyczuwalną wklęsłością.
Za pomocą pary kleszczy z końcówkami o długości od jednego do dwóch milimetrów, delikatnie dociśnij cisterna magna. Umieść końcówki w pozycji zamkniętej i otwórz je, wywierając nacisk w dół na oponę twardą. Kontynuuj wykonywanie sekcji, aż błona opony twardej będzie wyraźnie widoczna, a związane z nią naczynia krwionośne będą widoczne w odsłoniętym obszarze.
Teraz trzymaj kleszcze otwarte, aby cofnąć otaczające mięśnie. Następnie przymocuj igłę o rozmiarze od 27 do 29 do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Włożyć strzykawkę pod oponę twardą, aby uwidocznić skos
.Stopniowo cofać tłok strzykawki, aby zebrać jak najwięcej płynu mózgowo-rdzeniowego. Natychmiast przenieś płyn do mikroprobówki wirówkowej. Umieść go na lodzie.
Odwirować próbkę o masie 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zaessaniu supernatantu odpipetować 500 mikrolitrów sterylnego PBS do osadu komórkowego. Odwirować osad o sile 257 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Odrzucić supernatant, a następnie przenieść osad na 96-dołkową płytkę zawierającą pożywkę kondycjonowaną przez HMC.
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół propagacji komórek nowotworowych krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF-CTCs) zebranych od pacjentów z chorobą leptomeningealną związaną z czerniakiem (M-LMD) w celu opracowania modeli przedklinicznych do badania M-LMD.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Biologia komórki
Tło
- Choroba leptomeningealna z czerniaka (M-LMD) jest ciężką formą przerzutów.
- CTC infiltrują płyn mózgowo-rdzeniowy, komplikując opcje leczenia.
- Rozumienie biologii CTC jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
- Obecne metody badania CTC w płynie CSF są ograniczone.
Cel badania
- Propagatywa CTC z płynu CSF u pacjentów z M-LMD.
- Stworzenie modeli przedklinicznych do badania patologii M-LMD.
- Ułatwienie analizy molekularnej i funkcjonalnej komórek M-LMD.
Stosowane metody
- Pre-pokrywanie kolb T175 poli-L-lizynę do hodowli komórek.
- Użycie ludzkich komórek oponowych do stworzenia pożywki warunkowej.
- Centryfugacja i przetwarzanie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Ustanowienie modeli ksenotransplantatów u myszy immunodeficytarnych.
Główne wyniki
- Skuteczna propagacja CTC z płynu CSF in vitro i in vivo.
- Wgląd w rolę mikrośrodowiska CSF w przeżywalności CTC.
- Identyfikacja czynników wzrostu, które poprawiają hodowlę CTC.
- Opracowanie metodologii do badania M-LMD skutecznie.
Wnioski
- Propagatywa CTC z płynu CSF stanowi cenne narzędzie w badaniach nad M-LMD.
- Zrozumienie biologii CTC może prowadzić do nowych strategii terapeutycznych.
- Dalsze doskonalenie metodologii jest potrzebne dla optymalnych wyników.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing ex vivo cultures of CSF-derived circulating tumor cells (CTCs) from melanoma-associated leptomeningeal disease (M-LMD) addresses a critical bottleneck in preclinical oncology research. This capability enables mechanistic de-risking and target validation for therapies aimed at a highly lethal metastatic niche with limited treatment options. The approach supports predictive confidence in early discovery and translational continuity for portfolio advancement in neuro-oncology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a disease-relevant CSF microenvironment.
- Supports functional validation of targets implicated in CTC survival and colonization.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling the biology of M-LMD at the cellular level.
- Provides a platform for pathway-specific inhibitor testing in patient-derived cells.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible ex vivo systems for quantitative assessment of drug efficacy.
- Standardizes culture conditions using HMC-conditioned media to enhance assay reliability.
- Enables expansion of rare CTCs for downstream molecular and functional analyses.
- Prepares validated cell lines for scalable compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Generates murine xenograft models for preclinical evaluation of candidate therapies.
- Aligns in vitro findings with in vivo disease progression and therapeutic response.
- Supports identification of translational biomarkers linked to CTC survival pathways.
- Enables risk-adjusted advancement of novel inhibitors targeting IGF and MAPK pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical validation by enabling the propagation and functional study of patient-derived CSF-CTCs. It integrates into workflows spanning target validation, assay development, and in vivo efficacy testing.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway elucidation in a clinically relevant context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation against patient-derived CTCs.
- Analytics: Supports molecular and cytokine profiling to compare survival factors and drug responses.
- Translational Research: Facilitates continuity from ex vivo culture to in vivo modeling and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for studying CTC-driven metastasis in neuro-oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in M-LMD research.
- Operational Value: Standardizes rare cell culture and expands access to functional preclinical models.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of neuro-oncology assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program learning in metastatic disease research.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rare cell isolation and ex vivo culture techniques.
- Demands access to specialized cell culture infrastructure and conditioned media preparation.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for other tumor types or CSF-derived cell populations.
- Dependent on availability of patient-derived CSF samples and immunodeficient animal models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:36
Preparation of Human Meningeal Cell (HMC) Conditioned Media and Collection of Cerebrospinal Fluid for the Culture of Circulating Tumor Cells
3:23
In Vitro Culture and Expansion of Cerebro Spinal Fluid (CSF)-Circulating Tumor Cells (CTCs) for the Study of Leptomeningeal Disease
4:24
CSF Collection from Mice with Leptomeningeal Disease for Subsequent Clone Expansion
