Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Choroba oponowo-rdzeniowa spowodowana czerniakiem lub M-LMD jest agresywną postacią przerzutów do opon mózgowych, w której krążące komórki nowotworowe lub CTC naciekają do płynu mózgowo-rdzeniowego. Niestety, nie ma skutecznych metod leczenia M-LMD, więc zrozumienie jego biologii pomoże opracować terapie zmniejszające śmiertelność. Ostatnie doniesienia wykazały, w jaki sposób CTC mogą kolonizować środowisko CSF ubogie w składniki odżywcze, na przykład wykorzystując zdolność wychwytywania żelaza w celu zwiększenia ich przeżywalności i uzupełnienia C3 w celu promowania inwazji do płynu mózgowo-rdzeniowego przez splot naczyniówkowy.

Dlatego CTC są bardzo dobrymi narzędziami do badania M-LMD. Największym wyzwaniem w badaniu CTC płynu mózgowo-rdzeniowego jest ogólny brak modelu przedklinicznego i niedobór tych komórek. Znalezienie sposobów na wyhodowanie tych rzadkich i delikatnych komórek od pacjentów oraz wygenerowanie modelu ksenoprzeszczepu przyniesie naukowcom ogromne korzyści w zrozumieniu patologii M-LMD i zaprojektowaniu racjonalnych terapii.

Opracowaliśmy metodę, która z powodzeniem rozmnożyła CTC płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z M-LMD in vitro i in vivo, co dało nam możliwość przeprowadzenia analiz molekularnych i funkcjonalnych komórek M-LMD, a także badania skuteczności w modelach ksenoprzeszczepów. Chociaż obecne metodologie są niedoskonałe, możliwość hodowli i rozszerzenia CTC płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów z czerniakiem po raz pierwszy dała nam wgląd w znaczenie zrozumienia mikrośrodowiska płynu mózgowo-rdzeniowego. Aby rozpocząć, należy wstępnie pokryć kolbę T175 poli-l-lizyną.

Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Teraz użyj sterylnej pipety serologicznej, aby odessać roztwór lizyny. Odpipetować 30 mililitrów kompletnej pożywki do hodowli opon mózgowo-rdzeniowych zawierającej ludzkie komórki opon mózgowo-rdzeniowych do kolby.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną około 75% do 80% konfluencji, zbierz i zapisz pożywkę hodowlaną HMC w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj do probówki kompletną pożywkę do hodowli opon mózgowo-rdzeniowych w stosunku jeden do jednego.

Na koniec odpipetuj czynniki wzrostu do probówki, aby utworzyć pożywkę kondycjonowaną przez HMC. Aby przetworzyć płyn mózgowo-rdzeniowy, najpierw umieść go w 15-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie, aby go schłodzić. Odwirować płyn w wirówce ze wstępnie schłodzoną wodą o sile 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odpipetować supernatant bez naruszania osadu komórkowego i sporządzić jego porcje w różnych probówkach. Teraz dodaj jeden mililitr PBS do osadu komórkowego, aby go ponownie zawiesić. Odwirować komórki w temperaturze 1 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać supernatant PBS, pozostawiając około 50 mikrolitrów na dnie probówki. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą zawiesiny komórek przed hodowlą komórek. Kilka czynników wzrostu zostało podwyższonych w pożywkach hodowanych z ludzkimi komórkami opon mózgowych.

Na początek obracaj rozmrożone kultury kriokonserwowanych CTC płynu mózgowo-rdzeniowego w temperaturze 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant za pomocą pipety. Dodaj jeden mililitr PBS, aby przepłukać osad komórkowy, ponownie odessać supernatant.

Następnie ponownie zawieś komórki w 450 mikrolitrach pożywki kondycjonowanej HMC w trzech oddzielnych dołkach 96-dołkowej płytki. Odpipetować 150 mikrolitrów zawiesiny komórek do trzech różnych dołków na 96-dołkowej płytce. Nośnik kondycjonowany w konsoli HMC należy uzupełniać nowym nośnikiem co trzy dni.

Gdy kultura komórkowa osiągnie 90% konfluencji, przenieś trypsynizowane komórki studzienki do pustej studzienki na 24-dołkowej płytce. Podczas ciągłej hodowli komórek nowotworowych wybierz klony komórek, które przekształcają się i rozszerzają wykładniczo, do dalszych eksperymentów. Na początek zidentyfikuj samice myszy NSG z niedoborem odporności z chorobą opon mózgowo-rdzeniowych lub LMD.

Umieść znieczuloną mysz na stole operacyjnym. Umieść nos myszy w zmodyfikowanym stożku w kształcie litery L aparatu stereotaktycznego, upewniając się, że nozdrza pozostają niezatkane. Delikatnie ciągnąc skórę do przodu po brzusznych powierzchniach obu małżowin usznych.

Następnie przymocuj go do stożka nosowego za pomocą taśmy. Poprowadź końcówki nożyczek chirurgicznych w dół od małżowin usznych przez kość potyliczną. Utwórz małe nacięcie w linii środkowej o wymiarach od pięciu do siedmiu milimetrów tuż nad wyczuwalną wklęsłością.

Za pomocą pary kleszczy z końcówkami o długości od jednego do dwóch milimetrów, delikatnie dociśnij cisterna magna. Umieść końcówki w pozycji zamkniętej i otwórz je, wywierając nacisk w dół na oponę twardą. Kontynuuj wykonywanie sekcji, aż błona opony twardej będzie wyraźnie widoczna, a związane z nią naczynia krwionośne będą widoczne w odsłoniętym obszarze.

Teraz trzymaj kleszcze otwarte, aby cofnąć otaczające mięśnie. Następnie przymocuj igłę o rozmiarze od 27 do 29 do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Włożyć strzykawkę pod oponę twardą, aby uwidocznić skos

Stopniowo cofać tłok strzykawki, aby zebrać jak najwięcej płynu mózgowo-rdzeniowego. Natychmiast przenieś płyn do mikroprobówki wirówkowej. Umieść go na lodzie.

Odwirować próbkę o masie 257 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zaessaniu supernatantu odpipetować 500 mikrolitrów sterylnego PBS do osadu komórkowego. Odwirować osad o sile 257 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Odrzucić supernatant, a następnie przenieść osad na 96-dołkową płytkę zawierającą pożywkę kondycjonowaną przez HMC.