Name: Całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj system TruVivo do hodowli ludzkich hepatocytów w badaniach metabolicznych i toksykologicznych. Ta metoda umożliwia precyzyjne przewidywanie właściwości farmakokinetycznych związków w rozwoju leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Mellissie Keller i Wendy Hetman za pomoc w recenzowaniu rękopisów i rycin.

A Physiologically-Relevant All-Human 2D+ Hepatic System for Drug Discovery

<ol><li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich-cultured+hepatocytes%3A+an+in+vitro+model+to+evaluate+hepatobiliary+transporter-based+drug+interactions+and+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity.</a> Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).</li>
<li>Baudy, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microphysiological+systems+development+guidelines+for+safety+risk+assessment+in+the+pharmaceutical+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).</li>
<li>Khetani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+liver+tissues+for+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Microengineered liver tissues for drug testing.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).</li>
<li>Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latest+impact+of+engineered+human+liver+platforms+on+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Latest impact of engineered human liver platforms on drug development.</a> APL Bioengineering. 5 (3), 031506(2021).</li>
<li>Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+platform+to+maintain+long-term+phenotype+of+primary+human+hepatocytes+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).</li>
<li>Weaver, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology%2C+functionality%2C+and+longevity+of+a+novel+all+human+hepatic+cell-based+tri-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system.</a> Toxicology In Vitro. 86, 105504(2023).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+and+shear+stresses+modulate+hepatocyte+functions+in+a+fibrotic+liver+sinusoidal+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model.</a> American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).</li>
<li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+stress+induced+cell+death+mechanisms+in+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma%3A+in+vitro+and+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).</li>
<li>Mooney, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+from+differentiation+to+growth+in+hepatocytes%3A+control+by+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).</li>
<li>Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extracellular+matrix+topology+on+cell+structure%2C+function%2C+and+physiological+responsiveness%3A+hepatocytes+cultured+in+a+sandwich+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration.</a> The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).</li>
<li>Hamilton, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+morphology+and+cytochrome+P450+expression+in+human+hepatocytes+by+extracellular+matrix+and+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions.</a> Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).</li>
<li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li>
<li>Sivaraman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscale+in+vitro+physiological+model+of+the+liver%3A+predictive+screens+for+drug+metabolism+and+enzyme+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction.</a> Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).</li>
<li>Goulet, F., Normand, C., Morin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+promote+tissue-specific+function%2C+biomatrix+deposition+and+junctional+communication+of+primary+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes.</a> Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).</li>
<li>Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. 62nd Annual Meeting & ToxExpo, , Nashville, TN. 4283(2023).</li>
</ol>

JO, LW, EG, EL, SP i JW są pracownikami LifeNet Health, organizacji non-profit, która produkuje TV2D+.

Opisany system hodowli wątroby można ustalić w laboratoriach wyposażonych w standardowe oprzyrządowanie do hodowli tkankowych. Składający się z PHH hodowanych w komórkach zasilających, system pozwala użytkownikowi na hodowlę PHH przez co najmniej dwa tygodnie ze stabilną produkcją albuminy i syntezą mocznika. Ze względu na zmienność partii dawcy PHH, do stosowania w systemie zaleca się stosowanie tylko wstępnie przesianych i kwalifikowanych PHH. Chociaż liczba przyłączonych PHH różni się w zależności od partii dawcy i gęstości wysiewu, względna plastyczność pozostaje podobna w każdej partii dawcy. Chociaż zalecane są zalecane gęstości wysiewu, powyższe dane sugerują, że gęstość wysiewu hepatocytów można dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych; Należy jednak zauważyć, że wysiewanie większej liczby PHH może nie zapewnić wyższych lub bardziej spójnych wyników funkcjonalnych. Analiza ocenianych partii PHH wykazała najniższy CV dla produkcji albuminy i syntezy mocznika przy niższych gęstościach wysiewu wynoszących 150 000 PHH/dołek i 200 000 PHH/dołek; Nie stwierdzono jednak istotnych różnic między albuminą a mocznikiem przy jakiejkolwiek gęstości wysiewu. Wyższe gęstości wysiewu wynoszące 250 000 PHH/studzienkę i 300 000 PHH/studzienkę wykazują większy spadek albuminy i mocznika w ciągu 14-dniowego okresu hodowli. Wrodzona zmienność dawczy w zakresie plastyczności może wpływać na spójność produkcji albuminy i syntezy mocznika przy 250 000 PHH/basenie i 300 000 PHH/dołku dla badanych partii dawcy. Podobnie jak w przypadku dużych sferoidów hepatocytów, nadmierne wysiewanie PHH w systemie TV2D+ może mieć negatywny wpływ na długoterminową hodowlę i funkcjonalność PHH.
Wszystkie etapy rozmrażania, powlekania i konserwacji mają kluczowe znaczenie dla pomyślnej kultury i generowania danych; Istnieje jednak kilka typowych błędów, których niedoświadczeni użytkownicy mogą uniknąć. PHH są bardzo podatne na uszkodzenia wtórne do wahań temperatury, naprężeń ścinających i ekspozycji na powietrze 9,10. Podczas rozmrażania PHH należy zachować ostrożność, aby uniknąć wydłużenia czasu rozmrażania i nadmiernego pipetowania. Zastosowanie metody nalewania ręcznego, timera i natychmiastowego przeniesienia z kąpieli wodnej na lód zmniejszy te typowe błędy, które mogą wpływać na żywotność i plastyczność PHH. Dodatkowo, ponieważ problemy z łańcuchem dostaw stają się coraz bardziej powszechne, uzyskanie płytek pokrytych kolagenem może być trudne. Aby przezwyciężyć ten problem, można zastosować ręczne powlekanie płytek poddanych działaniu kultur tkankowych przy użyciu komercyjnych roztworów kolagenu typu I (5-10 μg/cm2); Jednak w celu uzyskania optymalnej wydajności i konsystencji zaleca się stosowanie wstępnie powlekanych płytek kolagenowych. W procesie przechodzenia od hodowli wyłącznie komórek zasilających do wprowadzenia PHH bardzo ważne jest, aby zapobiec wysuszeniu warstwy komórek zasilających. Nigdy nie dopuszczaj do kontaktu z powietrzem ogniw zasilających. Każdy czas ekspozycji na powietrze może prowadzić do złej jakości warstwy komórek zasilających, co negatywnie wpłynie na długoterminową hodowlę PHH. Najlepszą praktyką jest pozostawienie niewielkiej ilości pozostałej pożywki między wymianami pożywki. Czasami PHH mogą zawierać nadmiar zanieczyszczeń z izolacji, co może utrudniać obserwację morfologii. Aby rozwiązać ten problem, należy wstrząsnąć płytką przed wymianą podłoża i użyć aspiracji próżniowej. Na koniec, wykonując zmianę pożywki, ostrożnie zasysaj zużytą pożywkę, uważając, aby nie naruszyć hodowanych komórek. Odpipetować objętość świeżego podłoża z boku studzienki, aby uniknąć pipetowania bezpośrednio na warstwę komórek. Użytkownik powinien również unikać ekspozycji na powietrze przy każdej wymianie pożywki, stosując zalecaną wymianę z 3 dołkami (sekcje 3 i 4). Należy również zauważyć, że codzienna zmiana podłoża jest idealna, ale nie jest wymagana.
Chociaż mikroskopy fluorescencyjne stały się powszechne w większości laboratoriów, oprogramowanie potrzebne do przeprowadzenia określonej analizy obrazu może wiązać się z dodatkowymi wydatkami. ImageJ można pobrać za darmo, dzięki czemu jest to łatwo dostępne narzędzie do analizy obrazu. Kroki w protokole stanowią podstawę, do której użytkownik może potrzebować optymalizacji, w szczególności analizy cząstek barwienia DAPI; jednakże w przypadku braku możliwości obrazowania fluorescencyjnego, wartości przyłączenia PHH w dniu 14 są podawane na świadectwach analizy specyficznych dla partii. Słabe progowanie spowoduje niedokładne zliczanie cząstek DAPI. Zaleca się również sprawdzenie powierzchni poszczególnych cząstek DAPI przed ustawieniem wykluczenia rozmiaru. Można to osiągnąć za pomocą ikony owalu [Rysunek 2 (1), ikona koła poniżej zakładki Edycja ] i narysując okrąg obejmujący cząstkę DAPI. Zakładka Analiza może być następnie użyta do zmierzenia powierzchni wybranej cząstki DAPI. Konkretne pomiary można wybrać za pomocą opcji Ustaw pomiary w zakładce Analiza [krok 8.9 i Rysunek 2 (4)].
Obecne metody hodowli PHH obejmują stosowanie powłok, takich jak kolagen-I, w celu zwiększenia przyczepu komórek w tradycyjnej dwuwymiarowej monokulturze11 lub nakładania na matrycę zewnątrzkomórkową, takiej jak Matrigel na bazie myszy, technika powszechnie określana jako "kultura kanapkowa"12,13,14,15. Podczas gdy technika hodowli kanapkowej poprawia morfologię i polarność PHH w czasie w porównaniu z tradycyjną monokulturą, oba podejścia nadal nie zapewniają długoterminowej stabilności fenotypowej w kulturze dla większości partii PHH na płytkach. Inną metodą stosowaną do hodowli PHH jest tworzenie sferoid 3D; jednakże, jak wcześniej stwierdzili Glicklis i wsp.4, mogą wystąpić wyzwania techniczne związane z odtwarzalnością wielkości sferoidów ze względu na zmienność dawcy. W celu stworzenia bardziej fizjologicznie istotnego modelu wątroby opracowano modele wielokomórkowe. Jak opisali Ware i wsp.7, zastosowanie mikrowzorców, mysie fibroblasty i pierwotne ludzkie sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby otoczone PHH umożliwiły dłuższy czas hodowli in vitro. Jednak mikrowzorce mogą być złożonym i czasochłonnym procesem, a komórki karmiące inne niż ludzkie mogą przyczyniać się do tła w sygnałach metabolicznych, ograniczając użyteczność tej platformy w niektórych zastosowaniach. Wykorzystanie różnych komórek niezwiązanych z wątrobą, w tym ludzkich i szczurzych fibroblastów skórnych oraz komórek śródbłonka aorty bydlęcej jako komórek żywicielskich do kohodowli hepatocytów, wykazało wydzielanie albuminy i tworzenie ścisłych połączeń podobnych do kokultur komórek żywicielskich pochodzenia wątrobowego16. Jednak mechanizm interakcji między komórkami nieodżywiającymi się przez wątrobę TV2D+ a PHH w hodowli musi być dalej badany, aby lepiej zrozumieć wpływ na stabilność i funkcjonalność PHH w tym systemie. System hodowli opisany wcześniej przez Weavera i wsp.8 może z powodzeniem hodować PHH w koloniach wątrobowych przez okres do 42 dni, tworząc rozległe sieci kanałów żółciowych. PHH hodowane w tym systemie utrzymywały kluczową funkcjonalność wątroby, w tym aktywność cytochromu 1A2, 2B6 i 3A4 oraz aktywność enzymów opartą na urydynie 5′-difosfo-glukuronozylotransferazie (UGT), tworzenie metabolitów fazy I i II, produkcję albuminy i syntezę mocznika przez co najmniej 22 dni in vitro bez Matrigel. Ten system hodowli daje stabilne, fizjologicznie istotne wyniki, które można łatwo dostosować do każdego laboratorium do zastosowań farmakologicznych i toksykologicznych. Chociaż kluczowe funkcje PHH są zachowane w systemie TV2D+, nie dokonano bezpośrednich porównań z modelem sferoidalnym 3D; jednak przyszłe prace porównujące tych samych dawców PHH między systemami hodowli okażą się cenne w określeniu granic i zalet obu metod.
Potencjalne zastosowania TV2D+ obejmują ocenę klirensu metabolicznego i interakcji lek-lek związków o niskiej rotacji, uszkodzenie wątroby wywołane lekami oraz ocenę ryzyka agrochemikaliów. Dokładne przewidywanie klirensu wątrobowego nowych i pojawiających się leków opiera się na stabilnej i przedłużonej hodowli PHH z zachowaniem kluczowej funkcjonalności komórek wątrobowych, co jest szczególnie trudne w przypadku oceny związków o niskiej rotacji. Ponadto ocena ryzyka i toksyczność wątroby wywołana chemikaliami są głównymi problemami zdrowotnymi, a obecne modele nie zapewniają długoterminowej stabilności i funkcjonalności w hodowli, aby dokładnie ocenić potencjalną przewlekłą toksyczność chemiczną, która może być wtórna do ostrego narażenia. Zdrowe i chore PHH hodowane w TV2D+ wykazywały charakterystyczne różnice w funkcji i usposobieniu lipidów, które utrzymywały się wczasie17. Badania te potwierdzają, że TV2D+ jest obiecującym narzędziem do różnych zastosowań farmakologicznych i toksykologicznych.

Przewidywanie bezpieczeństwa i skuteczności terapeutycznej jest ważną częścią przedklinicznego rozwoju leków. Jednak konwencjonalne przedkliniczne modele wątroby in vitro mają ograniczoną zdolność do dokładnego naśladowania mikrośrodowiska komórkowego wątroby in vivo oraz utrzymania funkcjonalności i morfologii hepatocytów w czasie. Istnieje zapotrzebowanie na modele, które zapewniają stabilną kompetencję metaboliczną przez ponad 1 tydzień, aby ocenić związki o powolnej rotacji lub zbadać wyniki związane z podostrą lub przewlekłą ekspozycją. Testy in vivo na zwierzętach często nie są w stanie przewidzieć skuteczności i ryzyka leku ze względu na różnice translacyjne w mechanizmach klirensu wątrobowego u ludzi1. Obecne dwuwymiarowe (2D) modele wątroby in vitro, takie jak tradycyjna monokultura pierwotnych ludzkich hepatocytów (PHH) lub kultury kanapkowe, nie mają stabilności fenotypowej i długowieczności w hodowli, co prowadzi do utraty kluczowych funkcji komórek wątrobowych i integralności architektonicznej w miarę upływu czasu2. Alternatywna metoda polega na tworzeniu trójwymiarowych (3D) sferoid hepatocytów, co zapewnia bardziej odpowiednie mikrośrodowisko w porównaniu z hodowlą 2D. Metoda ta jest jednak ograniczona dostępnością surowców, selekcją partii dawcy PHH, odtwarzalnością i utratą żywotności wraz ze wzrostem rozmiaru sferoidów3,4,5,6. Wprowadzono platformy wielokomórkowe, w których PHH są wysiewane komórkami zasilającymi na płytki o stałym rozmiarze, z mikrowzorami. Chociaż modele te mogą umożliwiać dłuższe czasy hodowli, komórki żywicielskie inne niż ludzkie używane w tych platformach mogą zmieniać wyniki eksperymentów i ograniczać ich zastosowanie ze względu na wrodzony wkład tła w usuwanie leków i profile metaboliczne1,7. Układ wątrobowy TruVivo 2D+ (TV2D+) opisany niedawno w Weaver, et al8, został opracowany w celu rozwiązania niektórych ograniczeń tradycyjnych, kokulturowych i 3D metod hodowli PHH. Komórki nieżywiące wątroby zmniejszają międzygatunkowe różnice w metabolizmie i produkcji parakrynnej oraz zapewniają wsparcie niezbędne dla pierwotnych hepatocytów w powtarzalny, solidny sposób, którego nie mogą zapewnić odpowiednie niemiąższowe komórki wątroby z jednej partii dawcy ze względu na ograniczenia w ekspansji, fenotypie i wydajności. Wybrane komórki zasilające były w stanie być konsekwentnie rozwijane przed użyciem i nie wymagały transformacji ani różnicowania. Jak opisali Glicklis et al.4 i Khetani et al.5, modele hodowli 3D, takie jak sferoidy hepatocytów, mają wyzwania związane z odtwarzalnością ze względu na zmienność dawcy i utrzymanie spójności wielkości sferoidów, co wpływa na dyfuzję składników odżywczych w sferoidach większych niż 200 μm, prowadząc do zmniejszenia żywotności i funkcjonalności. Podobnie jak tworzenie sferoid 3D, system TV2D+ opiera się na samoorganizacji PHH; jednak utworzone kolonie PHH są rozproszone na powierzchni studni na głębokości pojedynczej komórki, a nie zagęszczane w pojedynczym agregatzie. Ta metoda hodowli może być przydatna do rozwiązania problemu zmienności dawcy, umożliwiając platerowanie PHH, hodowlę i utrzymanie podstawowej funkcjonalności przy różnych gęstościach wysiewu. System TV2D+ może również zwiększyć niezawodność obsługi przez użytkownika z powodu utraty podczas manipulacji lub specjalistycznego sprzętu wymaganego do przeprowadzenia rozszerzonej hodowli w sferoidach 3D.

System TV2D+ łączy standardową hodowlę 2D z długowiecznością i stabilnością fenotypową, które zwykle towarzyszą systemom 3D. Opisany w niniejszym dokumencie protokół zawiera instrukcje krok po kroku dla użytkowników posiadających podstawowe umiejętności w zakresie hodowli tkankowych w laboratoriach wyposażonych w standardowe wyposażenie, takie jak szafy bezpieczeństwa biologicznego, wirówki i inkubatory CO2 . Każdy etap procesu jest szczegółowo opisany, w tym przygotowanie podłoża, rozmrażanie, powlekanie i konserwacja powstałego systemu hodowli. Protokół zawiera również metodę określania podstawowych wyjść funkcji hepatocytów, albuminy i mocznika, a także analizę obrazu immunofluorescencyjnego w celu określenia przyłączenia PHH do normalizacji. Po prawidłowym ustaleniu, PHH w TV2D+ organizują się w kolonie hepatocytów, naśladując natywną morfologię wątroby, i utrzymują przedłużoną żywotność, integralność architektoniczną i fizjologicznie istotne poziomy albuminy i mocznika przez co najmniej 2 tygodnie8. Ponieważ system może dopuszczać różne gęstości wysiewu PHH, może być przydatny w zwiększaniu dostępności mniej nadających się do uprawy partii PHH, które mają pożądane cechy dawcy. To połączenie dostępności i funkcjonalności sprawia, że TV2D+ jest odpowiednim modelem wątroby do różnych zastosowań farmakologicznych i toksykologicznych.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m PES&nbsp; Jednostka filtrująca&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>565-0020</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml lub 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>352196 lub 352070</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555, kozia anty-królik</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A-21428</td><td>Inne przeciwciała drugorzędowe mogą działać</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytokeratyny 18&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab24561</td><td>Konieczne przy użyciu tego samego rozcieńczenia</td></tr><tr><td>AOPI&nbsp;</td><td>Nexcelom&nbsp;</td><td>CS2-0106-5mL</td><td>Używany do liczenia celometrów&nbsp;</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego&nbsp;</td><td>Labconoco</td><td>3460801</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Czarnościenne, przezroczyste dno, płytka 96-dołkowa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>165305</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Sorvall X4R</td><td>Zdolny do prędkości do 400 x g</td></tr><tr><td>Płytka pokryta kolagenem, 24-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662950</td><td>Powłoka kolagenowa z ogona szczura</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie</td><td>Nexcelom&nbsp;</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>Używany do liczenia celometrów&nbsp;</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana&nbsp;</td><td>LifeNet Zdrowie&nbsp;</td><td>MED-TCCM</td><td></td></tr><tr><td>Suplement kulturowy&nbsp;</td><td>LifeNet Zdrowie&nbsp;</td><td>MED-TCSC</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>00-4959-52</td><td>Zawiera podłoże montażowe</td></tr><tr><td>DPBS (-Ca, -Mg)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14190250</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Dodatek do ogniw zasilających&nbsp;</td><td>LifeNet Zdrowie&nbsp;</td><td>MED-TCSA</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do rozmrażania komórek podajników</td><td>LifeNet Health&nbsp;</td><td>MED-FCTM</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>Wyposażony w filtry dostosowane do potrzeb użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Pożywka do rozmrażania hepatocytów</td><td>LifeNet Health&nbsp;</td><td>MED-HHTM4C-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA albuminy ludzkiej&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab108788</td><td>Konieczne, jeśli używasz tego samego rozcieńczenia</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki zasilające</td><td>LifeNet Health&nbsp;</td><td>PHFC24</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator nawilżany&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97025-842</td><td>Zdolność do emisji 5% CO2&nbsp; </td></tr><tr><td>IC Bufor utrwalający</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>00-8222-49</td> Można <td>również stosować 10% formalinę na bazie paraformaldehydu</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Insitute of Health&nbsp;</td><td>Wersja 1.52a&nbsp;</td><td>1.52a lub wyższa&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconą fazą kontrastu&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>CK40-F100</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>VWR</td><td>20170-022</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipety (różne rozmiary)</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>Preferencje użytkownika ErgoOne</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor przepuszczalny (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>00-8333-56</td><td>Inne przepuszczalne mogą pracować</td></tr><tr><td>Czytnik płytek&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td>CLARIOstar</td><td>Zdolny do odczytu absorbancji 450-640 nm</td></tr><tr><td>Medium galwaniczne&nbsp;</td><td>LifeNet Zdrowie&nbsp;</td><td>MED-TCPM</td><td></td></tr><tr><td>Suplement galwaniczny &nbsp;</td><td>LifeNet Zdrowie&nbsp;</td><td>MED-TCSB</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne hepatocyty ludzkie&nbsp;</td><td>LifeNet Zdrowie&nbsp;</td><td>różne&nbsp;</td><td>Numer katalogowy może się różnić w zależności od numeru partii</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>A-21428</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Serologiczny kontroler pipet</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F110120</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Butelka do przechowywania 100&ndash; 500 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76311-770</td><td>Preferencje użytkownika&nbsp;</td></tr><tr><td>Test azotu mocznikowego (BUN)&nbsp;</td><td>Stanbio</td><td>0580-250</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>PolyScience</td><td>WBE05</td><td>Możliwość stosowania w temperaturze 37 stopni; Z</td></tr></tbody></table>

całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków

An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications

Znalezienie długoterminowego, istotnego dla człowieka modelu hodowli pierwotnych ludzkich hepatocytów (PHH) do badań farmakologicznych i toksykologicznych pozostaje wyzwaniem. Obecne platformy modeli in vitro są często niewygodne i złożone, brakuje im stabilności fenotypowej w czasie i nie obsługują wielu partii PHH, brakuje im odtwarzalności eksperymentalnej i elastyczności. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół rozmrażania, powlekania i konserwacji całkowicie ludzkiego układu wątrobowego 2D+ (TV2D+), który wykorzystuje standardowe techniki i sprzęt do hodowli dwuwymiarowej (2D), zachowując jednocześnie długowieczność i stabilność fenotypową w czasie, które zwykle towarzyszą bardziej złożonym systemom trójwymiarowym (3D). Wyniki wskazują na przywiązanie i procentową plastyczność w TV2D+ w funkcji gęstości wysiewu PHH, a także stabilną funkcjonalność przez co najmniej 2 tygodnie w kulturze. Oceniany jest zakres gęstości wysiewu PHH w celu uzyskania udanej długoterminowej hodowli. Po prawidłowym ustaleniu PHH w TV2D+ organizują się w kolonie hepatocytów, wyrażają marker specyficzny dla wątroby i utrzymują żywotność, integralność architektoniczną oraz fizjologicznie istotne poziomy albuminy i mocznika. Ta unikalna kombinacja atrybutów sprawia, że system TV2D+ jest odpowiednim modelem wątroby do różnych zastosowań farmakologicznych i toksykologicznych.

Ogólna metoda wysiewania, hodowli i podstawowych testów funkcjonalnych systemu hodowli wątrobowej obejmuje powszechne techniki hodowli pierwotnych komórek oraz analizy, co przedstawiono na Rysunku 1. Adhezję hepatocytów oraz procentową zdolność do wysiewu obliczono w 14. dniu przy użyciu analizy ImageJ co najmniej pięciu obrazów barwienia Cytokeratyną 18 i DAPI na studzienkę (Rysunek 2). Reprezentatywne obrazy PHHs hodowanych z komórkami karmionymi przedstawiono na Rysunku 3. Różne gęstości wysiewu komórek wątrobowych wykazały wizualne różnice w stopniu konfluencji w zależności od gęstości wysiewu i utrzymywały typową, sześcienną morfologię wątrobową przez 14 dni hodowli. Obrazy partii dawców hepatocytów A i B zarejestrowano dla każdej testowanej gęstości wysiewu (Rysunek 4A). Średni procentowa zdolność do wysiewu dla dawcy B (89,04% ± 3,99%, 198 552 ± 49 885 PHHs) była wyższa niż dla dawcy A (66,08% ± 6,67%, 146 128 ± 33 063 PHHs) we wszystkich zastosowanych gęstościach wysiewu (Rysunek 4B). Dawca A wykazał znacząco wyższą procentową zdolność do wysiewu przy użyciu 150 000 PHHs/well (76,07% ± 12,87%) w porównaniu do 250 000-300 000 PHHs/well (62,75% ± 9,64%). U dawcy B nie stwierdzono istotnych różnic w procentowej zdolności do wysiewu hepatocytów. Dawca B wykazał najniższą zdolność do wysiewu hepatocytów (85,78% ± 13,25%) przy najwyższej gęstości wysiewu, 300 000 PHHs/well. Podobnie jak w przypadku dawcy A, wysiew dawcy B w gęstości 150 000 PHHs/well zapewnił najwyższą procentową zdolność do wysiewu hepatocytów (94,75% ± 15,07%).
Produkcję albuminy oraz syntezę mocznika mierzono w trzech punktach czasowych podczas 14-dniowego okresu hodowli i normalizowano do obliczonej liczby przytwierdzonych hepatocytów. Ogólnie rzecz biorąc, dawca A wykazywał zwiększoną produkcję albuminy w porównaniu z dawcą B (41,32 ± 4,58 µg alb/day/106 PHHs vs. 34,66 ± 10,03 µg alb/day/106 PHHs) (Rysunek 5). Najwyższą produkcję albuminy u dawców A i B odnotowano przy zagęszczeniu wysiewu hepatocytów wynoszącym 150 000 PHHs/well, odpowiednio 45,91 ± 5,96 µg alb/day/106 PHHs i 48,67 ± 20,44 µg alb/day/106 PHHs. Nie stwierdzono istotnych różnic w produkcji albuminy w zastosowanych gęstościach wysiewu. Jak stwierdzili Baudy et al.3, pożądane jest, aby mikrofizjologiczne systemy wątrobowe utrzymywały stałą produkcję albuminy i syntezę mocznika z wahaniami mniejszymi niż 50% w ciągu 14 dni hodowli. Współczynnik zmienności (CV) obliczono, dzieląc średnią przez odchylenie standardowe dla dni 7, 10 i 14. Wszystkie próbki analizowano w dubletach. CV dla wydajności albuminy w ciągu 14-dniowego okresu hodowli przy 150 000 PHHs/well wyniosło 12,24% dla dawcy A i 37,97% dla dawcy B, co było wartością poniżej pożądanego kryterium 50%. Wysoka wariancja produkcji albuminy była widoczna u obu dawców, A i B, przy wysiewie 250 000 i 300 000 PHHs/well. Przy tych gęstościach wysiewu u obu dawców zaobserwowano gwałtowny spadek produkcji albuminy między 7, 10 a 14 dniem hodowli (CV dawca A: 22,49%, dawca B: 45,07%).
Synteza mocznika u dawcy B (95,09 ± 18,91 µg urea/day/106) była zwiększona w porównaniu z dawcą A (64,92 ± 4,66 µg urea/day/106 PHHs) po uśrednieniu danych specyficznych dla partii PHH z dni 7, 10 i 14 (Rycina 6). Największą syntezę mocznika w ciągu 14-dniowego okresu hodowli odnotowano dla dawcy B (113,49 ± 37,34 µg urea/day/106 PHHs) przy gęstości wysiewu 150 000 PHHs/well oraz dla dawcy A (69,12 ± 17,06 µg urea/day/106 PHHs) przy gęstości 200 000 PHHs/well. Obie partie dawców wykazały najniższą produkcję mocznika i najwyższy współczynnik zmienności (CV) przy gęstości 300 000 PHHs/well. Nie zaobserwowano istotnych różnic w syntezie mocznika dla zastosowanych gęstości wysiewu. Najniższy CV syntezy mocznika dla dawcy A stwierdzono przy hodowli w gęstości 250 000 PPHs/well (23,11%), a dla dawcy B przy 200 000 PHHs/well (28,26%). Jak podkreślają te wyniki, optymalna gęstość wysiewu dla danej partii PHH zależy od pożądanego stopnia konfluencji w momencie przeprowadzania analizy oraz od charakteru mierzonych parametrów; wyższa gęstość wysiewu nie zawsze musi korelować z silniejszym sygnałem lub szerszym zakresem dynamicznym.
<img alt="Proces rozmrażania i wysiewania komórek feederowych oraz hepatocytów, testy funkcjonalne; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy wysiewania, hodowli i testów funkcjonalnych hepatocytów z komórkami feederowymi. (A) Komórki feederowe są rozmrażane w specjalnym medium do rozmrażania (patrz Tabela materiałów), resuspendowane w kompletnym medium do wysiewania (patrz Tabela materiałów), a następnie komórki są liczone. Komórki są rozcieńczane, wysiewane i inkubowane przez 60 min w 37 °C/5% CO2. (B) Hepatocyty są rozmrażane w specjalnym medium do rozmrażania (patrz Tabela materiałów), resuspendowane w kompletnym medium do wysiewania, a następnie komórki są liczone. Hepatocyty są rozcieńczane i wysiewane wraz z komórkami feederowymi. Komórki są inkubowane przez 2-4 h w 37 °C/5% CO2, z wstrząsaniem w ruchu N-S-E-W co 15 min przez pierwsze 60 min hodowli. Medium do wysiewania jest zastępowane uprzednio ogrzanym kompletnym medium hodowlanym w celu utrzymania hodowli (patrz Tabela materiałów). Hodowle są zasilane codziennie. (C) W dniach 7, 10 i 14 pobierane są próbki medium do oznaczenia albumin i mocznika. Po pobraniu próbek w dniu 14 komórki są utrwalane i barwione przeciwciałem przeciwko Cytokeratynie 18 (patrz Tabela materiałów) przez 16-24 h w 4 °C. Następnie są inkubowane z odpowiednim przeciwciałem wtórnym, przemywane i montowane z DAPI (patrz Tabela materiałów) w celu wykonania zdjęć i analizy obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces analizy komórek; progowanie obrazu, analiza cząsteczek DAPI, liczenie komórek; schemat pracy mikroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza obrazów przy użyciu oprogramowania ImageJ. Przetwarzanie wykonanych zdjęć w programie ImageJ. Krok 1: do wszystkich obrazów stosowana jest skala na podstawie paska skali specyficznego dla danego mikroskopu. Krok 2: zmiana typu obrazu. Krok 3: zastosowanie progu w celu wyselekcjonowania cząsteczek DAPI. Krok 4: przeprowadzenie analizy cząsteczek i zapisanie liczby obiektów. Krok 5: aby określić liczbę przytwierdzonych komórek feeder, obraz scalony jest przeliczany za pomocą narzędzia multi-point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie gęstości hodowli komórek wątroby w czasie; obrazy mikroskopowe; analiza wzrostu komórek; Dawca A vs. B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Morfologia różnych gęstości wysiewu komórek wątroby hodowanych z komórkami wspierającymi. Reprezentatywne obrazy z 7. i 14. dnia hodowli PHHs z komórkami wspierającymi (50 000 komórek/dołek) przy gęstościach wysiewu komórek wątroby wynoszących 150 000, 200 000, 250 000 i 300 000 PHHs/dołek. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 10x w odwróconym mikroskopie fazowo-kontrastowym. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy zmienności gęstości hepatocytów, barwienie immunofluorescencyjne; wykres analizy komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Fluorescencyjna immunocytochemia różnych gęstości wysiewu hepatocytów hodowanych z komórkami wspierającymi (feeder cells). (A) Reprezentatywne obrazy barwienia cytokeratyny 18 (czerwony) w 14. dniu dla gęstości wysiewu hepatocytów wynoszących 150,000, 200,000, 250,000 i 300,000 PHHs/well. Dwie studzienki dla każdej gęstości wysiewu utrwalono przez 30 min w 4 °C. Studzienki inkubowano przez 16-24 h w 4° C z przeciwciałem pierwszorzędowym w rozcieńczeniu 1:1000. Przeciwciało wtórne zastosowano w rozcieńczeniu 1:500 przez 30 min w 4 °C w ciemności. Do studzienek dodano barwnik jądrowy DAPI (niebieski) na 15 min w temperaturze pokojowej. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 10X w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Pasek skali = 100 µm. (B) Obliczona liczba przytwierdzonych hepatocytów i procent przytwierdzalności dla różnych gęstości wysiewu hepatocytów obliczone przy użyciu programu ImageJ. *p ≤ 0.05 względem procentu przytwierdzalności dla 200,000, 250,000 i 300,000 PHHs/well. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (n ≥ 5 obrazów na warunek). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie żywotności hepatocytów; stężenie PHH a produkcja albuminy; analiza danych na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Produkcja albuminy przez hepatocyty hodowane z komórkami wspierającymi. Produkcja albuminy przy gęstościach wysiewu komórek wątrobowych wynoszących 150 000, 200 000, 250 000 i 300 000 PHHs/studzienkę. Słupki reprezentują 14-dniową średnią mikrogramów albuminy/dzień znormalizowaną do całkowitej liczby przytwierdzonych hepatocytów. Linia reprezentuje CV między dniami 7, 10 i 14. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe (n ≥ 2 studzienki na warunek z powtórzeniami). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównujący syntezę mocznika w hepatocytach dwóch dawców, pokazujący zmienność w zależności od liczby komórek na dołek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Synteza mocznika w hepatocytach hodowanych z komórkami dokarmiającymi. Synteza mocznika przy gęstościach wysiewu komórek wątrobowych wynoszących 150 000, 200 000, 250 000 i 300 000 PHHs/dołek. Słupki reprezentują średnią 14-dniową ilość µg mocznika/dobę znormalizowaną do całkowitej liczby przytwierdzonych hepatocytów. Linia reprezentuje %CV pomiędzy dniami 7, 10 i 14. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (n ≥ 2 dołków na warunek wraz z powtórzeniami). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Standard (S) nr</td>
			<td>Stężenie (µg/mL)</td>
			<td>roztwór mocznika (µL)</td>
			<td>Pożywka kompletna (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>100</td>
			<td>53.3 
			roztwór stokowy 75 mg/dL </td>
			<td>346.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>100 
			(roztwór S1)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>25</td>
			<td>100 
			(roztwór S2)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>100 
			(roztwór S3)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>6.26</td>
			<td>100 
			(roztwór S4)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>3.125</td>
			<td>100 
			(roztwór S5)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>1.5625</td>
			<td>100 
			(roztwór S6)</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puste </td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie próbek wzorca mocznika.Z wykorzystaniem roztworu stokowego mocznika o stężeniu 75 mg/dL należy przygotować roztwór mocznika o stężeniu 100 µg/mL. Odmierzyć sugerowane objętości, aby uzyskać stężenia końcowe dla krzywej wzorcowej.

Ostatnie osiągnięcia techniczne umożliwiły skalowaną produkcję platformy in vitro do zastosowań związanych z metabolizmem leków i toksycznością. Całkowicie ludzki układ wątrobowy 2D+ (TV2D+) zapewnia fizjologicznie istotne wyniki przy użyciu tradycyjnych metod hodowli dwuwymiarowej. Protokół ten będzie wspierał użytkowników końcowych w konfiguracji, konserwacji i stosowaniu systemu.

Całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. ...

TruVivo został opracowany w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wygodną, a jednocześnie solidną platformę in vitro, która utrzymuje fenotypowo stabilne i funkcjonalne pierwotne ludzkie hepatocyty. Ze względu na te cechy system służy jako podstawowa platforma do udzielania odpowiedzi na szeroki zakres pytań dotyczących przedklinicznego opracowywania leków. Jednym z wyzwań jest potrzeba stworzenia systemu wielokomórkowego, który ma złożoność biologiczną niezbędną do odpowiedzi na dzisiejsze pytania, a jednocześnie jest łatwy w użyciu.Obecne systemy często nie są w stanie utrzymać morfologii i funkcji hepatocytów w dłuższej perspektywie lub stanowią wyzwanie techniczne przy ustalaniu rutynowych, powtarzalnych wyników. Dzięki TruVivo użytkownicy mogą nadal polegać na prostocie i elastyczności tradycyjnych technik hodowli komórkowych 2D. Dodatkowo nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt, a system jest podatny na tradycyjne metody analityczne.Dzięki TruVivo jesteśmy teraz w stanie dokładniej przewidzieć klirens metaboliczny, główne metabolity, kluczowe szlaki eliminacji, inne właściwości farmakokinetyczne związków z długimi okresami półtrwania przed oceną przedkliniczną. Na początek rozmrozić jedną butelkę każdego podłoża do rozmrażania komórek zasilających, suplementu A, suplementu B i suplementu C, w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Alternatywnie przechowuj je w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin.Przenieś całą zawartość każdej butelki rozmrożonego podłoża do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów lub 50 mililitrów. Aby przygotować kompletną pożywkę galwaniczną, weź butelkę pożywki galwanicznej i dodaj 4,5 mililitra suplementu B, a następnie 11 mililitrów suplementu A do butelki. W osobnej butelce wymieszaj 100 mililitrów pożywki hodowlanej, jeden mililitr suplementu C i 14 mililitrów suplementu A, aby przygotować kompletną pożywkę hodowlaną.Pozostały suplement C i suplement A należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do drugiego tygodnia przygotowania podłoża. Na początek rozmrozić komórki podajnika w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut. Natychmiast po rozmrożeniu umieść komórki podajnika na lodzie.Stosując techniki aseptyczne w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dodaj świeżo rozmrożone komórki do 10 mililitrów pożywki do rozmrażania komórek. Następnie za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów pobrać jeden mililitr powstałej zawiesiny komórek w pożywce do rozmrażania, umyć nią pustą fiolkę z komórkami i połączyć ją z resztą zawiesiny komórek. Odwiruj komórki w temperaturze pokojowej i 400G przez cztery minuty.Ostrożnie wyrzucić supernatant przez zasysanie lub pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego. Po ponownym zawieszeniu osadu w jednym mililitrze kompletnego podłoża galwanicznego, policz komórki podajnika. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórkową za pomocą kompletnego podłoża galwanicznego.Następnie umieść 500 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek na dołku w 24-dołkowej płytce pokrytej kolagenem. Poruszaj płytką w ruchu północnym, południowym, wschodnim, zachodnim, dwukrotnie potrząsając w przód iw tył w kierunku północ-południe, a następnie tym samym ruchem w kierunku wschód-zachód. Na koniec inkubuj płytkę przed wysianiem w niej pierwotnych ludzkich hepatocytów.Zbadaj przyczepienie komórki zasilającej przed rozmrożeniem hepatocytów do wysiewu. Przystąp do wykonywania posiewu pierwotnych ludzkich hepatocytów lub PHH po prawie jednej godzinie hodowli komórek zasilających. W tym celu, po 30 minutach hodowli komórek karmiących, przefiltruj wstępnie podgrzaną pożywkę do rozmrażania hepatocytów przez 0,2-mikronową jednostkę filtrującą z polieteru sulfonowego.Rozmrażaj PHH w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut. Natychmiast po rozmrożeniu umieść rozmrożone komórki na lodzie. Następnie, pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przenieś komórki do pożywki do rozmrażania hepatocytów.Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieść jeden mililitr zawiesiny hepatocytów w pożywce do rozmrażania z powrotem do fiolki i umyć fiolkę trzy do czterech razy przez delikatne pipetowanie. Połączyć płukanie z resztą zawiesiny komórek w probówce. Zakryj i delikatnie odwróć rozmrożoną zawiesinę PHH pięć razy.Wiruj w temperaturze 100G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie dodaj trzy mililitry kompletnego podłoża galwanicznego do ścianki stożkowej rurki zawierającej osad.Rozkołysz stożkową rurkę na boki, aby ponownie zawiesić osad komórkowy i dodaj pięć mililitrów kompletnego podłoża galwanicznego. Po zliczeniu ponownie zawieszonych hepatocytów dostosuj zawiesinę komórek do pożądanej gęstości wysiewu za pomocą kompletnego podłoża do posiewu. Następnie należy uzyskać pokrytą kolagenem płytkę 24-dołkową zawierającą uprzednio posiane komórki zasilające i za pomocą pipety lub aspiracji próżniowej usunąć pożywkę z komórek zasilających.Natychmiast umieścić 500 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny hepatocytów w każdej studzience zawierającej komórki zasilające. Potrząśnij płytką w ruchu północnym, południowym, wschodnim i zachodnim, wykonując dwukrotnie ruch w przód iw tył w kierunku północ-południe, a następnie ten sam ruch w kierunku wschód-zachód. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie do czterech godzin.Przez pierwsze 60 minut hodowli potrząsaj płytką co 15 minut, jak pokazano wcześniej. Po inkubacji przenieść płytkę z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Po wstrząśnięciu płytką należy użyć pipetowania lub zasysania próżniowego, aby usunąć całe podłoże galwaniczne.Natychmiast dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Obrazy PHH od dwóch dawców hodowanych w różnych gęstościach wysiewu z komórkami zasilającymi uzyskano w siódmym i 14 dniu hodowli. Różne gęstości wysiewu wykazywały wizualne różnice w zbieżności, ale zachowywały typową prostopadłościenną morfologię wątroby.

an-all-human-hepatic-culture-system-for-drug-development-applications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Wystawiliśmy system mikrofizjologiczny (MPS) z organoidami jelitowymi i wątrobowymi na działanie paracetamolu (APAP). W artykule opisano metody produkcji organoidów oraz oceny właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych APAP w MPS. Opisano w nim również analizy funkcjonalności tkanek niezbędne do walidacji wyników.

Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Indukowane lekami uszkodzenie wątroby (DILI) jest główną przyczyną niepowodzenia leku. Opracowano protokół umożliwiający dokładne przewidywanie odpowiedzialności związku za DILI za pomocą systemu mikrofizjologicznego wątroby (MPS). Model wątroby wykorzystuje kokulturę pierwotnych komórek wątroby i punktów końcowych istotnych translacyjnie do oceny odpowiedzi komórkowych na leczenie.

Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Zapewniamy kompleksowy przegląd i udoskonalenie istniejących protokołów tworzenia organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC), obejmując wszystkie etapy hodowli organoidów. System ten służy jako cenny model do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i oceny skuteczności kandydatów na leki.

Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Opracowanie nowych zastosowań terapeutycznych z wykorzystaniem mikroprzepływów

Poznaj system TruVivo do hodowli ludzkich hepatocytów w badaniach metabolicznych i toksykologicznych. Ta metoda umożliwia precyzyjne przewidywanie właściwości farmakokinetycznych związków w rozwoju leków.

Całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków

Przeglądaj więcej filmów