Całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków

TruVivo został opracowany w celu zaspokojenia zapotrzebowania na wygodną, a jednocześnie solidną platformę in vitro, która utrzymuje fenotypowo stabilne i funkcjonalne pierwotne ludzkie hepatocyty. Ze względu na te cechy system służy jako podstawowa platforma do udzielania odpowiedzi na szeroki zakres pytań dotyczących przedklinicznego opracowywania leków. Jednym z wyzwań jest potrzeba stworzenia systemu wielokomórkowego, który ma złożoność biologiczną niezbędną do odpowiedzi na dzisiejsze pytania, a jednocześnie jest łatwy w użyciu.

Obecne systemy często nie są w stanie utrzymać morfologii i funkcji hepatocytów w dłuższej perspektywie lub stanowią wyzwanie techniczne przy ustalaniu rutynowych, powtarzalnych wyników. Dzięki TruVivo użytkownicy mogą nadal polegać na prostocie i elastyczności tradycyjnych technik hodowli komórkowych 2D. Dodatkowo nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt, a system jest podatny na tradycyjne metody analityczne.

Dzięki TruVivo jesteśmy teraz w stanie dokładniej przewidzieć klirens metaboliczny, główne metabolity, kluczowe szlaki eliminacji, inne właściwości farmakokinetyczne związków z długimi okresami półtrwania przed oceną przedkliniczną. Na początek rozmrozić jedną butelkę każdego podłoża do rozmrażania komórek zasilających, suplementu A, suplementu B i suplementu C, w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Alternatywnie przechowuj je w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin.

Przenieś całą zawartość każdej butelki rozmrożonego podłoża do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów lub 50 mililitrów. Aby przygotować kompletną pożywkę galwaniczną, weź butelkę pożywki galwanicznej i dodaj 4,5 mililitra suplementu B, a następnie 11 mililitrów suplementu A do butelki. W osobnej butelce wymieszaj 100 mililitrów pożywki hodowlanej, jeden mililitr suplementu C i 14 mililitrów suplementu A, aby przygotować kompletną pożywkę hodowlaną.

Pozostały suplement C i suplement A należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do drugiego tygodnia przygotowania podłoża. Na początek rozmrozić komórki podajnika w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut. Natychmiast po rozmrożeniu umieść komórki podajnika na lodzie.

Stosując techniki aseptyczne w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dodaj świeżo rozmrożone komórki do 10 mililitrów pożywki do rozmrażania komórek. Następnie za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów pobrać jeden mililitr powstałej zawiesiny komórek w pożywce do rozmrażania, umyć nią pustą fiolkę z komórkami i połączyć ją z resztą zawiesiny komórek. Odwiruj komórki w temperaturze pokojowej i 400G przez cztery minuty.

Ostrożnie wyrzucić supernatant przez zasysanie lub pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego. Po ponownym zawieszeniu osadu w jednym mililitrze kompletnego podłoża galwanicznego, policz komórki podajnika. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórkową za pomocą kompletnego podłoża galwanicznego.

Następnie umieść 500 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek na dołku w 24-dołkowej płytce pokrytej kolagenem. Poruszaj płytką w ruchu północnym, południowym, wschodnim, zachodnim, dwukrotnie potrząsając w przód iw tył w kierunku północ-południe, a następnie tym samym ruchem w kierunku wschód-zachód. Na koniec inkubuj płytkę przed wysianiem w niej pierwotnych ludzkich hepatocytów.

Zbadaj przyczepienie komórki zasilającej przed rozmrożeniem hepatocytów do wysiewu. Przystąp do wykonywania posiewu pierwotnych ludzkich hepatocytów lub PHH po prawie jednej godzinie hodowli komórek zasilających. W tym celu, po 30 minutach hodowli komórek karmiących, przefiltruj wstępnie podgrzaną pożywkę do rozmrażania hepatocytów przez 0,2-mikronową jednostkę filtrującą z polieteru sulfonowego.

Rozmrażaj PHH w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut. Natychmiast po rozmrożeniu umieść rozmrożone komórki na lodzie. Następnie, pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przenieś komórki do pożywki do rozmrażania hepatocytów.

Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieść jeden mililitr zawiesiny hepatocytów w pożywce do rozmrażania z powrotem do fiolki i umyć fiolkę trzy do czterech razy przez delikatne pipetowanie. Połączyć płukanie z resztą zawiesiny komórek w probówce. Zakryj i delikatnie odwróć rozmrożoną zawiesinę PHH pięć razy.

Wiruj w temperaturze 100G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie dodaj trzy mililitry kompletnego podłoża galwanicznego do ścianki stożkowej rurki zawierającej osad.

Rozkołysz stożkową rurkę na boki, aby ponownie zawiesić osad komórkowy i dodaj pięć mililitrów kompletnego podłoża galwanicznego. Po zliczeniu ponownie zawieszonych hepatocytów dostosuj zawiesinę komórek do pożądanej gęstości wysiewu za pomocą kompletnego podłoża do posiewu. Następnie należy uzyskać pokrytą kolagenem płytkę 24-dołkową zawierającą uprzednio posiane komórki zasilające i za pomocą pipety lub aspiracji próżniowej usunąć pożywkę z komórek zasilających.

Natychmiast umieścić 500 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny hepatocytów w każdej studzience zawierającej komórki zasilające. Potrząśnij płytką w ruchu północnym, południowym, wschodnim i zachodnim, wykonując dwukrotnie ruch w przód iw tył w kierunku północ-południe, a następnie ten sam ruch w kierunku wschód-zachód. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie do czterech godzin.

Przez pierwsze 60 minut hodowli potrząsaj płytką co 15 minut, jak pokazano wcześniej. Po inkubacji przenieść płytkę z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Po wstrząśnięciu płytką należy użyć pipetowania lub zasysania próżniowego, aby usunąć całe podłoże galwaniczne.

Natychmiast dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Obrazy PHH od dwóch dawców hodowanych w różnych gęstościach wysiewu z komórkami zasilającymi uzyskano w siódmym i 14 dniu hodowli. Różne gęstości wysiewu wykazywały wizualne różnice w zbieżności, ale zachowywały typową prostopadłościenną morfologię wątroby.