Półautomatyczny przepływ pracy do krioprezerwacji nasienia koralowców w celu wsparcia biobankowania i akwakultury
7 czerwca 2024
Ten protokół opisuje półautomatyczną ścieżkę mającą na celu poprawę wydajności i zdolności przetwarzania oraz kriokonserwacji plemników zagrożonych gatunków koralowców, mającą na celu zabezpieczenie różnorodności genetycznej i wsparcie wysiłków na rzecz odbudowy rafy.
Nasz program badawczy ma na celu opracowanie i zastosowanie technologii kriokonserwacji i biobankowania, aby pomóc w zabezpieczeniu różnorodności genetycznej i bioróżnorodności koralowców w Australii i na całym świecie. Kriokonserwacja plemników koralowców jest możliwa od dekady, ale tarło koralowców jest ograniczone do zaledwie kilku nocy w roku, co daje nam wąską możliwość przechowywania genetyki zagrożonych gatunków. Naszym celem jest ulepszenie tych protokołów, aby poprawić skuteczność kriokonserwacji podczas tarła koralowców.
Opracowana przez nas półautomatyczna ścieżka przetwarzania pomaga usprawnić ocenę, obsługę i kriokonserwację plemników koralowców w celu poprawy wydajności przetwarzania próbek i zarządzania metadanymi w terenie. Pomaga nam to zmaksymalizować liczbę próbek, które można poddać krioprezerwacji podczas tych ograniczonych możliwości biobankowania. Opracowany tutaj protokół jest łatwy do przeniesienia i stosunkowo niedrogi do wdrożenia.
Może więc być wykorzystywany przez naukowców i zarządców raf na całym świecie, aby pomóc w zarządzaniu reprodukcją i genetyką w populacjach koralowców oraz pomóc we wspieraniu programów odbudowy raf koralowych, aby zapobiec wyginięciu gatunków koralowców. Po zebraniu wiązek gamet od hermafrodytów i plemników od gonochorycznych gatunków koralowców, umieść je w oznaczonych 50-mililitrowych probówkach. Umieść cztery mikrolitry aktywowanej zawiesiny nasienia w komorze liczącej Maklera, aby ocenić ruchliwość plemników i stężenie aktywowanej próbki.
Otwórz plik automatycznego arkusza danych biobanku koralowców i wprowadź współczynnik rozcieńczenia plemników używany do oceny wspomaganej komputerowo analizy nasienia. Następnie wprowadź wyniki wspomaganej komputerowo analizy nasienia pod kątem koncentracji plemników, całkowitej ruchliwości i ruchliwości postępowej. Zapisz stężenie plemników na przefiltrowanej probówce z próbką nasienia i przenieś probówkę do stacji roboczej do krioprezerwacji.
Otwórz arkusz danych automatycznego biobankowania koralowców i wybierz kartę Kriokonserwacja. Po sprawdzeniu etykiety probówki z próbką nasienia zidentyfikuj odpowiedni wpis, sprawdzając identyfikator kolonii. Za pomocą pipety serologicznej zmierz objętość próbki nasienia, pobierając ją i wyrzucając z powrotem do tej samej probówki. Wprowadź wartość w kolumnie E. Sprawdź automatycznie obliczoną kolumnę 1 dla wymaganego stężenia krioprotektantu i kolumnę H dla objętości kriorozcieńczalnika, aby dodać.
Uruchom stoper i za pomocą pipety, kroplami, dodaj CryoDiluent DMSO, stale delikatnie mieszając próbkę. Zapisać czas dodawania CryoCiluent w kolumnie P.Przeczytaj kolumnę K, aby określić liczbę fiolek kriogenicznych do napełnienia. Odkręć sterylne fiolki kriogeniczne z kodami kreskowymi i ułóż nakrętki na sterylnej powierzchni.
Za pomocą pipety serologicznej i pipety do porcjowania podaszkować jeden mililitr próbek do fiolek kriogenicznych z kodami kreskowymi i fiolek podsumowujących. Umieść jedną fiolkę z termoparą i wszystkie napełnione fiolki z próbkami w pustej wkładce do stojaka kriogenicznego w temperaturze pokojowej. Następnie umieść atrapy fiolek kriogenicznych zawierających 10% DMSO w przefiltrowanej wodzie morskiej w pustych szczelinach na pierścieniu kriogenicznym.
Wprowadź numer serii w kolumnie U arkusza danych samochodu i zeskanuj numer seryjny stojaka kriogenicznego w kolumnie V. Umieść kursor w odpowiedniej komórce kolumny Z i zeskanuj fiolkę termopary, a następnie wszystkie probówki z fiolkami kriogenicznymi. Odłóż na bok załadowane i zeskanowane stojaki na pozostałą część równowagi krioprotektantu. Napełnij naczynie chłodzące z kriostojakiem ciekłym azotem do poziomu niezbędnego do chłodzenia przy temperaturze około minus 20 stopni Celsjusza na minutę.
Po 10-minutowym okresie równoważenia krioprotektantu podłącz sondę termopary do rejestratora danych i rozpocznij nagrywanie. Delikatnie umieść pełny stojak kriogeniczny w naczyniu chłodzącym i nałóż pokrywkę. Zapisz czas rozpoczęcia w kolumnie Q. Gdy fiolka termopary wskaże na rejestratorze danych minus 80 stopni Celsjusza lub mniej, przenieś wkładkę kriostojaka do kąpieli w ciekłym azocie w celu schłodzenia próbek.
Wyjąć fiolki kriogeniczne ze stojaka i przenieść je do suchego transportera w celu przetransportowania do biobanku. W przypadku acropora millepora szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi wykazały mniej niż połowę stężenia plemników w porównaniu z komorą zliczającą Maklera. Walidacja komory liczenia Maklera za pomocą dostępnych na rynku mikrogranulek lateksowych o znanym stężeniu zaowocowała spójnymi obliczeniami, z niewielką zmiennością w oczekiwanym zakresie.
Nie zaobserwowano istotnej różnicy w stężeniach plemników całkowitych, ruchliwych lub stopniowo ruchliwych po rozmrożeniu w próbkach kriokonserwowanych przy użyciu 20% lub 30% DMSO jako rozcieńczalnika kriogenicznego.
Przegląd
Niniejsze badania opisują półautomatyczne podejście do efektywnego przetwarzania i krioprezerwacji plemników od zagrożonych gatunków korali, co jest kluczowe dla zabezpieczenia różnorodności genetycznej i wsparcia wysiłków na rzecz przywracania raf koralowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Krioprezerwacja
- Genetyka koralowców
- Przywracanie raf koralowych
Tło
- Krioprezerwacja plemników koralowców jest niezbędna dla utrzymania różnorodności biologicznej.
- Neriticzna tarliska koralowców występuje tylko kilka razy w roku, co ogranicza możliwości biobankowania.
- Ulepszenie istniejących protokołów może zoptymalizować użycie zasobów w tych ograniczonych czasach.
Zastosowane metody
- Półautomatyczna ścieżka przetwarzania plemników.
- Zastosowanie komory liczącej Maklera do oceny plemników.
- Użycie kryoprotektorów i kontrolowanego chłodzenia do krioprezerwacji.
Główne wyniki
- Poprawa efektywności i zdolności krioprezerwacji plemników.
- Konsekwentne pomiary ruchliwości i stężenia plemników.
- Udane zweryfikowanie metod liczenia w celu zwiększenia dokładności.
Wnioski
- To badanie dostarcza skalowalnej metody krioprezerwacji plemników koralowców.
- Wyniki mają znaczenie dla globalnych wysiłków na rzecz ochrony przyrody i strategii zarządzania koralowcami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient cryopreservation and biobanking of coral sperm are critical for securing genetic diversity and supporting large-scale reef restoration initiatives. The semi-automated workflow described enables scalable, reproducible sample processing during the narrow coral spawning window, directly impacting genetic resource management for conservation and aquaculture. This approach provides a transferable model for integrating biobanking technologies into global restoration pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust assessment of sperm motility and concentration using validated quantitative tools.
- Supports biological de-risking by standardizing sample quality metrics prior to cryopreservation.
- Facilitates predictive confidence in downstream genetic resource utilization for restoration programs.
Screening & Assay Development
- Prepares high-quality, metadata-rich samples for future functional or genetic screening.
- Standardizes workflows with barcoded cryovials and auto-datasheets for reproducibility.
- Enables scalable processing to maximize sample throughput during limited spawning events.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biobanking outputs with translational research on coral thermal tolerance and adaptation.
- Ensures continuity from field collection to preclinical evaluation of genetic interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of restoration strategies based on preserved genetic diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This semi-automated workflow bridges field collection, quantitative assessment, and cryogenic storage, positioning it as a critical enabler from early discovery through translational research in coral conservation and aquaculture.
- Discovery Biology: Provides validated sperm quality metrics to inform genetic resource selection.
- Screening: Delivers standardized, traceable samples for future functional assays or genetic analysis.
- Analytics: Integrates computer-assisted sperm analysis and automated metadata capture for robust data outputs.
- Translational Research: Links biobanked samples to research on coral adaptation and restoration efficacy.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable workflow for global biobanking and restoration programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genetic resource preservation and restoration outcomes.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of cryopreservation workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions for restoration and breeding initiatives.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic resources for conservation and aquaculture pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sperm assessment and cryopreservation protocols.
- Needs access to computer-assisted sperm analysis systems and barcoded sample tracking infrastructure.
- Demands cross-team standardization for metadata management and workflow execution.
- Adaptable to various coral species and spawning contexts with protocol validation.
- Limited by the seasonal and time-sensitive nature of coral spawning events.
