Półautomatyczny przepływ pracy do krioprezerwacji nasienia koralowców w celu wsparcia biobankowania i akwakultury

Nasz program badawczy ma na celu opracowanie i zastosowanie technologii kriokonserwacji i biobankowania, aby pomóc w zabezpieczeniu różnorodności genetycznej i bioróżnorodności koralowców w Australii i na całym świecie. Kriokonserwacja plemników koralowców jest możliwa od dekady, ale tarło koralowców jest ograniczone do zaledwie kilku nocy w roku, co daje nam wąską możliwość przechowywania genetyki zagrożonych gatunków. Naszym celem jest ulepszenie tych protokołów, aby poprawić skuteczność kriokonserwacji podczas tarła koralowców.

Opracowana przez nas półautomatyczna ścieżka przetwarzania pomaga usprawnić ocenę, obsługę i kriokonserwację plemników koralowców w celu poprawy wydajności przetwarzania próbek i zarządzania metadanymi w terenie. Pomaga nam to zmaksymalizować liczbę próbek, które można poddać krioprezerwacji podczas tych ograniczonych możliwości biobankowania. Opracowany tutaj protokół jest łatwy do przeniesienia i stosunkowo niedrogi do wdrożenia.

Może więc być wykorzystywany przez naukowców i zarządców raf na całym świecie, aby pomóc w zarządzaniu reprodukcją i genetyką w populacjach koralowców oraz pomóc we wspieraniu programów odbudowy raf koralowych, aby zapobiec wyginięciu gatunków koralowców. Po zebraniu wiązek gamet od hermafrodytów i plemników od gonochorycznych gatunków koralowców, umieść je w oznaczonych 50-mililitrowych probówkach. Umieść cztery mikrolitry aktywowanej zawiesiny nasienia w komorze liczącej Maklera, aby ocenić ruchliwość plemników i stężenie aktywowanej próbki.

Otwórz plik automatycznego arkusza danych biobanku koralowców i wprowadź współczynnik rozcieńczenia plemników używany do oceny wspomaganej komputerowo analizy nasienia. Następnie wprowadź wyniki wspomaganej komputerowo analizy nasienia pod kątem koncentracji plemników, całkowitej ruchliwości i ruchliwości postępowej. Zapisz stężenie plemników na przefiltrowanej probówce z próbką nasienia i przenieś probówkę do stacji roboczej do krioprezerwacji.

Otwórz arkusz danych automatycznego biobankowania koralowców i wybierz kartę Kriokonserwacja. Po sprawdzeniu etykiety probówki z próbką nasienia zidentyfikuj odpowiedni wpis, sprawdzając identyfikator kolonii. Za pomocą pipety serologicznej zmierz objętość próbki nasienia, pobierając ją i wyrzucając z powrotem do tej samej probówki. Wprowadź wartość w kolumnie E. Sprawdź automatycznie obliczoną kolumnę 1 dla wymaganego stężenia krioprotektantu i kolumnę H dla objętości kriorozcieńczalnika, aby dodać.

Uruchom stoper i za pomocą pipety, kroplami, dodaj CryoDiluent DMSO, stale delikatnie mieszając próbkę. Zapisać czas dodawania CryoCiluent w kolumnie P.Przeczytaj kolumnę K, aby określić liczbę fiolek kriogenicznych do napełnienia. Odkręć sterylne fiolki kriogeniczne z kodami kreskowymi i ułóż nakrętki na sterylnej powierzchni.

Za pomocą pipety serologicznej i pipety do porcjowania podaszkować jeden mililitr próbek do fiolek kriogenicznych z kodami kreskowymi i fiolek podsumowujących. Umieść jedną fiolkę z termoparą i wszystkie napełnione fiolki z próbkami w pustej wkładce do stojaka kriogenicznego w temperaturze pokojowej. Następnie umieść atrapy fiolek kriogenicznych zawierających 10% DMSO w przefiltrowanej wodzie morskiej w pustych szczelinach na pierścieniu kriogenicznym.

Wprowadź numer serii w kolumnie U arkusza danych samochodu i zeskanuj numer seryjny stojaka kriogenicznego w kolumnie V. Umieść kursor w odpowiedniej komórce kolumny Z i zeskanuj fiolkę termopary, a następnie wszystkie probówki z fiolkami kriogenicznymi. Odłóż na bok załadowane i zeskanowane stojaki na pozostałą część równowagi krioprotektantu. Napełnij naczynie chłodzące z kriostojakiem ciekłym azotem do poziomu niezbędnego do chłodzenia przy temperaturze około minus 20 stopni Celsjusza na minutę.

Po 10-minutowym okresie równoważenia krioprotektantu podłącz sondę termopary do rejestratora danych i rozpocznij nagrywanie. Delikatnie umieść pełny stojak kriogeniczny w naczyniu chłodzącym i nałóż pokrywkę. Zapisz czas rozpoczęcia w kolumnie Q. Gdy fiolka termopary wskaże na rejestratorze danych minus 80 stopni Celsjusza lub mniej, przenieś wkładkę kriostojaka do kąpieli w ciekłym azocie w celu schłodzenia próbek.

Wyjąć fiolki kriogeniczne ze stojaka i przenieść je do suchego transportera w celu przetransportowania do biobanku. W przypadku acropora millepora szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi wykazały mniej niż połowę stężenia plemników w porównaniu z komorą zliczającą Maklera. Walidacja komory liczenia Maklera za pomocą dostępnych na rynku mikrogranulek lateksowych o znanym stężeniu zaowocowała spójnymi obliczeniami, z niewielką zmiennością w oczekiwanym zakresie.

Nie zaobserwowano istotnej różnicy w stężeniach plemników całkowitych, ruchliwych lub stopniowo ruchliwych po rozmrożeniu w próbkach kriokonserwowanych przy użyciu 20% lub 30% DMSO jako rozcieńczalnika kriogenicznego.