Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Ogólnym celem metody witryfikacji zarodków MicroSecure jest zapewnienie bezpiecznej, pewnej, prostej, a jednocześnie skutecznej aseptycznej procedury witryfikacji zarodków ludzkich. Metoda ta została opracowana w celu zminimalizowania zmiennych kontroli jakości w witryfikacji ludzkich zarodków, zapewniając w ten sposób niezawodny i powtarzalny sukces. Główną zaletą tej techniki jest to, że dąży ona do wyeliminowania różnic technicznych między biologami a laboratoriami.

Nasza technika jest tak prosta do wykonania, że uważamy, że największym wyzwaniem dla naszych stażystów jest nauczenie się, jak pipetować zarodki bez ich utraty. Ideą naszej metody było wyeliminowanie potrzeby stosowania specjalistycznych urządzeń poprzez adaptację dwóch powszechnie używanych elementów zatwierdzonych przez FDA. Wewnętrznie znakowana jonomeryczna słomka do przechowywania i sterylny flexipet.

Wizualna demonstracja tej techniki jest niezwykle pomocna, ponieważ podkreśla podstawowe wskazówki, które zapewniają jej skuteczne zastosowanie. Przed rozpoczęciem zabiegu należy umieścić sterylną słomkę nasienia o pojemności 0,3 ml na teflonowej powierzchni elektrody podstawowego stołowego zgrzewarki impulsowej, tuż przed zatyczką, aby uzyskać uszczelnienie wewnętrzne. Naciśnij uchwyt, aby aktywować ogrzewanie, zwalniając uchwyt, gdy czerwone światło zgaśnie i usłyszysz sygnał dźwiękowy.

Następnie dociśnij bawełnianą zatyczkę do przodu w celu dotarcia do uszczelki wewnętrznej przed zakończeniem konfiguracji. W celu kriorozcieńczenia i obciążenia próbek blastocystami należy wyjąć naczynie do hodowli pacjenta z inkubatora i potwierdzić wszystkie identyfikacje próbek za pomocą źródła wtórnego. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj flexipetu do witryfikacji, zwanego końcówką vit, aby przenieść blastocysty do pojedynczych kropelek w górnym rzędzie odpowiedniej płytki kriogenicznej.

Następnie napełnij flexipet 3 mikrolitrami roztworu V1 i dozuj połowę zawartości na pierwszy zarodek. Odessać zarodek i przenieść go do pierwszej kropelki do płukania V1. Następnie odpipetuj zarodek dwa do trzech razy wokół obwodu kropli i usuń pozostałą zawartość pipety z kropli na powierzchnię naczynia.

Następnie przenieś blastocystę do pojedynczej kropli V1 i wstępnie załaduj końcówkę vit następnym roztworem V2 przed pipetowaniem dodatkowych zarodków za pomocą nowej końcówki vit. Po umyciu wszystkich blastocyst w kropelkach V2 i V3, jak właśnie pokazano, usuń pozostały roztwór i pęcherzyki z końcówki vit na zewnątrz kropli V3 i całkowicie wypełnij końcówkę czystym roztworem V3 z okolic pierwszego zarodka. Wydalić około 1 mikrolitra objętości i całkowicie odessać blastocystę i pozostały roztwór V3 do końcówki vit.

Teraz wyjmij końcówkę z pipety i użyj sterylnego gaziku, aby wysuszyć pozostały roztwór V3 z zewnętrznej powierzchni końcówki vit. Suszenie zewnętrznej powierzchni końcówki ma kluczowe znaczenie i nie wiąże się z żadnym dodatkowym ryzykiem utraty zarodka. Następnie włóż końcówkę najpierw do otwartego końca wstępnie uszczelnionej słomki i odwróć słomkę, etykietując ją końcem do dołu.

Obserwuj końcówkę przy wtyczce wewnętrznej. Pozostaw 1 cm przestrzeń powietrzną na otwartym końcu, a następnie bezpiecznie przyspawaj, uszczelnij ją. Gdy wszystkie słomki zostaną zamknięte, zanurz je bezpośrednio w ciekłym azocie w kolbie Dewara ze stali nierdzewnej i przechowuj słomki w otwartym kielichu przymocowanym do laski pacjenta.

W przypadku elucji i rozcieńczania w roztworze krioroztworowym należy umieścić odpowiednią sześciodołkową płytkę do rozcieńczania w środku stolika mikroskopu stereoskopowego, a 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą kąpiel rozgrzewającą sacharozę o temperaturze 37 stopni Celsjusza po jednej stronie mikroskopu. Następnie odizoluj słomkę, która ma zostać podgrzana, i przytrzymaj górną uszczelkę słomki powyżej poziomu cieczy, aby potwierdzić tożsamość próbki. Użyj nożyczek do majonezu, aby zabezpieczyć słomkę poniżej wewnętrznej zatyczki, aby końcówka vit była zanurzona w ciekłym azocie.

Kilkakrotnie mocno postukaj nożyczkami o kolbę Dewara, aby usunąć końcówkę z wewnętrznej bocznej ścianki słomy jako środek ostrożności w ramach kontroli jakości, a następnie podnieś słomkę na powietrze otoczenia w orientacji poziomej obok lub poniżej powierzchni stereoskopu. Chwytając nieoznakowany koniec słomki, odetnij słomkę przy wewnętrznej zatyczce. Następnie podnieś słomkę nad rozgrzewające naczynie do kąpieli i wlej końcówkę vit do wanny pod kątem 60 stopni, aż końcówka zostanie całkowicie wyciśnięta.

Podstawa flexipet powinna spoczywać nad boczną ścianą naczynia. Po upływie 5 do 10 sekund przenieś podstawę pipety do pipetownika z mikronasadką. Uruchom pięciominutowy minutnik.

Podczas oglądania mikroskopu użyj palca wskazującego, aby zakryć otwór bańki i delikatnie ściśnij bańkę, aby uwolnić zeszkloną blastocystę z końcówki vit do płukania T1. Po potwierdzeniu uwolnienia blastocysty usuń pozostały roztwór V3 i pęcherzyki pod nadciśnieniem, ewakuując zawartość do środka niewykorzystanej studzienki odrzutowej. Przenieś końcówkę vit na pipetę sterber, przenosząc zarodek do drugiej kropli T1 pod olejem na pozostałe cztery minuty.

Podczas inkubacji należy wstępnie napełnić flexipet następnym roztworem, a następnie rozcieńczyć blastocystę w kropelkach T2, 3 i 4 w odstępach trzyminutowych. Na koniec zrównoważ blastocysty w kropli T5 przez pięć minut na powierzchni o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zanim zwrócisz je do inkubatora. Zmodyfikowany system klasyfikacji blastocyst Gardnera uważa, że pełne blastocysty mają mniej niż 10% przepukliny komórek trofektodermy, podczas gdy blastocysty z do 50% przepukliną są klasyfikowane jako rozszerzone.

Uważa się, że blastocysty, które wykazują więcej niż 50% przepuklinę, wylęgają się. Korzystając z zademonstrowanych metod kriokonserwacji i ocieplania, konsekwentnie osiąga się wysoki poziom żywych urodzeń na początek cyklu, z przedimplantacyjnymi testami genetycznymi lub bez nich. Chociaż sukcesy te są znacznie wyższe, przy użyciu wstępnie wyselekcjonowanych blastocyst euploidalnych.

Rzeczywiście, oceniając populację pacjentów o dobrym rokowaniu dla samych cykli kriokonserwowanych, te dane dotyczące transferu zamrożonych zarodków wykazują lepsze wskaźniki sukcesu niż średnia krajowa zarówno dla wskaźników implantacji, jak i żywych urodzeń o ponad 30%Poprzez transfer głównie pojedynczych genetycznie testowanych euploidalnych zeszklonych blastocyst, jednych z najwyższych wskaźników implantacji i wskaźników żywych urodzeń w Stanach Zjednoczonych, niezależnie od wieku, w porównaniu z ostatnimi krajowymi statystykami zgłoszonymi przez Centrum Kontroli Chorób dla dwóch innych szanowanych klinik leczenia niepłodności oraz danymi opublikowanymi przez Society for Assisted Reproductive Technologies. Witryfikacja MicroSecure to nowatorska procedura aseptyczna opracowana z myślą o łatwości technicznej, niezawodności i bezpieczeństwie kriologicznym. Ten prosty, niekomercyjny system witryfikacji stanowi wysoce skuteczną, tanią alternatywę dla urządzeń do witryfikacji.

Od momentu opracowania, metoda MicroSecure zapewniła ponad 99,9% odzyskania zarodka i ponad 95% całkowitego przeżycia blastocysty. Umożliwiło to przekształcenie naszej praktyki klinicznej w prawie wszystkie cykle transferu embyro w ciągu ostatnich trzech lat. Skutecznie zmodyfikowaliśmy naszą procedurę, aby uwzględnić wewnętrzne uszczelnienie przed bawełnianym korkiem jonomerowych słomek nasienia, aby nadal zapewniać niezawodne uszczelnienia spawalnicze i doskonałe wyniki po ociepleniu.

Obecnie w branży technologii wspomagającego rozrodu stosuje się wiele różnych systemów urządzeń, ale żadne inne urządzenie nie oferuje takiej prostoty i powtarzalności technicznej, aby zasadniczo wyeliminować zmienność użytkowników i zapewnić optymalne bezpieczeństwo, jak witryfikacja MicroSecure.