Name: Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę witryfikacji MicroSecure do kriokonserwacji ludzkich blastocyst. Technika ta zapewnia bezpieczną, prostą i wysoce skuteczną procedurę zamkniętą, eliminując zmienność techniczną między biologami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.C. Schiewe chciałby podziękować Panu Forestowi Garnerowi z Centrum Płodności w Las Vegas za jego statystyczną wiedzę w zakresie analizy i oceny rocznych danych CDC i ART. Autorzy pragną również podziękować swojemu dyrektorowi medycznemu, dr Robertowi E. Andersonowi, za jego oddane wsparcie i wiarę w nasze możliwości techniczne i wiedzę.

<ol><li>Edgar, D. H., Gook, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+cryopreservation+%28slow+cooling+versus+vitrification%29+of+human+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos.</a> Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).</li>
<li>Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+risk+of+monochorionic+dizygotic+twin+blastocyst+formation+associated+with+early+laser+zona+dissection+of+group+cultured+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos.</a> Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).</li>
<li>Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/301673333_The_Historic_Development_and_Incorporation_of_Four_Assisted_Reproductive_Technologies_Shaping_Today's_IVF_Industry">The historic development and incorporation of four assisted reproductive technologies shaping today's IVF industry.</a> J. Fertil. In Vitro Reprod. Med. Genet. 4, 2-9 (2016).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196+degrees+C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).</li>
<li>Schiewe, M. C., Rall, W. F., Stuart, L. D., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cryoprotectant%2C+cooling+rate+and+in+situ+straw+dilution+using+conventional+freezing+or+vitrification+for+cryopreserving+sheep+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cryoprotectant, cooling rate and in situ straw dilution using conventional freezing or vitrification for cryopreserving sheep embryos.</a> Theriogenology. 36, 279-293 (1991).</li>
<li>Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+and+human+blastocysts+using+a+novel+cryoloop+container-less+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique.</a> Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).</li>
<li>Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+shrinkage+of+blastocoeles+using+either+a+micro-needle+or+a+laser+pulse+prior+to+the+cooling+steps+of+vitrification+improves+survival+rate+and+pregnancy+outcome+of+vitrified+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).</li>
<li>Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+open+and+closed+methods+for+vitrification+of+human+embryos+and+elimination+of+potential+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination.</a> Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).</li>
<li>Vanderzwalmen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Births+after+vitrification+at+morula+and+blastocyst+stages%3A+effect+of+artificial+reduction+of+the+blastocoelic+cavity+before+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification.</a> Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).</li>
<li>Schiewe, M. C. Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification. <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/cryopreservation-in-eukaryotes/quality-control-factors-influencing-the-successful-and-reliable-implementation-of-oocyte-and-embryo-">Cryopreservation</a>. Marco-Jiménez, F., AkdemirKoç, H. , 1st Ed, InTech. Rijeka, Croatia. (2016).</li>
<li>Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+safe%2C+simple%2C+and+successful+vitrification+method+for+bovine+and+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts.</a> Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).</li>
<li>Panagiotidis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+versus+closed+vitrification+of+blastocysts+from+an+oocyte-donation+programme%3A+a+prospective+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).</li>
<li>Papatheodorou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+versus+closed+oocyte+vitrification+system%3A+a+prospective+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 595-602 (2013).</li>
<li>Schiewe, M. C., Zozula, S., Anderson, R. E., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Validation+of+microSecure+vitrification+(%26%23181%3BS-VTF)+for+the+effective+cryopreservation+of+human+embryos+and+oocytes">Validation of microSecure vitrification (µS-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes.</a> Cryobiology. 71, 264-272 (2015).</li>
<li>Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).</li>
<li>Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+survival+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> Cryobiology. 24, 387-402 (1987).</li>
<li>Seki, S., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+warming+rate+on+the+survival+of+vitrified+mouse+oocytes+and+on+the+recrystallization+of+intracellular+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice.</a> Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).</li>
<li>Schiewe, M. C. General hygiene and quality control practices in an embryo-production laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchiewe%2C+MC+%22Manual+of+the+International+Embryo+Transfer+Society%3A+A+Procedural+Guide+and+General+Information+for+the+Use+of+Embryo+Transfer+Technology%2C+Emphasizing+Sanitary+Precautions%22">Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the Use of Embryo Transfer Technology, Emphasizing Sanitary Precautions</a>. Stringfellow, D. A., Givens, D. , 3rd Ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, IL. (2008).</li>
<li>Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+center+validation+of+routine+blastocyst+biopsy+implementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Asst.+Reprod.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation.</a> J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).</li>
<li>Liebermann, L., Conaghan, J. <a target="_blank" href="http://embryologists.com/jce161-artificial-collapse-prior-blastocyst-vitrification/">Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes.</a> J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).</li>
<li>Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+warming+increases+survival+of+slow-frozen+sibling+oocytes%3A+a+step+towards+a+single+warming+procedure+irrespective+of+the+freezing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol.</a> Reprod Biomed Online. , (2014).</li>
</ol>

M.C. Schiewe jest członkiem naukowej rady doradczej Innovative Cryo Enterprises oraz dyrektorem technicznym California Cryobank. Produkcja tego wideo-artykułu została opłacona przez Ovation Fertility. Autorzy nie mają konkurencyjnych umów finansowych ani konfliktów interesów, które mogliby ujawnić w odniesieniu do witryfikacji gamet i zarodków.

Obecnie oczekuje się, że uda się osiągnąć całkowite przeżycie blastocysty (> 95%) i osiągnąć sukces implantacyjny podobny do tego, jaki ma miejsce w przypadku świeżych zarodków. Niektóre grupy sugerują, że wskaźniki żywych urodzeń w cyklach transferu zarodków zeszklonych są być może nawet wyższe niż w przypadku świeżych blastocyst, gdy nienaruszony kriokonserwowany zarodek jest przeszczepiany do zdrowej, niestymulowanej hormonalnie macicy. Nasze dane jednoznacznie wskazują, że witryfikacja skutecznie i niezawodnie utrzymuje żywotność świeżego zarodka. Ponadto udowodniliśmy, że nasza aseptyczna, zamknięta metoda, zwana MicroSecure Vitrification (μS-VTF), może osiągnąć optymalny wynik porównywalny lub wyższy niż standardy komercyjne (tj. otwarte systemy urządzeń) stosowane w branży IVF.
Zmienność jest związana z techniczną powtarzalnością i niezawodnością między osobami korzystającymi z wielu urządzeń/metod witryfikacji. To z kolei spowodowało niespójności między programami stosującymi witryfikację. Dlatego nie jest zaskakujące, że znajomość urządzenia jest ważnym czynnikiem wpływającym na biegłość laboratoryjną i pomyślne wyniki. To właśnie koncepcja "podpisu technicznego"11 wyjaśnia, dlaczego powtarzalność między programami może być problematyczna. Opracowanie kilkunastu komercyjnych urządzeń nie tylko skomplikowało to zjawisko, ale także stworzyło problemy związane z kontrolą jakości. Na szczęście zamknięte systemy witryfikacji, takie jak μS-VTF, Rapid-I i VitriSafe, okazują się obecnie równie skuteczne w przypadku otwartych systemów urządzeń 12,13,14.
MicroSecure VTF to nowatorska, asepyczna technika witryfikacji opracowana z myślą o technicznej łatwości, niezawodności i kriobezpieczeństwie. Dzięki połączeniu dwóch wcześniej zatwierdzonych urządzeń zgodnych z FDA, jest to niekomercyjny system witryfikacji z wyraźną zaletą polegającą na ustalonym niskim koszcie, w przeciwieństwie do specjalistycznych urządzeń. Ponadto unikalny, odporny na manipulacje i zinternalizowany dwukolorowy system etykietowania, a także wiele innych zalet związanych z kontrolą jakości, sprawiły, że μS-VTF jest atrakcyjną globalną opcją11. Jednak jako niekomercyjne urządzenie VTF, jego szerokie zastosowanie w przemyśle powoli ewoluuje. Tylko dzięki ciągłemu publikowaniu informacji o jego bezpieczeństwie i skuteczności klinicznej μS-VTF zyska coraz większe zastosowanie.
W sierpniu 2014 r., w obliczu braku możliwości pozyskania oryginalnej słomki zarodkowej o pojemności 0,3 ml wyprodukowanej z wewnętrzną, nieodprowadzającą wilgoci czopem hydrofobowym, byliśmy w stanie niezawodnie zmodyfikować metodę μS-VTF. Krótko mówiąc, nowe słomki do nasienia/zarodków o pojemności 0,3 ml z bawełnianymi zatyczkami PVP zostały skutecznie dostosowane. Osiągnięto to po prostu poprzez stworzenie wewnętrznego uszczelnienia przed bawełnianą zatyczką, zapobiegając w ten sposób kontaktowi i odprowadzaniu płynu z otwartą końcówką VTF (tj. flexipette zawierającą zarodek lub jaja). Ponadto, jeśli pręty o średnicy wewnętrznej 40 mm nie są dostępne, problem z wypornością związany z lżejszymi prętami 30 mm można zrównoważyć za pomocą dwóch łożysk kulkowych.
Te dodatkowe kroki sprawiły, że technika ta jest nieco mniej prosta, ale nadal bardzo skuteczna. Obecnie ekonomia i skuteczność stają się coraz ważniejszymi problemami, ponieważ blastocysty poddane biopsji są zazwyczaj zeszklone indywidualnie, dopóki ich status euploidalności nie zostanie potwierdzony w raporcie genetycznym. Blastocysty z potwierdzonym statusem aneuploidii nieżywotnej są zazwyczaj odrzucane, za zgodą pacjenta, w ciągu kilku tygodni. W związku z tym większość (> 50%) urządzeń VTF jest wyrzucana po krótkotrwałym przechowywaniu, co powoduje rosnące roczne koszty w przypadku korzystania z urządzeń komercyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, μS-VTF jest wysoce skuteczną, niezawodną i powtarzalną procedurą kriokonserwacji ludzkich blastocyst. Doskonała konstrukcja kontroli jakości bezpiecznie etykietuje i bezpiecznie przechowuje zarodki/oocyty, jednocześnie eliminując niepowodzenia w odzyskiwaniu i optymalizując przeżywalność i żywotność po ociepleniu, co uzasadnia stosowanie systemu jako uniwersalnego podejścia do witryfikacji zarodków.

Witryfikacja jest najbardziej wpływową technologią wspomaganego rozrodu w branży zapłodnienia in vitro (IVF) od czasu rozwoju docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Obecnie blastocysty są kriokonserwowane bez utraty żywotności zarodka, która wcześniej była związana z konwencjonalnymi metodami powolnego zamrażania1. Dzięki niezawodnej przeżywalności zarodków po ociepleniu, przemysł niepłodności przekształca się w preferowane cykle kriokonserwowanego transferu zarodków, które dają podobne lub wyższe wyniki ciąży niż tradycyjny transfer świeżych zarodków. W połączeniu z biopsją blastocysty i preimplantacyjnymi genetycznymi badaniami przesiewowymi (PGS), witryfikacja stała się istotnym narzędziem klinicznym do optymalizacji zdrowych wyników żywych porodów poprzez euploidalny transfer pojedynczego zarodka2,3.
Witryfikacja zarodków mysich została opracowana w połowie lat 80. XX wieku4,5 i dostosowana do hodowli zwierząt przez 19906. Opierając się na założeniu, że roztwory witryfikacyjne tworzą metastabilny stan szklisty, wolny od szkodliwego tworzenia się kryształków lodu, udowodniono, że skuteczniej zachowują pełną integralność komórkową zarodków. Co ciekawe, obiecująca akceptacja witryfikacji w embriologii człowieka zaczęła być realizowana dopiero w XXIwieku. Wczesne publikacje promujące stosowanie witryfikacji zbiegły się w czasie z rozwojem unikalnych urządzeń systemu "otwartego"7,8,9. Jednak przyjęcie witryfikacji do praktyki klinicznej było powolne, ponieważ nastąpiło w czasie, gdy następowała również poprawa w powolnym zamrażaniu blastocyst. Udane konwencjonalne zamrażanie w powolnym tempie, oprócz witryfikacji, zostało dostosowane do ulepszeń w systemach hodowli zarodków, a także do włączenia metod zapadania się blastocoele, co zwiększyło zarówno całkowite przeżycie trofektodermy, jak i następnie implantację10.
W ostatniej dekadzie technologia witryfikacji szybko wyparła konwencjonalne praktyki zamrażania. W dużej mierze wynikało to z opracowania specjalistycznych urządzeń do witryfikacji. Niektóre z tych urządzeń ograniczyły ogólne bezpieczeństwo, wydajność i skuteczność witryfikacji klinicznej, wprowadzając nieodłączne wady konstrukcyjne do urządzeń stosowanych w branży IVF11. Rzeczywiście, niuanse różnych urządzeń wprowadzają znaczne różnice techniczne między programami, powszechnie określane jako "sygnatury techniczne"12. W związku z tym czasopisma naukowe, takie jak Journal of Visualized Experiments (JoVE), mogą służyć jako cenne źródło informacji o szczegółach technicznych, które pomogą zmniejszyć zmienność wyników. Innym nieustającym problemem jest to, że niektórzy embriolodzy nadal są dezinformowani, nawet dzisiaj, w oparciu o twierdzenia, że "ultraszybkie chłodzenie zarodków lub oocytów w »otwartym systemie witryfikacji« (tj. bezpośredni kontakt zarodka z ciekłym azotem (LN2)) jest warunkiem wstępnym optymalizacji wskaźników sukcesu". Oczywiście, to przekonanie jest błędne, oparte na udowodnionym sukcesie aseptycznych systemów zamkniętych13, 14,15.
Na podstawie kriobiologicznych zasad witryfikacji, skuteczność witryfikacji jest bardziej zależna od tempa ocieplenia niż od tempa chłodzenia16,17,18. Ogólnie rzecz biorąc, niezależnie od zastosowanego urządzenia do witryfikacji, szybkość nagrzewania musi przekraczać szybkość chłodzenia, aby zapewnić wysokie wskaźniki przeżycia. Wysokie tempo ocieplania minimalizuje możliwość wzrostu lodu (tj. rekrystalizacji zanieczyszczeń jądrzastych w krioroztworach) podczas fazy dewitryfikacji ocieplenia. To prawda, że stabilność roztworu witryfikacyjnego (tj. rodzaj i stężenie użytych środków krioprotekcyjnych) może mieć mylący efekt, ale jest to omówione w osobnej publikacji11. Biorąc pod uwagę problemy z szybkością chłodzenia i nagrzewania, MicroSecure Vitrification (μS-VTF) została opracowana w 2008 roku jako niedroga, niekomercyjna, zgodna z FDA metoda, która zoptymalizowała aspekty kontroli jakości witryfikacji. Jego wyjątkowość polegała na tym, że oferował odporne na manipulacje, zinternalizowane, dwukolorowe etykietowanie. Ponadto, dzięki ładowaniu i przechowywaniu zarodków bezpośrednio w sterylnym flexipette używanym do pipetowania (tj. bez pipetowania do powierzchni urządzenia wtórnego) oraz dzięki zastosowaniu słomek z żywicy jonomerycznej, które całkowicie zgrzewają za pomocą automatycznego zgrzewarki, różnice techniczne zostały skutecznie wyeliminowane.
Przy ocenie kompletności urządzeń do witryfikacji pod kątem potencjalnego użytku, powinno być wziętych pod uwagę kilka czynników kontroli jakości, w tym: 1) Potencjał etykietowania - Czy etykiety mogą być bezpiecznie przestrzegane? Czy są odporne na manipulacje? Czy oferują one potencjał identyfikacji dwukolorowej? Czy wymaga to dodatkowej etykiety i czy etykietę można łatwo usunąć w celach dokumentacyjnych (tj. weryfikacji pacjenta) po ociepleniu? 2) Łatwość techniczna — czy zarodki można łatwo załadować do urządzenia / na nie w odpowiednim czasie i łatwo zidentyfikować i śledzić po podgrzaniu? 3) Prostota proceduralna/powtarzalność — Czy metoda witryfikacji oferuje prostotę i niezawodność, które łatwo pozwalają na powtarzalność, co minimalizuje różnice między technikami (wewnętrznymi) i programami (zewnętrznymi)? 4) Pojemność pamięci LN2 — czy urządzenia można łatwo i bezpiecznie obsługiwać i identyfikować? Czy ich potencjał magazynowy jest efektywny przestrzennie? Czy urządzenie zapewnia bezpieczeństwo i ochronę przed uszkodzeniami fizycznymi lub możliwymi zanieczyszczeniami jako aseptyczny system zamknięty? 5) Potencjał rekonwalescencji / Przeżywalność - Czy konstrukcja urządzenia jest podatna na potencjalne problemy z gwarantowanym odzyskiwaniem zarodków i czy niezawodnie witryfikują i utrzymują pełną integralność komórkową po ociepleniu? Ten ostatni konkretny problem związany z jakością, czyli wskaźnik odzysku, został w rzeczywistości zaskakująco zminimalizowany w opublikowanych raportach; Odbywa się to poprzez ukrywanie niekorzystnego wyniku (tj. utraconego zarodka lub komórki jajowej) w typowo dobrych wskaźnikach przeżycia. Każde urządzenie podatne na niespójne odzyskiwanie (<99%) jest poważnie wadliwe i stanowi odpowiedzialność proceduralną.
Nasza asepyczna, zamknięta metoda μS-VTF została strategicznie opracowana, aby uwzględnić każdy środek kontroli jakości. Jednak po 5 latach doskonałych sukcesów klinicznych i walidacji14, procedura musiała zostać zmodyfikowana. Oryginalne słomki zarodkowe o pojemności 0,3 ml (posiadające korek hydrofobowy) zostały usunięte z przemysłu IVF i zastąpione słomką nasienia o pojemności 0,3 ml posiadającą standardową zatyczkę bawełnianą/PVP (tj. przemianowaną na słomkę nasienia/zarodka). W tym dokumencie proceduralnym przedstawiono konkretne kroki i strategie potrzebne do bezpiecznego, prostego i skutecznego wdrożenia μS-VTF. Ponadto zwracamy uwagę na modyfikacje niezbędne do niezawodnego uwzględnienia ograniczeń w dostawach, do czasu, gdy alternatywny idealny pojemnik na słomę zostanie ponownie wprowadzony z powrotem do laboratorium klinicznego.

<table><tbody><tr><td>Trzcina aluminiowa</td><td></td><td>IVM XC055</td><td></td></tr><tr><td>Łożyska kulkowe, 3/32"</td><td>VXB.com</td><td>KIT15977</td><td>stal nierdzewna</td></tr><tr><td>CBS słomka nasienia/zarodka, 0,3 ml</td><td>CryoBioSystems</td><td>25292</td><td>indywidualny sterylny</td></tr><tr><td>kolor, pręty identyfikacyjne, 30 mm</td><td>CryoBioSystems</td><td>019021-26</td><td>ważone</td></tr><tr><td>probówki hodowlane, 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td>stożkowe</td></tr><tr><td>Probówki hodowlane, 10 ml</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td>Snap-cap</td></tr><tr><td>Cryosleeves</td><td>Filtr Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>, 250 ml</td><td>Fisher Sci.</td><td>09-740-2A</td><td>0,22 &mu; m</td></tr><tr><td>Kolby, Kultura tkankowa 50 ml</td><td>Falcon</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Flexipettes, 300 &mu; m ID</td><td>Cook Med.</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>Sterylny, 20</td></tr> sztuk <tr><td>kleszczyka, duży</td> kleszcz <td>Miltex</td><td>6-30TC</td><td></td></tr><tr><td>, drzazga - drobna</td><td>Miltex</td><td>17-305</td><td></td></tr><tr><td>Kielich</td><td>IVM</td><td>PA003</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka, SYMS 1</td><td>CryoBioSystems</td><td>16399</td><td>110 V lub 220 V z adapterem</td></tr><tr><td>Nośniki buforowane Hepes&nbsp;</td><td>Life Global lub</td><td>LGGH-100; 100&nbsp; ml lub</td><td>przechowywane w temperaturze 2 - 8 &ordm; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>H-HTF; 90126; 100 ml</td><td>z nieistotnymi etykietami AA</td></tr><tr><td>, Cryo</td><td>GA International</td><td>CL-23T1</td><td>Różne kolory</td></tr><tr><td>Zbiornik ciekłego azotu, 40&nbsp; L</td><td>MVE lub Taylor Warton</td><td>różne</td><td>płyny do przechowywania&nbsp;</td></tr><tr><td>LN2; Kolba Dewara, 0,5&nbsp; L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-695</td><td>Szalki</td></tr><tr><td>Custera ze stali nierdzewnej 6-dołkowe</td><td>Biogenics</td><td>015/020</td><td>tworzywa sztuczne w etui</td></tr><tr><td>Żarówka do pipet, Micro Cap</td><td>Drummond</td><td>Fisher#13681451</td><td>Otwór na wierzchołku żarówki</td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 35 mm</td><td></td><td>Szalki</td> Petriego Falcon 351006<td></td></tr><tr><td>, 58 mm</td> Szalki Petriego <td>150288</td><td></td><td>Nunc</td></tr>, <tr><td>100 mm</td><td>Końcówki</td> do pipet Falcon <td>351029</td><td></td></tr><tr><td>, ART długie</td><td>Fisher Sci.</td><td>02-707-80</td><td>10 - 100 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond lub Falcon</td><td>różne</td><td>ładowalne</td></tr><tr><td>urządzenia do pipetowania, pipety chirurgiczne</td><td>Stripper Cooper</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>, serologiczne 1&nbsp; mL</td> pipety <td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>, serologiczne 2&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>pipety, serologiczne 5&nbsp; mL</td> pipety <td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>, serologiczne 10&nbsp; mL</td><td>Nożyczki Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>, Surgical</td><td>Mayo Miltex</td><td>5-SC-16</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon, Olympus, Leica</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>sterylne gaziki, 4 "x 4"</td> <td>Kendall Healthcare</td><td>6939</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczne serum</td><td>Life Global lub</td><td>LGPS-20; 20 ml lub</td><td>przechowywane w temperaturze 2 - 8 &ordm; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>SS-99193; 12 x 10 ml</td><td>zakup partii o niskiej zawartości endotoksyn</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>#S9378</td><td>Porcja na 50&nbsp; kolby ml, 1 rok; 
17,1 g/kolbę + podłoże do 50 ml; 
wytwarza roztwór 1 M; 
Filtr z 0,22 i mikro; m jednostka</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie do rozmrażania</td><td>Innowacyjne przedsiębiorstwa kriogeniczne</td><td>BL-TS (&le; 1,0 mln sacharozy)</td><td>T1, T2, T3, T4; rozdarty w 2 - 8 &ordm; C jak &le; 1 miesiąc po otwarciu</td></tr><tr><td>Roztworu do Witryfikacji*,**</td><td>Innowacyjne Przedsiębiorstwa Kriogeniczne</td><td>BL-VS (&ge; 7,9 M [Glycerol/EG])</td><td>V1, V2, V3; przechowywane w temperaturze 2 - 8 &ordm; C jak &le; 1 miesiąc po otwarciu</td></tr><tr><td colspan="4">* Nieprzepuszczalne dodatki krioprotekcyjne mogą obejmować: sacharozę, fikol i hialuronian sodu&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">** Inne preparaty komercyjne to zazwyczaj glikol etylenowy (EG)/dimetylosulfotlenek (DMSO; 30% v/v; 4,8 M), ale może to być EG/glikol propylenowy (32% v/v; 5,2 M). Roztwory mieszane są zwykle stosowane w celu zmniejszenia obaw związanych z kriotoksycznością roztworu o wysokiej zawartości molowej. Rozwiązania komercyjne zazwyczaj obejmują rozwiązanie ES i VS. Formułowanie preparatu komercyjnego jest zazwyczaj własnością własnościową.</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowana witryfikacja microsecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Kliniczna witryfikacja zarodków ewoluowała wraz z rozwojem unikalnych urządzeń do witryfikacji w XXIwieku i z błędnym przekonaniem, że ultraszybkie chłodzenie w systemie "otwartym" (tj. bezpośredni kontakt z LN2) było koniecznością dla optymalizacji sukcesu witryfikacji. Dogmat otaczający znaczenie szybkości chłodzenia doprowadził do niebezpiecznych praktyk podlegających zmianom technicznym oraz do stworzenia urządzeń do witryfikacji, które ignorowały ważne czynniki kontroli jakości (np. łatwość użycia, powtarzalność, niezawodność, bezpieczeństwo etykietowania i bezpieczeństwo przechowywania). Zrozumienie wad kontroli jakości innych urządzeń pozwoliło na opracowanie bezpiecznej, pewnej, powtarzalnej i niezawodnej metody μS-VTF, której celem było zminimalizowanie różnic między technikami i technikami. Co równie ważne, połączono dostępność dwóch istniejących urządzeń zgodnych z FDA: 1) słomki zarodkowej z żywicy jonomerowej o pojemności 0,3 ml z internalizowanym, dwukolorowym, odpornym na manipulacje oznakowaniem z powtarzalnym potencjałem zgrzewania; oraz 2) skrócone, powszechnie używane, sterylne flexipettes o średnicy wewnętrznej 300 μm do bezpośredniego ładowania zarodka (zarodków) w celu stworzenia wysoce skutecznego globalnego urządzenia do witryfikacji. Podobnie jak inne aseptyczne, zamknięte systemy witryfikacji (np. High Security Vitrification (HSV), Rapid-i i VitriSafe) skutecznie stosowane w medycynie reprodukcyjnej, microSecure Vitrification (μS-VTF) udowodnił, że może osiągnąć wysoką przeżywalność po ociepleniu i wyniki ciąży dzięki dbałości o prostotę i zmniejszoną zmienność techniczną. Chociaż słomka zarodkowa o pojemności 0,3 ml zawierająca wewnętrzną czop hydrofobowy została komercyjnie zastąpiona standardową słomką nasienia zawierającą zatyczki bawełniano-poliwinylopirolidonowe (PVP), zachowała ona swój skład żywicy jonomerowej, aby zapewnić uszczelnienie spoin. Jednak bawełniane zatyczki mogą w kontakcie odprowadzać płynną zawartość zarodków z flexipettes. Zmodyfikowana metoda μS-VTF została dostosowana w taki sposób, aby zawierała dodatkowe wewnętrzne uszczelnienie spawalnicze przed zaślepką po stronie obciążenia urządzenia. Dodatkowy etap techniczny procedury μS-VTF nie wpłynął na jej pomyślne zastosowanie, ponieważ wysokie wskaźniki przeżywalności (> 95%) i ciąż utrzymują się do dziś.

W okresie od 2012 roku do czerwca 2014 roku rozmrożono 1341 witryfikowanych blastocyst, z czego odzyskano 1341 embrionów (10%), a 1316 z nich przeżyło (98,1%). Blastocysty poddane biopsji wykazały przeżywalność powyżej 9,5%. Dzięki transferowi przede wszystkim pojedynczych, przebadanych genetycznie, euploidnych, witryfikowanych embrionów, udało nam się osiągnąć jedne z najwyższych w USA wskaźników implantacji i żywych urodzeń, niezależnie od wieku (Rysunek 3)20, zgodnie z ostatnimi statystykami krajowymi raportowanymi przez Center for Disease Control oraz Society for Assisted Reproductive Technologies (Tabele 1 i 2). Oceniając populację pacjentek z dobrą rokowaniem (poniżej 35 roku życia) wyłącznie dla cykli z kriosprzechowaniem (Tabela 1), nasze laboratorium przewyższyło średnią krajową zarówno w zakresie wskaźników implantacji (tj. efektywności embrionu w zapoczątkowaniu ciąży), jak i ostatecznie wskaźników żywych urodzeń o ponad 30%. Dodatkowo, wstępna walidacja/weryfikacja naszych zmodyfikowanych słomek do przechowywania w połowie 2014 roku, z wykorzystaniem 70 aneuploidnych blastocyst poddanych ponownej witryfikacji za zgodą komisji etycznej, zakończyła się 10% odzyskaniem i 10% przeżywalnością.
<img alt="Przygotowanie hodowli na szalce Petriego, stanowisko pipetujące do analizy próbek w eksperymencie mikrobiologicznym." src="/files/ftp_upload/54871/54871fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Konfiguracja MicroSecure VTF. naczynie VTF (A) składa się z 3 oddzielnych rzędów roztworów do witryfikacji, w których wykorzystuje się 3 krople płuczące przed umieszczeniem w oddzielnych, ponumerowanych kroplach przechowujących. Dodatkowo zastosowano poszczególne pipety z przyciętymi końcówkami do witryfikacji (VTF) (t. j. 300-µm (pipety flexipettes ID) są zabezpieczone i uporządkowane w styropianowym statywie na probówki (B), którą można obracać w celu uporządkowanego użytkowania. Należy zwrócić uwagę, że reprezentatywny zestaw do pipetowania z jednorazową gruszką do mikropipety spoczywa na styropianowej podstawce. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces podziału komórki, obraz mikroskopowy przedstawiający etapy A-C w rozmnażaniu pączkującym drożdży." src="/files/ftp_upload/54871/54871fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zmodyfikowany system oceny blastocysty. Nasz zmodyfikowany system oceny blastocyst Gardnera uwzględnia wywołane wypadnięcie komórek trofektodermy (TE) w celu ułatwienia biopsji blastocysty. Modyfikacja ta bierze pod uwagę przedwczesne wyklucie pełnych blastocyst (Astopień 3 = mniej niż 10% wypukłości) oraz rozwinięte blastocysty (BStopień 4 = do 50% wypadania), natomiast wykluwająca się blastocysta (C) wykazuje przepuklinę przekraczającą 50%16. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący wskaźnik żywych urodzeń; μS-VTF/PGS vs. brak PGS w poszczególnych grupach wiekowych." src="/files/ftp_upload/54871/54871fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Porównanie wyników ciąży. W ciągu skumulowanego okresu 1,5 roku porównano dane dotyczące ciąży w celu oceny efektów transferu witryfikowanych i rozmrożonych blastocyst euploidalnych (n = 172 cykli/14 transferów) w porównaniu z cyklami bez PGS (n = 160 cykli/153 transferów), w których przeważały transfery świeżych embrionów.18Dla naszych celów eksperymentalnych dane te wyraźnie wskazują, że biopsjowane blastocysty witryfikowane przez µSprocedura VTF pozwala na zachowanie ich żywotności. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Źródło danych</td>
			<td># Cykle</td>
			<td>Średnia liczba transferowanych embrionów</td>
			<td>Wskaźniki implantacji (%)</td>
			<td>Wskaźniki żywych urodzeń (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratorium NB</td>
			<td>144</td>
			<td>1.2</td>
			<td>74.00%</td>
			<td>74.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia krajowa</td>
			<td>20,423</td>
			<td>1.7</td>
			<td>39.60%</td>
			<td>44.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* Dane uśredniono na podstawie wyników z 2014 roku klinik Orange County Fertility, Southern California Fertility Center oraz Southern California Center for Reproductive Medicine, z wykorzystaniem obecnego laboratorium Ovation Fertility (NB Lab), które w 2008 roku opracowało procedurę witryfikacji microSecure.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Statystyki CDC z 2014 roku dotyczące wspomaganego rozrodu. Dane dotyczące ciąży po transferze zamrożonego zarodka u kobiet poniżej 35. roku życia z trzech raportujących klinik lekarskich korzystających z naszego laboratorium NB w porównaniu ze średnią krajową USA z 2013 roku z ponad 450 raportujących klinik.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Krajowe średnie SART</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klinika - Stan</td>
			<td> Kobiety </td>
			<td>Kobiety </td>
			<td>Kobiety </td>
			<td>Kobiety </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td> &lt; 35 lat</td>
			<td>35–37 lat</td>
			<td>38–40 lat</td>
			<td>41–42 lata</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCCRM-CA *</td>
			<td>63.1%</td>
			<td>58.3%</td>
			<td>40.6%</td>
			<td>32.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCRM-CO *</td>
			<td>64.7%</td>
			<td>61.5%</td>
			<td>40.4%</td>
			<td>32.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMA-NJ *</td>
			<td>63.2%</td>
			<td>59.7%</td>
			<td>34.6%</td>
			<td>18.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia krajowa</td>
			<td>48.6%</td>
			<td>38.3%</td>
			<td>24.3%</td>
			<td>12.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">   SCCRM—Southern California Center for Reproductive Medicine; CCRM—Colorado Center for Reproductive Medicine oraz RMA—Reproductive Medicine Associates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* Wiodące kliniki wprowadziły do standardowej praktyki opieki nad pacjentkami przede wszystkim cykle transferu witryfikowanych embrionów w połączeniu z preimplantacyjnym testowaniem genetycznym, aby zoptymalizować odsetek żywych urodzeń w przeliczeniu na jeden transferowany embrion.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Skumulowane wskaźniki żywych urodzeń w 2014 roku, zgłoszone przez Society for Assisted Reproductive Technologies (SART) dla kliniki SCCRM korzystającej z naszego laboratorium Ovation Fertility Lab w Newport Beach, CA, w zestawieniu z kilkoma innymi uznanymi programami, a także ze średnimi krajowymi SART.

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Ogólnym celem metody witryfikacji zarodków MicroSecure jest zapewnienie bezpiecznej, pewnej, prostej, a jednocześnie skutecznej aseptycznej procedury witryfikacji zarodków ludzkich. Metoda ta została opracowana w celu zminimalizowania zmiennych kontroli jakości w witryfikacji ludzkich zarodków, zapewniając w ten sposób niezawodny i powtarzalny sukces. Główną zaletą tej techniki jest to, że dąży ona do wyeliminowania różnic technicznych między biologami a laboratoriami.Nasza technika jest tak prosta do wykonania, że uważamy, że największym wyzwaniem dla naszych stażystów jest nauczenie się, jak pipetować zarodki bez ich utraty. Ideą naszej metody było wyeliminowanie potrzeby stosowania specjalistycznych urządzeń poprzez adaptację dwóch powszechnie używanych elementów zatwierdzonych przez FDA. Wewnętrznie znakowana jonomeryczna słomka do przechowywania i sterylny flexipet.Wizualna demonstracja tej techniki jest niezwykle pomocna, ponieważ podkreśla podstawowe wskazówki, które zapewniają jej skuteczne zastosowanie. Przed rozpoczęciem zabiegu należy umieścić sterylną słomkę nasienia o pojemności 0,3 ml na teflonowej powierzchni elektrody podstawowego stołowego zgrzewarki impulsowej, tuż przed zatyczką, aby uzyskać uszczelnienie wewnętrzne. Naciśnij uchwyt, aby aktywować ogrzewanie, zwalniając uchwyt, gdy czerwone światło zgaśnie i usłyszysz sygnał dźwiękowy.Następnie dociśnij bawełnianą zatyczkę do przodu w celu dotarcia do uszczelki wewnętrznej przed zakończeniem konfiguracji. W celu kriorozcieńczenia i obciążenia próbek blastocystami należy wyjąć naczynie do hodowli pacjenta z inkubatora i potwierdzić wszystkie identyfikacje próbek za pomocą źródła wtórnego. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj flexipetu do witryfikacji, zwanego końcówką vit, aby przenieść blastocysty do pojedynczych kropelek w górnym rzędzie odpowiedniej płytki kriogenicznej.Następnie napełnij flexipet 3 mikrolitrami roztworu V1 i dozuj połowę zawartości na pierwszy zarodek. Odessać zarodek i przenieść go do pierwszej kropelki do płukania V1. Następnie odpipetuj zarodek dwa do trzech razy wokół obwodu kropli i usuń pozostałą zawartość pipety z kropli na powierzchnię naczynia.Następnie przenieś blastocystę do pojedynczej kropli V1 i wstępnie załaduj końcówkę vit następnym roztworem V2 przed pipetowaniem dodatkowych zarodków za pomocą nowej końcówki vit. Po umyciu wszystkich blastocyst w kropelkach V2 i V3, jak właśnie pokazano, usuń pozostały roztwór i pęcherzyki z końcówki vit na zewnątrz kropli V3 i całkowicie wypełnij końcówkę czystym roztworem V3 z okolic pierwszego zarodka. Wydalić około 1 mikrolitra objętości i całkowicie odessać blastocystę i pozostały roztwór V3 do końcówki vit.Teraz wyjmij końcówkę z pipety i użyj sterylnego gaziku, aby wysuszyć pozostały roztwór V3 z zewnętrznej powierzchni końcówki vit. Suszenie zewnętrznej powierzchni końcówki ma kluczowe znaczenie i nie wiąże się z żadnym dodatkowym ryzykiem utraty zarodka. Następnie włóż końcówkę najpierw do otwartego końca wstępnie uszczelnionej słomki i odwróć słomkę, etykietując ją końcem do dołu.Obserwuj końcówkę przy wtyczce wewnętrznej. Pozostaw 1 cm przestrzeń powietrzną na otwartym końcu, a następnie bezpiecznie przyspawaj, uszczelnij ją. Gdy wszystkie słomki zostaną zamknięte, zanurz je bezpośrednio w ciekłym azocie w kolbie Dewara ze stali nierdzewnej i przechowuj słomki w otwartym kielichu przymocowanym do laski pacjenta.W przypadku elucji i rozcieńczania w roztworze krioroztworowym należy umieścić odpowiednią sześciodołkową płytkę do rozcieńczania w środku stolika mikroskopu stereoskopowego, a 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą kąpiel rozgrzewającą sacharozę o temperaturze 37 stopni Celsjusza po jednej stronie mikroskopu. Następnie odizoluj słomkę, która ma zostać podgrzana, i przytrzymaj górną uszczelkę słomki powyżej poziomu cieczy, aby potwierdzić tożsamość próbki. Użyj nożyczek do majonezu, aby zabezpieczyć słomkę poniżej wewnętrznej zatyczki, aby końcówka vit była zanurzona w ciekłym azocie.Kilkakrotnie mocno postukaj nożyczkami o kolbę Dewara, aby usunąć końcówkę z wewnętrznej bocznej ścianki słomy jako środek ostrożności w ramach kontroli jakości, a następnie podnieś słomkę na powietrze otoczenia w orientacji poziomej obok lub poniżej powierzchni stereoskopu. Chwytając nieoznakowany koniec słomki, odetnij słomkę przy wewnętrznej zatyczce. Następnie podnieś słomkę nad rozgrzewające naczynie do kąpieli i wlej końcówkę vit do wanny pod kątem 60 stopni, aż końcówka zostanie całkowicie wyciśnięta.Podstawa flexipet powinna spoczywać nad boczną ścianą naczynia. Po upływie 5 do 10 sekund przenieś podstawę pipety do pipetownika z mikronasadką. Uruchom pięciominutowy minutnik.Podczas oglądania mikroskopu użyj palca wskazującego, aby zakryć otwór bańki i delikatnie ściśnij bańkę, aby uwolnić zeszkloną blastocystę z końcówki vit do płukania T1. Po potwierdzeniu uwolnienia blastocysty usuń pozostały roztwór V3 i pęcherzyki pod nadciśnieniem, ewakuując zawartość do środka niewykorzystanej studzienki odrzutowej. Przenieś końcówkę vit na pipetę sterber, przenosząc zarodek do drugiej kropli T1 pod olejem na pozostałe cztery minuty.Podczas inkubacji należy wstępnie napełnić flexipet następnym roztworem, a następnie rozcieńczyć blastocystę w kropelkach T2, 3 i 4 w odstępach trzyminutowych. Na koniec zrównoważ blastocysty w kropli T5 przez pięć minut na powierzchni o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zanim zwrócisz je do inkubatora. Zmodyfikowany system klasyfikacji blastocyst Gardnera uważa, że pełne blastocysty mają mniej niż 10% przepukliny komórek trofektodermy, podczas gdy blastocysty z do 50% przepukliną są klasyfikowane jako rozszerzone.Uważa się, że blastocysty, które wykazują więcej niż 50% przepuklinę, wylęgają się. Korzystając z zademonstrowanych metod kriokonserwacji i ocieplania, konsekwentnie osiąga się wysoki poziom żywych urodzeń na początek cyklu, z przedimplantacyjnymi testami genetycznymi lub bez nich. Chociaż sukcesy te są znacznie wyższe, przy użyciu wstępnie wyselekcjonowanych blastocyst euploidalnych.Rzeczywiście, oceniając populację pacjentów o dobrym rokowaniu dla samych cykli kriokonserwowanych, te dane dotyczące transferu zamrożonych zarodków wykazują lepsze wskaźniki sukcesu niż średnia krajowa zarówno dla wskaźników implantacji, jak i żywych urodzeń o ponad 30%Poprzez transfer głównie pojedynczych genetycznie testowanych euploidalnych zeszklonych blastocyst, jednych z najwyższych wskaźników implantacji i wskaźników żywych urodzeń w Stanach Zjednoczonych, niezależnie od wieku, w porównaniu z ostatnimi krajowymi statystykami zgłoszonymi przez Centrum Kontroli Chorób dla dwóch innych szanowanych klinik leczenia niepłodności oraz danymi opublikowanymi przez Society for Assisted Reproductive Technologies. Witryfikacja MicroSecure to nowatorska procedura aseptyczna opracowana z myślą o łatwości technicznej, niezawodności i bezpieczeństwie kriologicznym. Ten prosty, niekomercyjny system witryfikacji stanowi wysoce skuteczną, tanią alternatywę dla urządzeń do witryfikacji.Od momentu opracowania, metoda MicroSecure zapewniła ponad 99,9% odzyskania zarodka i ponad 95% całkowitego przeżycia blastocysty. Umożliwiło to przekształcenie naszej praktyki klinicznej w prawie wszystkie cykle transferu embyro w ciągu ostatnich trzech lat. Skutecznie zmodyfikowaliśmy naszą procedurę, aby uwzględnić wewnętrzne uszczelnienie przed bawełnianym korkiem jonomerowych słomek nasienia, aby nadal zapewniać niezawodne uszczelnienia spawalnicze i doskonałe wyniki po ociepleniu.Obecnie w branży technologii wspomagającego rozrodu stosuje się wiele różnych systemów urządzeń, ale żadne inne urządzenie nie oferuje takiej prostoty i powtarzalności technicznej, aby zasadniczo wyeliminować zmienność użytkowników i zapewnić optymalne bezpieczeństwo, jak witryfikacja MicroSecure.

modified-microsecure-vitrification-safe-simple-highly-effective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę witryfikacji zarodków myszy opartą na glikolu etylenowym. Jest ona korzystniejsza od innych metod ze względu na prostotę i niską toksyczność dla zarodków, dzięki czemu może znaleźć szerokie zastosowanie u wielu szczepów myszy, w tym u myszy inbredowych i modyfikowanych genetycznie.

Kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego

W tym filmie demonstrujemy ultraszybką metodę kriowitryfikacji do konserwacji próbek biologicznych. Metoda polega na zastosowaniu kombinacji krioprotektantów w celu ochrony tkanki biologicznej przed uszkodzeniem przez zamarzanie poprzez zapobieganie tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu.

Kriokonserwacja oparta na witryfikacji: ultraszybka technika chłodzenia służąca do przechowywania próbek biologicznych w bardzo niskich temperaturach w celu długotrwałego przechowywania

W tym filmie opisujemy procedurę witryfikacji pobranych zarodków królika na pożądanym etapie rozwoju przy użyciu glikolu etylenowego i dimetylosulfotlenku jako krioprotektantów oraz słomy kriogenicznej jako systemu nośnego. Zarodki zeszklone mają wysoki wskaźnik przeżywalności i mogą być przechowywane przez dłuższy czas do momentu wykorzystania.

Witryfikacja zarodków królików za pomocą słomki kriogenicznej: ultraszybka technika chłodzenia w celu zachowania zarodków królika do długotrwałego przechowywania

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Tutaj prezentujemy poklatkowy protokół morfometryczny, aby śledzić intensywność kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst podczas interwencji prewitryfikacyjnych i regeneracji po ociepleniu. Zastosowanie protokołu jest możliwe w laboratoriach zapłodnienia pozaustrojowego wyposażonych w mikroskopy poklatkowe i jest zalecane w opracowaniu optymalnej metody witryfikacji blastocyst.

Protokół morfometryczny do obiektywnej oceny zachowania blastocyst podczas etapów witryfikacji i ocieplania

Biopsja blastocysty i witryfikacja są niezbędne do skutecznego przeprowadzenia preimplantacyjnych badań genetycznych. Podejście polegające na sekwencyjnym otwieraniu osłonki przejrzystej i pobieraniu 7-8 komórek trofektodermy w 5-7 dniu po inseminacji ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe.

Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Ten manuskrypt opisuje protokół minimalnej objętości witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów za pomocą laboratoryjnych pożywek na komercyjnych podłożach. Obejmuje każdy etap, od izolacji oocytów od gonad ex vivo po witryfikację i ocieplenie.

Minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów

Kriokonserwacja oocytów jest uznawana przez kilka międzynarodowych towarzystw naukowych za złoty standard zachowania płodności u kobiet po okresie dojrzewania. Odpowiednie strategie kliniczne i laboratoryjne zapewniają maksymalną skuteczność, efektywność i bezpieczeństwo zabiegów zachowujących płodność.

Zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne

Protokół ma na celu dostarczenie standardowej metody witryfikacji oocytów dorosłych i młodych owiec. Obejmuje wszystkie etapy od przygotowania pożywki do dojrzewania in vitro do hodowli po ociepleniu. Oocyty są witryfikowane na etapie MII przy użyciu Cryotop, aby zapewnić minimalną niezbędną objętość.

Witryfikacja dojrzałych komórek jajowych pobranych in vitro z jajników dorosłych i przed okresem dojrzewania u owiec

Przedstawiono protokół witryfikacji tkanki jajnikowej, jako alternatywną metodę kriokonserwacji do powszechnie stosowanego protokołu powolnego zamrażania.

Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji

W tym miejscu przedstawiamy protokół Spatula Montevideo do witryfikacji zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec, składający się z domowej szpatułki i wykorzystujący domowe roztwory. Zarodki są szybko równoważone w dwóch roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane na szpatułkę, zanurzane w ciekłym azocie, a na koniec zamykane słomką o pojemności 0,5 ml.

Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

Poznaj zmodyfikowaną metodę witryfikacji MicroSecure do kriokonserwacji ludzkich blastocyst. Technika ta zapewnia bezpieczną, prostą i wysoce skuteczną procedurę zamkniętą, eliminując zmienność techniczną między biologami.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Przeglądaj więcej filmów