Wstępna walidacja współrzędnych iniekcji stereotaktycznej za pomocą kriosekcji
19 lipca 2024
Obecny protokół opisuje praktyczną strategię przyspieszenia etapu weryfikacji współrzędnych iniekcji stereotaktycznej przed przeprowadzeniem śledzenia wirusa za pomocą barwników i zamrożonych skrawków.
Nasze badania koncentrowały się przede wszystkim na badaniu mechanizmu obwodów neurologicznych leżących u podstaw zaburzeń łączności u myszy i często stosowaliśmy w tych badaniach techniki stereotaktyczne mózgu. Naszym celem jest optymalizacja i przyspieszenie procesu weryfikacji miejsc iniekcji stereotaktycznych za pomocą barwników, dzięki czemu staje się on prostą i szybką procedurą. Strategie wirusowe stały się kluczowe w badaniach neurobiologicznych poprzez stereotaktyczne wstrzykiwanie wirusa.
Następnie obserwuje się markery fluorescencyjne w liniach tkanek w celu potwierdzenia miejsca wstrzyknięcia, co trwa kilka tygodni. Nasz protokół oferuje przewagę nad innymi technikami, oszczędzając nam trzy dni czasu odwodnienia i używając opłacalnego barwnika do szybszej identyfikacji miejsc wstrzyknięć. Może to zaoszczędzić tygodnie w porównaniu z brakiem wstępnej weryfikacji.
Zacznij od umieszczenia sterylnych narzędzi chirurgicznych na stole roboczym. Aby zabezpieczyć znieczuloną mysz w ramie stereotaktycznej, wymieszaj górne siekacze z zaciskiem nosowym i ustabilizuj głowę za pomocą dwóch nauszników. Za pomocą nożyczek do oczu wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie na skórze głowy, aby odsłonić czaszkę.
Za pomocą bawełnianego wacika zamoczonego w 3% nadtlenku wodoru wyszoruj odsłoniętą czaszkę, aby usunąć okostną. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia. Przymocuj wiertło do instrumentu stereotaktycznego i wyreguluj pokrętła ramion stereotaktycznych.
Za pomocą lupy umieść końcówkę wiertła dokładnie na bregmie. Zapisz wartość osi Z na bregmie za pomocą cyfrowego wyświetlacza LCD. Teraz ustaw końcówkę wiertła na lambdzie i zapisz wartość osi Z.
Wyreguluj nos clamp aby zminimalizować różnicę między dwiema wartościami Z. Ustaw wiertło na współrzędnych minus 5.2 dla X i plus 0.8 dla Y, aby zmierzyć wartość osi Z w kierunku grzbietowo-brzusznym. Zmień położenie wiertła na współrzędnych minus 5,2 dla X, minus 0,8 dla Y i ponownie zmierz wartość osi Z.
Dostosuj nauszniki do określonej skali. Ustaw wiertło w pozycji bregma i ustaw trzy współrzędne na cyfrowym wyświetlaczu LCD na zero. Korzystając ze współrzędnych referencyjnych, umieść wiertło nad obszarem zainteresowania.
Rozpocznij wiertło i stopniowo opuszczaj je za pomocą ramienia pionowego, aż wiertło wbije się w czaszkę. Usuń zanieczyszczenia i krew za pomocą bawełnianych wacików. Do probówki o pojemności 200 mikrolitrów dodać 25 mikrolitrów buforu ładującego SDS-PAGE zawierającego błękit bromofenolowy i 50 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody.
Przykryj okno czaszki wacikiem zwilżonym solą fizjologiczną. Załaduj 0,3 mikrolitra barwnika do mikrostrzykawki. Podłącz strzykawkę i zmotoryzowany stereotaktyczny mikrowtryskiwacz do ramienia stereotaktycznego.
Umieść końcówkę strzykawki na bregmie i ustaw współrzędne na zero na cyfrowym wyświetlaczu LCD. Zgodnie ze współrzędnymi referencyjnymi dostosuj igłę do obszaru zainteresowania. Ustaw prędkość wtryskiwacza na 0,1 mikrolitra na minutę i uruchom zmotoryzowany mikrowtryskiwacz, dostarczając 0,3 mikrolitra barwnika do obszaru docelowego.
Po 10 minutach powoli wyjmij wtryskiwacz. Aby rozpocząć, uwolnij mysz z wstrzykiwanym niebieskim barwnikiem bromofenolowym z ramki stereotaktycznej. Po znieczuleniu zabezpiecz mysz na płycie piankowej za pomocą taśmy.
Wykonaj nacięcie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów w prawym uszku przedsionka. Wprowadzić igłę infuzyjną do lewej komory. Wlej 20 mililitrów wstępnie schłodzonej soli fizjologicznej, a następnie 20 mililitrów mrożonego 4% roztworu paraformaldehydu.
Teraz wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od szyi do nosa, aby usunąć skórę i odsłonić czaszkę. Użyj kleszczy lub nożyczek, aby usunąć resztki mięśni na czaszce. Umieść czubek jednego ostrza cienkich nożyczek między otworem wielkim a mózgiem ostrą krawędzią skierowaną w stronę kości na rostralnym końcu środkowego szwu strzałkowego.
Delikatnie przesuń i przetnij czaszkę wzdłuż środkowego szwu strzałkowego. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę, odsłaniając mózg. Po włączeniu kriostatu rotacyjnego należy ustawić temperaturę komory na minus 20 stopni Celsjusza.
Wlej trochę optycznej temperatury cięcia lub związku OCT, aby równomiernie pokryć powierzchnię krążka próbki. Umieść krążek próbki w kriokomorze i pozwól OCT zastygnąć. Przymocuj krążek do głowicy próbki.
Następnie zbliż ostrze do bloku i przytnij blok OCT, aby uzyskać płaską płaszczyznę równoległą do dysku. Za pomocą ostrza do golenia odetnij mózg w kierunku koronalnym od miejsca wstrzyknięcia w formie do wycinania mózgu. Umieść tkankę mózgową zawierającą miejsce wstrzyknięcia ściętą stroną do dołu na płaskiej płaszczyźnie OCT.
Wlej OCT na mózg i umieść krążek w kriokomorze, pozwalając blokowi próbki zestalić się. Przyciąć blok próbki, aż obszar docelowy będzie się zbliżał i wykonać kilka odcinków od poziomu miejsca wstrzyknięcia. Użyj schłodzonego małego pędzla do pisania, aby zebrać wycinki mózgu koronalnego na sześciodołkową płytkę zawierającą PBS o temperaturze pokojowej.
Za pomocą pędzla podnieś skrawki mózgu z płytki sześciodołkowej i umieść je na szkiełku. Po narysowaniu obserwuj wzrokowo wstrzyknięty obszar w sekcjach mózgu.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół opracowany w celu przyspieszenia weryfikacji współrzędnych iniekcji stereotaktycznych przed przeprowadzeniem śledzenia wirusowego u myszy. Metoda ta wykorzystuje barwniki do szybkiej identyfikacji miejsc iniekcji, co znacząco skraca czas potrzebny na wstępną weryfikację w porównaniu do standardowych technik.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuroanatomia
- Techniki stereotaktyczne
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów obwodów neuronalnych w odniesieniu do zaburzeń połączeń.
- Znaczenie iniekcji stereotaktycznych w badaniach neuronaukowych.
- Tradycyjny, długotrwały proces weryfikacji miejsc iniekcji.
- Innowacje w wykorzystaniu ekonomicznych barwników w celu szybszej weryfikacji.
Cel badania
- Optymalizacja procesu wstrzykiwania stereotaktycznego.
- Skrócenie czasu weryfikacji miejsc wstrzyknięcia z wykorzystaniem nowatorskich technik barwienia.
- Poprawa ogólnej wydajności badań nad śledzeniem wirusowym.
Zastosowane metody
- Procedura obejmuje unieruchomienie myszy w aparacie stereotaktycznym i wykonanie precyzyjnych nacięć czaszki.
- Iniekcje barwnika są przeprowadzane w określonych współrzędnych przy użyciu mikroinjektora, a następnie wykonuje się sekcjonowanie tkanki w celu weryfikacji.
- Metodyka obejmuje kluczowe etapy, takie jak prawidłowe ustawienie wiertła i strzykawki podczas procesu iniekcji.
- Zastosowanie związku OCT (optimal cutting temperature compound) w celu konserwacji próbek w przekrojach kriostatycznych.
- Eliminacja kilku dni czasu dehydratacji dzięki zastosowaniu skutecznych technik identyfikacji barwnika.
Główne wyniki
- Proponowana metoda znacząco skraca czas weryfikacji iniekcji stereotaktycznych.
- Walidacja poprzez usprawnioną obserwację markerów fluorescencyjnych w tkankach mózgowych.
- Ogólny wzrost wydajności w prowadzeniu późniejszych badań nad śledzeniem wirusowym.
- Pomyślna identyfikacja miejsca iniekcji zwiększa dokładność wyników badań nad obwodami neuronalnymi.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje wartościowy protokół, który usprawnia wstępną weryfikację iniekcji stereotaksycznych.
- Zastosowanie technik szybkiej identyfikacji umożliwia bardziej efektywne prowadzenie dalszych badań nad mechanizmami obwodów neuronalnych.
- Wyniki mają znaczenie dla doskonalenia projektów eksperymentalnych w neuronauce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Dokładna weryfikacja miejsca wstrzyknięcia stereotaktycznego jest kluczowa dla zapewnienia precyzyjnego celowania w badaniach nad obwodami neuronalnymi, co bezpośrednio wpływa na wiarygodność późniejszych analiz funkcjonalnych i manipulacji genetycznych. Szybka wstępna weryfikacja z wykorzystaniem barwnika i kriosiekcji skraca czas cyklu oraz zmniejsza zużycie zasobów, co pozwala na uzyskanie większej pewności predykcyjnej na najwcześniejszych etapach walidacji celu w ośrodkowym układzie nerwowym. Podejście to umożliwia bardziej efektywną selekcję i rozwój programów odkryć neurobiologicznych opartych na przestrzennie ograniczonym dostarczaniu genów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką weryfikację hipotez poprzez potwierdzenie celowania anatomicznego przed wprowadzeniem ładunków wirusowych lub genetycznych.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając, że manipulacje ograniczają się do zamierzonych obszarów mózgu.
- Wspiera walidację funkcjonalną celu poprzez dopasowanie precyzji iniekcji do wymagań projektu eksperymentalnego.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla późniejszych badań in vivo z wykorzystaniem narzędzi optogenetycznych lub chemogenetycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli zwierzęcych do późniejszych analiz funkcjonalnych.
- Standaryzuje weryfikację miejsca wstrzyknięcia, zwiększając powtarzalność w obrębie kohort eksperymentalnych.
- Umożliwia ilościową ocenę dokładności wstrzyknięcia, co wspiera opracowanie wiarygodnych testów.
- Przyspiesza przygotowanie do przesiewania związków lub analiz genetycznych poprzez minimalizację opóźnień wynikających z błędów w celowaniu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Poprawia ciągłość translacyjną poprzez zapewnienie wierności anatomicznej w przedklinicznych modelach OUN.
- Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie ujemnych w badaniach skuteczności wynikających z dostarczenia substancji poza docelowy obszar.
- Wspiera dostosowanie modeli przedklinicznych do neuroanatomicznych obwodów istotnych dla danej choroby.
- Usprawnia proces podejmowania decyzji o przekazaniu kandydatów do bardziej zasobożernych badań.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda walidacji znajduje zastosowanie na etapie przejścia między wczesną fazą odkrywania a opracowywaniem modeli przedklinicznych, poprzedzając dostarczenie wektora wirusowego oraz testy odczytu funkcjonalnego.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia natychmiastową informację zwrotną na temat dokładności celowania, co wspiera iteracyjne doprecyzowanie hipotez.
- Przesiewanie: Ustanawia powtarzalne współrzędne wstrzykiwań, umożliwiając standaryzowane generowanie modeli dla kampanii przesiewowych.
- Analityka: Dostarcza wizualnego i przestrzennego potwierdzenia miejsc wstrzyknięcia, wspierając ilościowe porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewnia precyzję anatomiczną w modelach wykorzystywanych do badań nad biomarkerami lub skutecznością.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny i kosztowo efektywny przepływ pracy, który można dostosować do różnych celów w OUN oraz paradygmatów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niepewność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływ pracy, skraca czas weryfikacji z tygodni do godzin i obniża koszty materiałowe.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go oraz bardziej efektywną alokację zasobów B+R.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez minimalizację wskaźników niepowodzeń technicznych w programach na wczesnym etapie.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej i mapowaniu neuroanatomicznym.
- Wymagany jest dostęp do sprzętu do kriotomii oraz odpowiednich barwników do wizualizacji.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja systemów współrzędnych i kroków proceduralnych między zespołami.
- Możlizna jest potrzeba adaptacji metody dla różnych szczepów myszy, grup wiekowych lub obszarów mózgu.
- Dokładność zależy od skrupulatnego przestrzegania procedury i precyzyjnej kalibracji instrumentów.
