Wstępna walidacja współrzędnych iniekcji stereotaktycznej za pomocą kriosekcji

Obecny protokół opisuje praktyczną strategię przyspieszenia etapu weryfikacji współrzędnych iniekcji stereotaktycznej przed przeprowadzeniem śledzenia wirusa za pomocą barwników i zamrożonych skrawków.

Nasze badania koncentrowały się przede wszystkim na badaniu mechanizmu obwodów neurologicznych leżących u podstaw zaburzeń łączności u myszy i często stosowaliśmy w tych badaniach techniki stereotaktyczne mózgu. Naszym celem jest optymalizacja i przyspieszenie procesu weryfikacji miejsc iniekcji stereotaktycznych za pomocą barwników, dzięki czemu staje się on prostą i szybką procedurą. Strategie wirusowe stały się kluczowe w badaniach neurobiologicznych poprzez stereotaktyczne wstrzykiwanie wirusa.

Następnie obserwuje się markery fluorescencyjne w liniach tkanek w celu potwierdzenia miejsca wstrzyknięcia, co trwa kilka tygodni. Nasz protokół oferuje przewagę nad innymi technikami, oszczędzając nam trzy dni czasu odwodnienia i używając opłacalnego barwnika do szybszej identyfikacji miejsc wstrzyknięć. Może to zaoszczędzić tygodnie w porównaniu z brakiem wstępnej weryfikacji.

Zacznij od umieszczenia sterylnych narzędzi chirurgicznych na stole roboczym. Aby zabezpieczyć znieczuloną mysz w ramie stereotaktycznej, wymieszaj górne siekacze z zaciskiem nosowym i ustabilizuj głowę za pomocą dwóch nauszników. Za pomocą nożyczek do oczu wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie na skórze głowy, aby odsłonić czaszkę.

Za pomocą bawełnianego wacika zamoczonego w 3% nadtlenku wodoru wyszoruj odsłoniętą czaszkę, aby usunąć okostną. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia. Przymocuj wiertło do instrumentu stereotaktycznego i wyreguluj pokrętła ramion stereotaktycznych.

Za pomocą lupy umieść końcówkę wiertła dokładnie na bregmie. Zapisz wartość osi Z na bregmie za pomocą cyfrowego wyświetlacza LCD. Teraz ustaw końcówkę wiertła na lambdzie i zapisz wartość osi Z.

Wyreguluj nos clamp aby zminimalizować różnicę między dwiema wartościami Z. Ustaw wiertło na współrzędnych minus 5.2 dla X i plus 0.8 dla Y, aby zmierzyć wartość osi Z w kierunku grzbietowo-brzusznym. Zmień położenie wiertła na współrzędnych minus 5,2 dla X, minus 0,8 dla Y i ponownie zmierz wartość osi Z.

Dostosuj nauszniki do określonej skali. Ustaw wiertło w pozycji bregma i ustaw trzy współrzędne na cyfrowym wyświetlaczu LCD na zero. Korzystając ze współrzędnych referencyjnych, umieść wiertło nad obszarem zainteresowania.

Rozpocznij wiertło i stopniowo opuszczaj je za pomocą ramienia pionowego, aż wiertło wbije się w czaszkę. Usuń zanieczyszczenia i krew za pomocą bawełnianych wacików. Do probówki o pojemności 200 mikrolitrów dodać 25 mikrolitrów buforu ładującego SDS-PAGE zawierającego błękit bromofenolowy i 50 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody.

Przykryj okno czaszki wacikiem zwilżonym solą fizjologiczną. Załaduj 0,3 mikrolitra barwnika do mikrostrzykawki. Podłącz strzykawkę i zmotoryzowany stereotaktyczny mikrowtryskiwacz do ramienia stereotaktycznego.

Umieść końcówkę strzykawki na bregmie i ustaw współrzędne na zero na cyfrowym wyświetlaczu LCD. Zgodnie ze współrzędnymi referencyjnymi dostosuj igłę do obszaru zainteresowania. Ustaw prędkość wtryskiwacza na 0,1 mikrolitra na minutę i uruchom zmotoryzowany mikrowtryskiwacz, dostarczając 0,3 mikrolitra barwnika do obszaru docelowego.

Po 10 minutach powoli wyjmij wtryskiwacz. Aby rozpocząć, uwolnij mysz z wstrzykiwanym niebieskim barwnikiem bromofenolowym z ramki stereotaktycznej. Po znieczuleniu zabezpiecz mysz na płycie piankowej za pomocą taśmy.

Wykonaj nacięcie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów w prawym uszku przedsionka. Wprowadzić igłę infuzyjną do lewej komory. Wlej 20 mililitrów wstępnie schłodzonej soli fizjologicznej, a następnie 20 mililitrów mrożonego 4% roztworu paraformaldehydu.

Teraz wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od szyi do nosa, aby usunąć skórę i odsłonić czaszkę. Użyj kleszczy lub nożyczek, aby usunąć resztki mięśni na czaszce. Umieść czubek jednego ostrza cienkich nożyczek między otworem wielkim a mózgiem ostrą krawędzią skierowaną w stronę kości na rostralnym końcu środkowego szwu strzałkowego.

Delikatnie przesuń i przetnij czaszkę wzdłuż środkowego szwu strzałkowego. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę, odsłaniając mózg. Po włączeniu kriostatu rotacyjnego należy ustawić temperaturę komory na minus 20 stopni Celsjusza.

Wlej trochę optycznej temperatury cięcia lub związku OCT, aby równomiernie pokryć powierzchnię krążka próbki. Umieść krążek próbki w kriokomorze i pozwól OCT zastygnąć. Przymocuj krążek do głowicy próbki.

Następnie zbliż ostrze do bloku i przytnij blok OCT, aby uzyskać płaską płaszczyznę równoległą do dysku. Za pomocą ostrza do golenia odetnij mózg w kierunku koronalnym od miejsca wstrzyknięcia w formie do wycinania mózgu. Umieść tkankę mózgową zawierającą miejsce wstrzyknięcia ściętą stroną do dołu na płaskiej płaszczyźnie OCT.

Wlej OCT na mózg i umieść krążek w kriokomorze, pozwalając blokowi próbki zestalić się. Przyciąć blok próbki, aż obszar docelowy będzie się zbliżał i wykonać kilka odcinków od poziomu miejsca wstrzyknięcia. Użyj schłodzonego małego pędzla do pisania, aby zebrać wycinki mózgu koronalnego na sześciodołkową płytkę zawierającą PBS o temperaturze pokojowej.

Za pomocą pędzla podnieś skrawki mózgu z płytki sześciodołkowej i umieść je na szkiełku. Po narysowaniu obserwuj wzrokowo wstrzyknięty obszar w sekcjach mózgu.