Syntetyczne kondensaty i architektury podobne do komórek z amfifilowych nanostruktur DNA

Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu programowalnych amfifilowych nanostruktur DNA do opracowania syntetycznych komórek, które naśladują komórki biologiczne. Badamy, w jaki sposób i dlaczego nasze nanostruktury samoorganizują się i jak sprawić, by były funkcjonalnie złożone pod kątem potencjalnych zastosowań, takich jak dostarczanie leków, tworzenie szablonów materiałów i przechowywanie informacji. Po pierwsze, nasz protokół wprowadza prostą i modułową platformę do projektowania syntetycznych komórek o złożoności zarówno strukturalnej, jak i funkcjonalnej.

Następnie inne rurki kapilarne ze szkła kondensacyjnego G oferują solidny sposób ich wytwarzania, a to, co naprawdę podoba nam się w tej metodzie, to to, że możemy obrazować kondensat bezpośrednio pod mikroskopem. Łącząc nasze kondensaty z innymi modułowymi blokami konstrukcyjnymi. Pokazaliśmy, w jaki sposób prosty proces może być wykorzystany do generowania złożonych struktur bez konieczności stosowania drogiego sprzętu lub czasochłonnych etapów syntezy i oczyszczania.

Nasza praca umożliwia innym badaczom w tej dziedzinie konstruowanie własnych syntetycznych komórek przy użyciu amfifilowych nanostruktur DNA. Mamy nadzieję, że inni skorzystają z solidnego, prostego protokołu do zaprojektowania responsywnych struktur, które pomogą im rozwiązać własne pytania badawcze. Rozpocznij od sonikacji szklanych kapilar za pomocą alkalicznego detergentu optycznego do elementów optycznych.

Aby to zrobić, weź wymaganą liczbę szklanych kapilar i umieść je w wysokim, wąskim pojemniku, tak aby naczynia włosowate nie leżały płasko na jego podstawie. Dodaj 1% alkaliczny roztwór detergentu w wodzie dejonizowanej do pojemnika, upewniając się, że zakrywa tylko rurki kapilarne. Stuknij, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza z wnętrza rur.

Luźno przykryj pojemnik. Umieść przykryty pojemnik pionowo w wannie, upewniając się, że pokrywa nie styka się z wodą z wanny. Sonikuj rurki w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut przed wyłączeniem elementu grzejnego wanny.

Następnie dokładnie spłucz naczynia włosowate wodą dejonizowaną lub ultraczystą co najmniej pięć razy, wyrzucając wypłukaną wodę po każdym cyklu. Następnie dodaj izopropanol lub etanol do szklanych kapilar w pojemniku tak, aby poziom cieczy znajdował się tuż nad rurkami kapilarnymi. Po upewnieniu się, że w rurkach nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza, luźno przykryj pojemnik.

Sonikować naczynia włosowate, jak wykazano wcześniej, przez 15 do 30 minut. Po prawidłowym pozbyciu się alkoholu osusz naczynia włosowate pod azotem, jednocześnie dotykając ich niestrzępiącą się chusteczką. Zacznij od przygotowania mieszanin gwiazdek C dla kondensatów jednoskładnikowych przy użyciu wstępnie oczyszczonych szklanych kapilarnek kapilarnych.

W tym celu za pomocą pipety należy pobrać całe 60 mikrolitrów roztworu gwiazdki C i ostrożnie przenieść go do oczyszczonej, suchej szklanej rurki kapilarnej, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie odpipetuj około dziewięciu do 12 mikrolitrów oleju mineralnego na każdym końcu rurki kapilarnej, aby zapobiec swobodnemu połączeniu roztworu C-star z powietrzem. Osusz zewnętrzną część rurki kapilarnej bibułą, upewniając się, że nie ma pozostałości oleju bez odprowadzania oleju mineralnego lub roztworu C-star z tuby.

Użyj małej partii dwuskładnikowego kleju epoksydowego, aby całkowicie uszczelnić i przykleić każdy koniec rurki kapilarnej, płaską stroną do dołu do szklanego szkiełka nakrywkowego. Odstaw zestaw do utwardzenia na minimum trzy godziny, ale najlepiej na noc. Po około 30 minutach utwardzania sprawdź, czy w warstwie kleju nie ma szczelin w uszczelce spowodowanych pęcherzykami powietrza.

Owiń rurkę kapilarną przyklejoną do szkiełka nakrywkowego folią aluminiową, upewniając się, że folia jest płasko przylegająca do spodu szklanego szkiełka nakrywkowego. Umieść próbkę owijaną w termocyklerze i uklęknij, stosując określony protokół. Kondensaty jednoskładnikowe były dyskretne, jednorodne i sprawiały wrażenie wielościennych lub kulistych.

Obecność pęcherzyków powietrza w rurce kapilarnej zakłócała samoorganizację kondensatów, często powodując agregację w pobliżu granicy faz powietrza. Na początek przygotuj dużą mikroprobówkę wirówkową zawierającą 60 mikrolitrów 0,3-molowego chlorku sodu w buforze Tris-EDTA. Następnie odwiń wcześniej przygotowaną próbkę kapilarną, przyklej ją do szkiełka nakrywkowego i za pomocą pisaka diamentowego naciąć spód szkiełka nakrywkowego na każdym wewnętrznym końcu klejonego obszaru.

Oderwij szkiełko nakrywkowe w tym miejscu i wyrzuć je w odpowiedni sposób. Dokładnie oczyść rurkę kapilarną etanolem przed jej wysuszeniem. Następnie naciąć każdy koniec rurki kapilarnej diamentowym pisakiem do rysowania najpierw na spodzie, a następnie odwrócić i naciąć rurkę prawą stroną do góry.

Upewnij się, że linie nacięcia nie zachodzą na interfejs oleju-wody. Oderwij końce rurek kapilarnych, zachowując środkową część i odrzucając resztę. Umieść przeciętą rurkę kapilarną we wcześniej przygotowanej mikroprobówce wirówkowej, upewniając się, że dno rurki kapilarnej styka się z roztworem buforowym.

Pozwól, aby kondensaty opadły z rurki do zbiornika buforowego pod wpływem grawitacji przez co najmniej 10 minut. Na koniec wyjmij przeciętą rurkę kapilarną i odpowiednio ją wyrzuć. Na początek umyj RNA tworzące kondensaty gwiazdy, pozwalając roztworowi wyekstrahowanych kondensatów osiąść przez co najmniej pięć minut.

Następnie, pipetując od góry poziomu cieczy, aby zminimalizować usuwanie kondensatu, należy usunąć około połowy objętości supernatantu. Dodać tę samą objętość 0,3 molowego chlorku sodu do Tris-EDTA, aby zastąpić usunięty supernatant i wymieszać przez pipetowanie. Powtórzyć cykl usuwania sklarowanego osadu i wymiany buforu, w sumie przez trzy cykle.

Dla mieszaniny transkrypcyjnej T7 przygotować roztwór podstawowy 10 milimolowego DFHBI w dimetylosulfotlenku, a następnie rozcieńczyć podwielokrotność do końcowego stężenia 600 mikromolowych przy użyciu wody wolnej od RNA i DNA. Rozmrozić elementy zestawu do transkrypcji na lodzie. Następnie, za pomocą sterylnych końcówek do pipet, odpipetuj wyświetlane elementy do probówki mikrowirówki w autoklawie o temperaturze pokojowej.

Delikatnie wymieszać roztwór przez pipetowanie i natychmiast użyć go do syntezy transkryptu RNA. W tym celu należy pobrać pipetą 3,3 mikrolitra przemytych kondensatów przygotowanych z RNA szablonujących C-gwiazdy do komory odpowiedniej do obrazowania mikroskopowego i dodać całkowitą objętość świeżo przygotowanej mieszaniny transkrypcyjnej. Obrazy mikroskopowe należy uzyskiwać przez okres 18 godzin, rozpoczynając bezpośrednio po dodaniu mieszaniny transkrypcyjnej do kondensatów.

W przypadku transkrypcji aptamerów RNA pomyślny wynik został potwierdzony przez wzrost fluorescencji fluenginy w czasie za pomocą mikroskopii.