Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc
21 lutego 2025
Kultura interfejsu powietrze-ciecz jest powszechnie stosowana do tworzenia pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli, które naśladują wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. W tym miejscu opisujemy prosty protokół określania jego jakości poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i integralność błony.
Nasze badania mają na celu zmierzenie dwóch krytycznych właściwości biofizycznych pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych, które można uzyskać poprzez różnicowanie normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli w granicy faz powietrze-ciecz. Zidentyfikowaliśmy różne cechy różnych wirusów układu oddechowego za pomocą pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych. Na przykład zapalenie cytoszkieletu wywołane przez syncytialny wirus oddechowy, które jest niekanonicznym mechanizmem zapalenia oskrzelików.
Zidentyfikowaliśmy również, że przerost komórek kubkowych zwiększa replikację SARS-CoV-2 w przewlekłym obturacyjnym nabłonku dróg oddechowych choroby płuc. Skupiliśmy się na wyjaśnieniu mechanizmu modulacji sygnalizacji cytoszkieletowej przez syncytialny wirus oddechowy w celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych do zwalczania infekcji RSV i zapalenia oskrzelików wywołanego przez wirusa. Na początek weź normalną zawiesinę komórek ludzkiego nabłonka oskrzeli lub NHBE.
Za pomocą pipety P200 dodaj 50 000 ponownie zawieszonych komórek w 200 mikrolitrach kompletnej komórki nabłonka dróg oddechowych lub AEC, pożywki po wierzchołkowej stronie wkładki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych z dwutlenkiem węgla nawilżonym od 85% do 95%. Gdy komórki się zlewają, przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy.
Za pomocą pipety P1000 odessać całe podstawowe podłoże AEC. Następnie dodać 500 mikrolitrów świeżej pożywki do pełnego różnicowania ALI uzupełnionej 2% penicyliną-streptomycyną i 1% amfoterycyną B do studzienki podstawowej. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś wkładki do studzienki podstawowej z dodanym kompletnym podłożem ALI.
Za pomocą pipety P200 delikatnie odessać wierzchołkowe podłoże AEC ze studzienki i przeprowadzić jego inkubację. Po 48 godzinach przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Za pomocą pipety P1000 odessać starą pożywkę i dodać 500 mikrolitrów świeżej, kompletnej pożywki ALI.
Umieść wkładki z powrotem w studzience ze świeżą pożywką za pomocą sterylnych kleszczy. W 26 dniu, za pomocą pipety P200, dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę wkładek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut.
Następnie odessać DPBS za pomocą pipety P200. Aby rozpocząć, włącz mikroskop, dołączony komputer i komorę środowiskową. Otwórz drzwi komory i umieść płytkę zawierającą wkładki z komórkami NBHE na stoliku mikroskopu.
Gdy płyta znajdzie się na scenie, zamknij komorę. Następnie użyj pokrętła operacyjnego stolika mikroskopu, aby przesunąć płytkę i umieścić wkładki w polu widzenia. Na ekranie komputera kliknij ikonę systemu SAVA, aby otworzyć program SAVA.
W interfejsie oprogramowania kliknij Konfiguruj eksperyment. W następnej zakładce kliknij Utwórz eksperyment. Następnie w nowej karcie wprowadź katalog, w którym będą przechowywane dane w polu Enter Experiment Directory Name i podaj szczegóły w polu Enter Experiment Description, a następnie kliknij przycisk OK. Teraz kliknij eksperyment, który został utworzony i jest wyświetlany w katalogu w sekcji Eksperymenty.
Następnie kliknij Modyfikuj i podaj przykładowe szczegóły w polu Przykładowy opis. Kliknij przycisk Dodaj, a następnie kliknij przycisk Zakończ, aby opuścić kartę. W głównym interfejsie oprogramowania wybierz utworzony eksperyment z menu rozwijanego w gnieździe Eksperyment.
Następnie kliknij Nagraj wideo, aby monitorować częstotliwość dudnień rzęsek na ekranie komputera. Na ekranie pojawi się skoncentrowany ruch rzęsek. Dla każdej wstawki nagraj sześć różnych losowych pól przez 2,1 sekundy przy 120 klatkach na sekundę.
Kliknij Zapisz wideo, aby monitorować dane dotyczące częstotliwości uderzeń rzęsek. Aby przeanalizować dane, kliknij Analizuj wideo w interfejsie oprogramowania. A na następnej karcie kliknij OK. Następnie przejdź do następującej zakładki i kliknij Analizuj wszystko.
Pobierz arkusz kalkulacyjny wygenerowany dla każdego eksperymentu z folderu SAVA Data Acquisition na komputerze. Weźmy średnią częstotliwość Gaussa do prezentacji danych. Częstotliwość dudnienia rzęsek osiągnęła co najmniej trzy herce zarówno dla nabłonka dróg oddechowych u zdrowych osób dorosłych, jak i osób z POChP, wykazując porównywalną funkcję rzęsek.
Aby rozpocząć, włącz omomierz EVOM2 za pomocą wyłącznika zasilania. Podłącz rezystor testowy do EVOM2 w gnieździe wejściowym. Monitoruj odczyt na ekranie EVOM2.
Jeśli odczyt jest wyższy lub niższy niż 1 000, przekręć przełącznik ADJ na EVOM2 za pomocą kleszczy, aż pokaże jednolity odczyt 1 000, aby skalibrować urządzenie. Teraz weź pustą wkładkę do eksperymentalnego odczytu kontrolnego. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę pustej wkładki.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów DPBS po stronie podstawowej za pomocą pipety P1000. Następnie odłącz rezystor testowy i podłącz elektrodę STX2 do gniazda wejściowego w EVOM2. Następnie delikatnie wyczyść elektrodę STX2 70% etanolem.
Włóż elektrodę STX2 do pustej wkładki z DPBS, trzymając krótszą nogę elektrody na części wierzchołkowej, a dłuższą nogę elektrody na części podstawnej. Teraz nagraj stabilny odczyt na ekranie EVOM2. Następnie za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę wkładki.
Włóż elektrodę STX2 do wkładki z 26-dniowym zróżnicowanym nabłonkiem dróg oddechowych, jak pokazano wcześniej. Następnie nagraj stabilny odczyt na ekranie EVOM2. Wartości przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej wzrosły u dorosłych z POChP, co wskazuje na zwiększoną nieprzepuszczalność błony w POChP.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na rozwoju pseudowarstwowanego nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli zróżnicowanych w warunkach powietrze-ciecz (ALI). Badanie podkreśla metodę oceny jakości tego modelu nabłonkowego poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, szczególnie funkcji rzęsek i integralności membrany, które są krytyczne dla zrozumienia wirusowych zakażeń dróg oddechowych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Pseudowarstwowany nabłonek dróg oddechowych
- Wirusy układu oddechowego
- Brończyolitis i powikłania POChP
Tło
- Hodowla powietrze-ciecz naśladuje cechy dróg powietrznych płuc.
- Wirus RSV wykazuje niekanoniczne mechanizmy zapalne.
- Hiperplazja komórek wydzielniczych i jej wpływ na replikację SARS-CoV-2.
Stosowane metody
- Protokoły różnicowania komórek i techniki monitorowania
- Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE)
- Wideomikroskopia do oceny częstości bicia rzęsek; rezystancja elektryczna przez nabłonek do integralności membrany
Główne wyniki
- Częstość bicia rzęsek osiągnęła trzy herce zarówno u zdrowych dorosłych, jak i pacjentów z POChP, co wskazuje na porównywalną funkcję rzęsek.
- Wartości rezystancji przez nabłonek sugerują zwiększoną nieprzepuszczalność membrany w POChP.
- Identyfikowano modulacje cytoszkieletu wywołane przez RSV i jej implikacje dla docelowego leczenia.
Wnioski
- Badanie z powodzeniem ustanowiło niezawodną metodę oceny kultur nabłonka dróg oddechowych.
- Wyniki dostarczają istotnych informacji na temat patofizjologii wirusowych zakażeń dróg oddechowych i ich implikacji w przewlekłych chorobach, takich jak POChP.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of ciliary function and membrane impermeability in pseudostratified airway epithelium provides critical quality control for preclinical respiratory models. These biophysical readouts underpin predictive confidence in disease-relevant systems for respiratory virus research and therapeutic target validation. Reliable measurement of ciliary beat frequency and transepithelial resistance supports risk-adjusted advancement of airway models across discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of airway epithelial models for respiratory disease research.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying ciliary activity and barrier integrity.
- Facilitates identification of novel therapeutic targets through disease-relevant phenotyping.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible metrics for assay readiness in airway models.
- Delivers quantitative outputs (CBF, TEER) essential for compound screening workflows.
- Ensures biological system quality for reliable downstream evaluation of antiviral agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro airway models with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables comparative studies of healthy and diseased epithelium, supporting biomarker development.
- Reduces translational risk by validating model integrity prior to preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method anchors airway model qualification from early discovery through preclinical research, supporting both target validation and screening inflection points.
- Discovery Biology: Quantitative CBF and TEER measurements clarify functional status and biological relevance of airway models.
- Screening: Standardized outputs enable reproducible assay development and compound evaluation.
- Analytics: High-speed video and volt-ohm readouts provide objective, comparable data across conditions.
- Translational Research: Disease-relevant measurements support alignment with clinical endpoints and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: The protocol establishes a reusable platform for respiratory virus and airway disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible quality control metrics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by ensuring model reliability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in airway epithelial cell culture and differentiation.
- Needs access to high-speed videomicroscopy and volt-ohm instrumentation.
- Demands cross-team standardization of measurement protocols and data analysis.
- Adaptation may be needed for different donor sources or disease models.
- Dependent on consistent cell quality and environmental control for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Establishing Air Liquid Interface (ALI) Culture to Develop Pseudostratified Airway Epithelium
3:07
Determination of Ciliary Beat Frequency of the Airway Epithelium Obtained from Differentiating Primary NHBE Cells
5:37
Quantification of Transepithelial Electrical Resistance of Air Liquid Interface‐Cultured Pseudostratified Airway Epithelium
