Name: Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony nabłonka dróg oddechowych przy użyciu ludzkich komórek NHBE w kulturze ALI. Technika ta umożliwia badanie infekcji wirusowych układu oddechowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NIH P20GM113123 i UND SMHS pilotażowy grant.

Protokół powinien być wykonany w sterylnym stanie pod okapem z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (komora bezpieczeństwa biologicznego). Wszystkie podłoża i roztwory należy rozmrozić w temperaturze 37 °C przed użyciem. Wirowanie powinno odbywać się w temperaturze 4 °C. Wszystkie materiały użyte w eksperymencie muszą być sterylne. Komórki pierwotne (dawcy pozbawionego tożsamości użytkownika) uzyskano we współpracy z dr Kristiną Bailey z University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE. Pierwotne komórki pochodzą od niezidentyfikowanych dawców, a komórki nie należą do NIH Human Subject. Ogniwa zostały pozyskane na podstawie zatwierdzonej umowy o transferze materiałów (MTA) między Uniwersytetem Północnej Dakoty, Grand Forks, ND i UNMC, Omaha, NE. W tym przypadku użyliśmy pasażowanych 4 komórek NHBE. Chociaż wykazano również, że komórki NHBE o wyższym pasażu (do przejścia 8) różnicują się w nabłonek dróg oddechowych, rutynowo używamy czterech komórek NHBE, ponieważ nie ma oczywistej różnicy w profilach transkrypcji całego genomu między przejściami od 1 do 46,14.
1. Pierwotna hodowla komórkowa
UWAGA: Ostrożne obchodzenie się z komórkami pierwotnymi jest kluczowe. W całym protokole należy unikać ostrego leczenia i nadmiernego pipetowania komórek pierwotnych.
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej dodaj 5 ml kolagenu do naczynia do hodowli tkankowej (TC) o średnicy 100 mm w celu wstępnego pokrycia szalki. Inkubować naczynie TC z kolagenem w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej odessać kolagen z szalki TC i zastąpić go 8 ml wstępnie rozmrożonego podłoża z komórek nabłonka dróg oddechowych (AEC) uzupełnionego 2% (v/v) penicyliny-streptomycyny i 1% (v/v) amfoterycyny B (Tabela 1).</li>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę (zawierającą 5 x 105 komórek) pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (NHBE) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodaj kroplami 1 ml wstępnie rozmrożonej kompletnej pożywki AEC do komórek, aby zaaklimatyzować komórki NHBE, a następnie zbierz wszystkie komórki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 212 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie wyrzucić pożywkę z probówki i ponownie zawiesić komórki w pozostałych kroplach pożywki w probówce, delikatnie stukając. 
	UWAGA: Należy unikać nadmiernego i ostrego stukania.</li>
	<li>Używając sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml, powoli dodać 2 ml kompletnej pożywki AEC do zawieszonych komórek i zebrać wszystkie komórki.</li>
	<li>Dodać komórki do płytki z dodatkiem 8 ml kompletnego podłoża AEC. Przesuń szalkę TC na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki w naczyniu.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 o wilgotności 85%-95%. Po 24 godzinach obserwuj komórki NHBE pod mikroskopem pod kątem 10x lub 20x pod kątem ich przyczepienia do szalki TC i wzrostu. Jeśli komórki są zawieszone w pożywce, oznacza to martwe komórki.</li>
	<li>Po 48 godzinach odessać starą pożywkę z szalki TC za pomocą sterylnej pipety serologicznej.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej dodać do komórek 10 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki AEC. Powoli dodawaj multimedia do jednego rogu; Unikaj bezpośredniego wylewania na wierzch komórek.</li>
	<li>Zmieniaj całe media AEC co 48 godzin, aż komórki osiągną zbieżność 95%-100%.</li>
</ol>
2. Kultura interfejsu powietrze-ciecz
<ol>
	<li>Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl kolagenu do wstępnie powlekanej wkładki transwell o średnicy 6,5 mm z membraną poliestrową o porach 0,4 μm (zwanych dalej wkładkami) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej odessać pożywkę ze zbiegających się komórek NHBE.</li>
	<li>Dodaj 5 ml 1x sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) za pomocą sterylnej pipety serologicznej do jednego rogu naczynia TC.</li>
	<li>Delikatnie zakręć płytką, aby umyć komórki i odessać 1x DPBS za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Upewnij się, że komórki nie wysychają na żadnym etapie protokołu.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 5 ml trypsinLE do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórek CO2 do momentu oddzielenia wszystkich komórek od dolnej powierzchni płytki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej zebrać wszystkie komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej dodaj 3 ml trypsyny do szalki TC i zbierz wszelkie pozostałe komórki.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 212 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić pożywkę i delikatnie postukać w probówkę, aby ponownie zawiesić komórki w resztkach kropli trypsyny w probówce.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej dodać 2 ml kompletnej pożywki AEC do zawieszonych komórek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemacytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki kompletną pożywką AEC, przy czym każda wkładka otrzymuje 5 x 104 komórki w objętości 200 μl.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś wkładki do pustego dołka w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>Za pomocą pipety P1000 dodać 500 μl kompletnego podłoża AEC do podstawowego dołka płytki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś wkładki z powrotem do studzienki podstawowej z dodatkiem kompletnego podłoża AEC.</li>
	<li>Za pomocą pipety P200 dodać 5 x 104 ponownie zawieszone komórki NHBE w 200 μl kompletnego podłoża AEC na wierzchołkową stronę wkładki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 o wilgotności 85% - 95%.</li>
	<li>Po 24 godzinach obserwuj komórki pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy utworzyły zlewającą się warstwę w studzience. 
	UWAGA: Jeśli komórki nie tworzą zlewającej się warstwy, zmieniaj podstawowe podłoże AEC co 48 godzin na świeże, kompletne podłoże AEC, aż komórki utworzą zlewającą się monowarstwę. Zmieniając podłoże podstawowe, przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Odessać starą pożywkę za pomocą pipety P1000, dodać świeżą pożywkę i umieścić wkładki z powrotem w świeżej, kompletnej pożywce AEC.</li>
	<li>Gdy komórki się zlewają, przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczyków. Za pomocą pipety P1000 odessać całe podstawowe podłoże AEC.</li>
	<li>Za pomocą pipety P1000 dodać 500 μl świeżej, kompletnej pożywki do różnicowania międzyfazowego powietrze-ciecz (ALI) uzupełnionej 2% (v/v) penicyliny-streptomycyny i 1% (v/v) amfoterycyny B do studzienki podstawowej. </li>
	<li>Przenieść wkładki do studzienki podstawowej z dodatkiem kompletnego podłoża ALI za pomocą sterylnych kleszczy. Za pomocą pipety P200 delikatnie odessać wierzchołkowe medium AEC ze studzienki. 
	UWAGA: Strona wierzchołkowa nie powinna być dodawana z kompletnym podłożem ALI. Ostrożnie zasysaj pożywkę AEC od strony wierzchołkowej, aby uniknąć oderwania komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowychCO2. Po 48 godzinach przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczyków.</li>
	<li>Za pomocą pipety P1000 odessać starą pożywkę i dodać świeże 500 μl kompletnej pożywki ALI.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wkładki z powrotem w studzience ze świeżym podłożem. Zmieniaj kompletną pożywkę ALI co 48 godzin do 28 dnia (cztery tygodnie).</li>
	<li>W 28 dniu, używając pipety P200, dodać 100 μl 1x DPBS do wierzchołkowej strony wkładek i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 przez 30 minut. Odessać 1x DPBS za pomocą pipety P200. 
	UWAGA: DPBS należy dodawać poprzez wylewanie na ścianę, a nie bezpośrednio do komórek. Podczas zasysania DPBS należy unikać dotykania nabłonka i energicznego pipetowania, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie nabłonka może zagrozić integralności nabłonka (tkankopodobnego).</li>
	<li>Od 2 tygodnia różnicowania oceń produkcję śluzu, obserwując pod mikroskopem możliwą ciemniejszą warstwę spowodowaną śluzem na nabłonku. Nadmiar śluzu można usunąć poprzez mycie DPBS. Na krótko dodać 200 μl 1x DPBS po wierzchołkowej stronie wkładek na 24-dołkowej płytce i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 przez 30 minut. Wyjąć DPBS i przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowychCO2</li>.
</ol>
3. Określenie częstotliwości dudnienia rzęsek
UWAGA: Do oznaczania CBF w temperaturze 37 °C (jeśli to konieczne), mikroskop musi być wyposażony w inkubator z komorą środowiskową dostarczający 5%CO2 w temperaturze 37 °C i wilgotności.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop z dołączonym komputerem i komorą środowiskową. Otwórz drzwiczki komory, aby umieścić płytkę zawierającą wkładki na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Po umieszczeniu płytki na stoliku zamknij komorę. Za pomocą pokrętła obsługi stolika mikroskopu przesuń płytkę, aby umieścić wkładki w polu widzenia.</li>
	<li>Wybierz obiektyw z 20-krotnym powiększeniem w trybie kontrastu fazowego. Obserwuj płytkę przez okular mikroskopu i ustaw ostrość komórki za pomocą pokrętła strojenia.</li>
	<li>Na ekranie komputera kliknij ikonę systemu SAVA. Program SAVA powinien być zainstalowany na komputerze podłączonym do mikroskopu.</li>
	<li>W interfejsie oprogramowania kliknij Konfiguruj eksperyment. Na następnej karcie kliknij Utwórz eksperyment.</li>
	<li>Pojawi się nowa karta, podaj szczegóły katalogu, w którym dane będą przechowywane w Wprowadź nazwę katalogu eksperymentu i szczegóły eksperymentu w Wprowadź opis eksperymentu, a następnie kliknij OK.</li>
	<li>Kliknij Eksperyment, który został utworzony i jest wyświetlany w katalogu w sekcji Eksperymenty.</li>
	<li>Kliknij Modyfikuj i podaj szczegóły próbki w przykładowym opisie. Kliknij Dodaj, a następnie Wyjdź, aby wyjść z tej karty.</li>
	<li>W głównym interfejsie oprogramowania w gnieździe eksperymentu wybierz utworzony eksperyment z menu rozwijanego w interfejsie głównym.</li>
	<li>Kliknij Nagraj wideo i monitoruj częstotliwość dudnienia rzęsek (CBF) na ekranie komputera. Na ekranie pojawi się skoncentrowany ruch rzęsek.</li>
	<li>Dla każdej wstawki nagraj 6 różnych losowych pól przez 2,1 s przy 120 klatkach na sekundę. Kliknij Zapisz wideo, aby monitorować dane CBF.</li>
	<li>Aby przeanalizować dane, kliknij opcję Analizuj wideo w interfejsie oprogramowania. Na następnej karcie kliknij OK.</li>
	<li>Na następnej karcie kliknij Analizuj wszystko. Pobierz arkusz kalkulacyjny wygenerowany dla każdego eksperymentu w folderze akwizycji danych SAVA na komputerze.</li>
	<li>Do prezentacji danych należy przyjąć średnią częstości Gaussa.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja transepitelowego oporu elektrycznego
UWAGA: Kwantyfikacja TEER wymaga płynu po wierzchołkowej stronie nabłonka dróg oddechowych. Aby ustalić ten protokół, dodaj 100 μL 1x DPBS po wierzchołkowej stronie nabłonka dróg oddechowych w wkładkach, które już zawierają podłoże podstawowe (eksperymentalne) lub 500 μL 1x DPBS.
<ol>
	<li>Włącz omomierz EVOM2 V za pomocą wyłącznika zasilania. Podłącz rezystor testowy do EVOM2 w gnieździe INPUT.</li>
	<li>Monitoruj odczyt na ekranie EVOM2. Jeśli jest powyżej lub poniżej 1000, wymaga kalibracji. Za pomocą kleszczy przekręć przełącznik ADJ na omomierzu EVOM2 volt, aż pokaże jednolity odczyt 1000.</li>
	<li>Weź pustą wkładkę do eksperymentalnego odczytu kontrolnego. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl 1x DPBS po wierzchołkowej stronie pustej wkładki, a 500 μl 1x DPBS dodaje się po stronie podstawowej za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Odłącz rezystor testowy i podłącz elektrodę STX2 do gniazda INPUT w EVOM2. Delikatnie wyczyść elektrodę STX2 70% etanolem.</li>
	<li>Włóż elektrodę STX2 do pustej wkładki z 1x DPBS, trzymając krótszą nogę elektrody na wierzchołkowej części każdej wkładki, a dłuższą nogę elektrody na części podstawnej.</li>
	<li>Zapisz stabilny odczyt na ekranie EVOM2, ponieważ odczyt może się zmieniać z powodu ruchu lub innych nieokreślonych powodów.</li>
	<li>Wprowadzić elektrodę STX2 do wkładki z 28-dniowym zróżnicowanym nabłonkiem, utrzymując krótszą nogę elektrody na wierzchołkowej części każdej wkładki, a dłuższą nogę elektrody na części podstawowej w podłożu.</li>
	<li>Nagraj stabilny odczyt na ekranie EVOM2. Wykonaj kilka niezależnych odczytów, aby obliczyć wiarygodną średnią. Odejmij tło (pusty odczyt wkładki) od eksperymentalnego odczytu wkładki w celu obliczenia.</li>
</ol>

Assessing Biophysical Properties of Differentiated Airway Epithelium 

<ol><li>GBDCRD Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+chronic+respiratory+diseases+and+risk+factors%2C+1990-2019%3A+an+update+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22E+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> E Clin Med. 59, 101936(2023).</li>
<li>Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+burden+of+non-influenza-related+viral+respiratory+tract+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The economic burden of non-influenza-related viral respiratory tract infection in the United States.</a> Arch Intern Med. 163 (4), 487-494 (2003).</li>
<li>LeMessurier, K. S., Tiwary, M., Morin, N. P., Samarasinghe, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+barrier+as+a+safeguard+and+regulator+of+defense+against+Influenza+A+virus+and+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Respiratory barrier as a safeguard and regulator of defense against Influenza A virus and Streptococcus pneumoniae.</a> Front Immunol. 11, 3(2020).</li>
<li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li>
<li>Calven, J., Ax, E., Radinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium-A+central+player+in+Asthma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium-A central player in Asthma pathogenesis.</a> Int J Mol Sci. 21 (23), 8907(2020).</li>
<li>Talukdar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSV-induced+expanded+ciliated+cells+contribute+to+bronchial+wall+thickening%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">RSV-induced expanded ciliated cells contribute to bronchial wall thickening.</a> Virus Res. 327, 199060(2023).</li>
<li>Osan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cell+hyperplasia+increases+SARS-CoV-2+infection+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Goblet cell hyperplasia increases SARS-CoV-2 infection in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Microbiol Spectr. 10 (4), e0045922(2022).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia and mucociliary clearance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (4), a028241(2017).</li>
<li>Rhee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+frequency+in+cultured+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat frequency in cultured human nasal epithelial cells.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 110 (11), 1011-1016 (2001).</li>
<li>Scopulovic, L., Francis, D., Pandzic, E., Francis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cilia+beat+frequency+using+high-speed+video+microscopy%3A+Assessing+frame+rate+requirements+when+imaging+different+ciliated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantifying cilia beat frequency using high-speed video microscopy: Assessing frame rate requirements when imaging different ciliated tissues.</a> Physiol Rep. 10 (11), e15349(2022).</li>
<li>Jing, J. C., Chen, J. J., Chou, L., Wong, B. J. F., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+detection+of+ciliary+beating+pattern+and+frequency+in+the+upper+airway+using+phase+resolved+Doppler+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualization and detection of ciliary beating pattern and frequency in the upper airway using phase resolved Doppler optical coherence tomography.</a> Sci Rep. 7 (1), 8522(2017).</li>
<li>Yuksel, H., Turkeli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+barrier+dysfunction+in+the+pathogenesis+and+prognosis+of+respiratory+tract+diseases+in+childhood+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial barrier dysfunction in the pathogenesis and prognosis of respiratory tract diseases in childhood and adulthood.</a> Tissue Barriers. 5 (4), e1367458(2017).</li>
<li>Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Normal+Human+Bronchial+Epithelial+%28NHBE%29+Cell+3D+Cultures+for+in+vitro+Lung+Model+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) Cell 3D Cultures for in vitro Lung Model Studies.</a> Sci Rep. 9 (1), 500(2019).</li>
<li>Osan, J. K., DeMontigny, B. A., Mehedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+protein+detection+in+PFA-fixed+paraffin-embedded+SARS-CoV-2-infected+COPD+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for protein detection in PFA-fixed paraffin-embedded SARS-CoV-2-infected COPD airway epithelium.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100663(2021).</li>
<li>Talukdar, S. N., McGregor, B., Osan, J. K., Hur, J., Mehedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+Does+Not+Induce+Epithelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Respiratory Syncytial Virus Infection Does Not Induce Epithelial-Mesenchymal Transition.</a> J Virol. 97 (7), e0039423(2023).</li>
<li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Front Pediatr. 2, 111(2014).</li>
<li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ciliaFA%3A+a+research+tool+for+automated%2C+high-throughput+measurement+of+ciliary+beat+frequency+using+freely+available+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software.</a> Cilia. 1, 14(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Ludzki pierwotny nabłonek dróg oddechowych (hodowla ALI) jest coraz częściej wykorzystywany jako model płuc in vitro do ocen biologicznych w celu zbadania funkcji i mechanizmów oraz ograniczenia stosowania przez zwierzęta14. ALI ma kilka zalet w porównaniu z jakąkolwiek monowarstwową kulturą zanurzoną. Na przykład zapewnia podobny do tkanki pseudostratyfikowany nabłonek dróg oddechowych, który naśladuje wierzchołkową stronę dróg oddechowych płuc <sup class="xref"...

Przewlekłe choroby układu oddechowego, takie jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) i mukowiscydoza, są jednymi z głównych problemów zdrowotnych na całym świecie1. Rozpowszechnienie chorób układu oddechowego wywoływanych przez wirusy, takie jak wirus grypy A u ludzi, syncytialny wirus oddechowy (RSV) i koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) również powoduje obciążenia ekonomiczne i zdrowotne2. Dlatego istnieje ogromna potrzeba opracowania schematów leczenia chorób układu oddechowego, które prowadzą do nieodwracalnego uszkodzenia tkanek układu oddechowego. Sama tkanka nabłonka oddechowego jest nie tylko zaangażowana w pobieranie tlenu, ale także stanowi barierę chroniącą organizm przed atakującymi patogenami i niebezpiecznymi chemikaliami3. Nabłonek oddechowy ma złożoną organizację komórkową składającą się z trzech głównych typów komórek: komórek rzęskowych, komórek kubkowych i komórek podstawnych. Niedawno pojawił się raport o obecności nowych, ale rzadkich komórek jonocytów w nabłonku dróg oddechowych4. Złożona tkanka funkcjonuje w skoordynowany sposób, aby zapewnić wrodzone odpowiedzi immunologiczne, takie jak wydzielanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych, uwalnianie cytokin w celu aktywacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i klirens śluzowo-rzęskowy 5. Brak odpowiedniego modelu dróg oddechowych jest jedną z przeszkód w badaniu infekcji dróg oddechowych i opracowywaniu metod leczenia.
Model interfejsu powietrze-ciecz (ALI) staje się kluczowym narzędziem do badań nad chorobami układu oddechowego6. Jest to skuteczny model dróg oddechowych płuc in vitro, ponieważ pierwotne komórki dróg oddechowych płuc różnicują się w pseudostratyfikowany nabłonek dróg oddechowych składający się z co najmniej trzech typów komórek, które zwykle znajdują się po wierzchołkowej stronie dróg oddechowych. Po pierwsze, komórki rzęskowe pokrywają większość wierzchołkowej strony dróg oddechowych i przyczyniają się do klirensu śluzowo-rzęskowego. Po drugie, komórki kubkowe wytwarzają śluz i są największymi komórkami, które współznajdują się z komórkami rzęskowymi po wierzchołkowej stronie dróg oddechowych. Po trzecie, komórki podstawne znajdują się w podstawowej warstwie dróg oddechowych i są komórkami progenitorowymi, które różnicują się w różne komórki nabłonkowe5,7. Chociaż jonocyty i komórki kępkowe są rzadkie w nabłonku dróg oddechowych, mogą również odgrywać rolę w funkcjonowaniu rzęsek i przepuszczalności błony4. Technika ta różni się od tradycyjnej zanurzonej hodowli komórkowej, która nie naśladuje środowiska płuc in vivo. Ponieważ ALI jest wytwarzany z pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących od zdrowych ludzi, pacjentów z astmą i POChP, oferuje bardziej zróżnicowaną platformę do badania odpowiedzi na infekcje i patofizjologię choroby.
Ocena zdrowia kultur opracowanych przez ALI jest niezbędnym aspektem do monitorowania, zapewniającym żywotność, funkcjonalność i znaczenie fizjologiczne hodowanych komórek. Zwiększa zaufanie do integralności, niezawodności i odtwarzalności kultur ALI. Jak już wcześniej opublikowano, nasza grupa oceniała integralność kultury ALI, oceniając dwa parametry biofizyczne: funkcję rzęsek poprzez ilościowe określenie częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) oraz integralność bariery nabłonkowej poprzez określenie transepitelowego oporu elektrycznego (TEER)6,7,8. Klirens śluzowo-rzęskowy (MCC) jest jedną z ważnych cech nabłonka dróg oddechowych przenoszonego przez komórki rzęskowe. Wyspecjalizowane organelle zwane rzęskami na powierzchni komórek rzęskowych biją w fale śródkrwiste, aby oczyścić drogi oddechowe z infekcji i wdychanych cząstek, które utknęły w warstwie śluzowej nabłonka dróg oddechowych. Skuteczne MCC jest całkowicie zależne od prawidłowej aktywności rzęsek9. Dobry CBF wskazuje na zdrowy, nienaruszony nabłonek dróg oddechowych; w związku z tym monitorowanie CBF dla kultur ALI dostarcza cennych informacji na temat integralności nabłonka10. Chociaż istnieje wiele sposobów ilościowego oznaczania CBF, na przykład szybka mikroskopia wideo11 i fazowo-rozdzielcza optyczna koherentna tomografia koherentna12, każda metoda wymaga specjalistycznej wiedzy technicznej i specjalistycznego sprzętu. W tym protokole zapewniamy łatwiejszy i mniej techniczny sposób ilościowego oznaczania CBF zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych. Opisaliśmy również metodę ilościowego oznaczania TEER tego samego nabłonka, która wskazuje integralność i funkcję barierową tkanek nabłonka13.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek nabłonka dróg oddechowych</td><td>PromoCell, Niemcy</td><td>C-21060</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>Omomierz EVOM2 V</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór heparyny</td><td>Technologie STEMCELL, USA</td><td>07980</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon stock</td><td>STEMCELL technologies, USA</td><td>07926</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop: Leica DMI8 (Leica Microscope) z szybką kamerą 120f/s (Basler) powiązaną z mikroskopem. Microsope mocowany również za pomocą inkubatora komorowego i8.</td><td>Leica, Stany Zjednoczone</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Corning, USA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Basal Medium&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies, USA</td><td>05002</td><td></td></tr><tr><td>PureCol</td><td>Advanced BioMatrix, USA</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>System analizy wideo (SAVA) Sissona-Ammonsa. Oprogramowanie V.2.1.15&nbsp;</td><td>Amson Engineering, Stany Zjednoczone</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway Epithelium

Różnicowanie pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych płuc na granicy powietrze-ciecz (ALI) jest popularną techniką tworzenia wielokomórkowego pseudowarstwowego nabłonka dróg oddechowych, który naśladuje wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. Podczas gdy oczekuje się różnicowania pierwotnych komórek dróg oddechowych płuc, ocena właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i nieprzepuszczalność błony, zapewnia ocenę jakości nabłonka dróg oddechowych i zapewnia wiarygodność eksperymentu. W tym miejscu opisujemy prosty protokół rozwoju wielokomórkowego pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych w hodowli ALI i oceniamy dwie ważne właściwości biofizyczne: funkcję rzęsek i nieprzepuszczalność błony. Aby określić funkcję rzęsek, uchwyciliśmy ruch rzęsek w 4-tygodniowym zróżnicowanym nabłonku dróg oddechowych za pomocą szybkiej kamery przymocowanej do odwróconego mikroskopu, a następnie określiliśmy ilościowo częstotliwość uderzeń rzęsek (CBF) za pomocą systemu Simon Amon Video Analysis (SAVA). Zmierzyliśmy również transepitelialną rezystancję elektryczną (TEER) za pomocą woltomierza-oma, aby określić integralność bariery nabłonkowej nabłonka dróg oddechowych.

Oceniono zarówno funkcję rzęsek, jak i nieprzepuszczalność błony nabłonka dróg oddechowych uzyskanego z różnicujących się pierwotnych komórek NHBE od dwóch niezależnych, zanonimizowanych dawców (dwóch niepalących, zdrowych osób dorosłych lub osób dorosłych z POChP, kobiet powyżej 50. roku życia). W celu oceny funkcji rzęsek wyznaczono CBF 28-dniowego zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych. Zaobserwowano, że CBF osiągnął wartość co najmniej 3 Hz dla obu próbek nabłonka dróg oddechowych, co było porównywalne z wcześniej ...

Kultura interfejsu powietrze-ciecz jest powszechnie stosowana do tworzenia pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli, które naśladują wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. W tym miejscu opisujemy prosty protokół określania jego jakości poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i integralność błony.

Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Differentiating primary lung airway epithelial cells in the air-liquid interface (ALI) is a popular technique to develop a multi-cellular pseudostratified ...

Nasze badania mają na celu zmierzenie dwóch krytycznych właściwości biofizycznych pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych, które można uzyskać poprzez różnicowanie normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli w granicy faz powietrze-ciecz. Zidentyfikowaliśmy różne cechy różnych wirusów układu oddechowego za pomocą pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych. Na przykład zapalenie cytoszkieletu wywołane przez syncytialny wirus oddechowy, które jest niekanonicznym mechanizmem zapalenia oskrzelików.Zidentyfikowaliśmy również, że przerost komórek kubkowych zwiększa replikację SARS-CoV-2 w przewlekłym obturacyjnym nabłonku dróg oddechowych choroby płuc. Skupiliśmy się na wyjaśnieniu mechanizmu modulacji sygnalizacji cytoszkieletowej przez syncytialny wirus oddechowy w celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych do zwalczania infekcji RSV i zapalenia oskrzelików wywołanego przez wirusa. Na początek weź normalną zawiesinę komórek ludzkiego nabłonka oskrzeli lub NHBE.Za pomocą pipety P200 dodaj 50 000 ponownie zawieszonych komórek w 200 mikrolitrach kompletnej komórki nabłonka dróg oddechowych lub AEC, pożywki po wierzchołkowej stronie wkładki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych z dwutlenkiem węgla nawilżonym od 85% do 95%. Gdy komórki się zlewają, przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy.Za pomocą pipety P1000 odessać całe podstawowe podłoże AEC. Następnie dodać 500 mikrolitrów świeżej pożywki do pełnego różnicowania ALI uzupełnionej 2% penicyliną-streptomycyną i 1% amfoterycyną B do studzienki podstawowej. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś wkładki do studzienki podstawowej z dodanym kompletnym podłożem ALI.Za pomocą pipety P200 delikatnie odessać wierzchołkowe podłoże AEC ze studzienki i przeprowadzić jego inkubację. Po 48 godzinach przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Za pomocą pipety P1000 odessać starą pożywkę i dodać 500 mikrolitrów świeżej, kompletnej pożywki ALI.Umieść wkładki z powrotem w studzience ze świeżą pożywką za pomocą sterylnych kleszczy. W 26 dniu, za pomocą pipety P200, dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę wkładek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut.Następnie odessać DPBS za pomocą pipety P200. Aby rozpocząć, włącz mikroskop, dołączony komputer i komorę środowiskową. Otwórz drzwi komory i umieść płytkę zawierającą wkładki z komórkami NBHE na stoliku mikroskopu.Gdy płyta znajdzie się na scenie, zamknij komorę. Następnie użyj pokrętła operacyjnego stolika mikroskopu, aby przesunąć płytkę i umieścić wkładki w polu widzenia. Na ekranie komputera kliknij ikonę systemu SAVA, aby otworzyć program SAVA.W interfejsie oprogramowania kliknij Konfiguruj eksperyment. W następnej zakładce kliknij Utwórz eksperyment. Następnie w nowej karcie wprowadź katalog, w którym będą przechowywane dane w polu Enter Experiment Directory Name i podaj szczegóły w polu Enter Experiment Description, a następnie kliknij przycisk OK. Teraz kliknij eksperyment, który został utworzony i jest wyświetlany w katalogu w sekcji Eksperymenty.Następnie kliknij Modyfikuj i podaj przykładowe szczegóły w polu Przykładowy opis. Kliknij przycisk Dodaj, a następnie kliknij przycisk Zakończ, aby opuścić kartę. W głównym interfejsie oprogramowania wybierz utworzony eksperyment z menu rozwijanego w gnieździe Eksperyment.Następnie kliknij Nagraj wideo, aby monitorować częstotliwość dudnień rzęsek na ekranie komputera. Na ekranie pojawi się skoncentrowany ruch rzęsek. Dla każdej wstawki nagraj sześć różnych losowych pól przez 2,1 sekundy przy 120 klatkach na sekundę.Kliknij Zapisz wideo, aby monitorować dane dotyczące częstotliwości uderzeń rzęsek. Aby przeanalizować dane, kliknij Analizuj wideo w interfejsie oprogramowania. A na następnej karcie kliknij OK. Następnie przejdź do następującej zakładki i kliknij Analizuj wszystko.Pobierz arkusz kalkulacyjny wygenerowany dla każdego eksperymentu z folderu SAVA Data Acquisition na komputerze. Weźmy średnią częstotliwość Gaussa do prezentacji danych. Częstotliwość dudnienia rzęsek osiągnęła co najmniej trzy herce zarówno dla nabłonka dróg oddechowych u zdrowych osób dorosłych, jak i osób z POChP, wykazując porównywalną funkcję rzęsek.Aby rozpocząć, włącz omomierz EVOM2 za pomocą wyłącznika zasilania. Podłącz rezystor testowy do EVOM2 w gnieździe wejściowym. Monitoruj odczyt na ekranie EVOM2.Jeśli odczyt jest wyższy lub niższy niż 1 000, przekręć przełącznik ADJ na EVOM2 za pomocą kleszczy, aż pokaże jednolity odczyt 1 000, aby skalibrować urządzenie. Teraz weź pustą wkładkę do eksperymentalnego odczytu kontrolnego. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę pustej wkładki.Następnie dodaj 500 mikrolitrów DPBS po stronie podstawowej za pomocą pipety P1000. Następnie odłącz rezystor testowy i podłącz elektrodę STX2 do gniazda wejściowego w EVOM2. Następnie delikatnie wyczyść elektrodę STX2 70% etanolem.Włóż elektrodę STX2 do pustej wkładki z DPBS, trzymając krótszą nogę elektrody na części wierzchołkowej, a dłuższą nogę elektrody na części podstawnej. Teraz nagraj stabilny odczyt na ekranie EVOM2. Następnie za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę wkładki.Włóż elektrodę STX2 do wkładki z 26-dniowym zróżnicowanym nabłonkiem dróg oddechowych, jak pokazano wcześniej. Następnie nagraj stabilny odczyt na ekranie EVOM2. Wartości przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej wzrosły u dorosłych z POChP, co wskazuje na zwiększoną nieprzepuszczalność błony w POChP.

determining-ciliary-function-membrane-impermeability-pseudostratified

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

W tej publikacji opisujemy protokoły oceny klirensu śluzowo-rzęskowego dróg oddechowych (MCC) u myszy in vivo z wykorzystaniem obrazowania radionuklidów o podwójnej modalności. Protokół ten jest przeznaczony do tomografii komputerowej z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) i protokołu akwizycji tomografii komputerowej (CT) przy użyciu mysich kolimatorów całego ciała (MWB) w podwójnym systemie SPECT/CT.

Ocena in vivo klirensu śluzowo-rzęskowego u myszy

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania produkcji tlenku azotu (NO) w kulturach nabłonka dróg oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-ciecz (ALI) poprzez pomiar azotynów w sekretach wierzchołkowych za pomocą testu chemiluminescencyjnego opartego na trijodku.

Ocena produkcji tlenku azotu w kulturach ludzkich komórek nabłonkowych przewodów oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-płyn

Oznaczanie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. W tym filmie demonstrujemy sposób zliczania komórek przy użyciu hemacytometru.

Liczenie i określanie żywotności hodowli komórkowych

Poznaj metodę oceny funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony nabłonka dróg oddechowych przy użyciu ludzkich komórek NHBE w kulturze ALI. Technika ta umożliwia badanie infekcji wirusowych układu oddechowego.

Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Przeglądaj więcej filmów