Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Nasze badania mają na celu zmierzenie dwóch krytycznych właściwości biofizycznych pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych, które można uzyskać poprzez różnicowanie normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli w granicy faz powietrze-ciecz. Zidentyfikowaliśmy różne cechy różnych wirusów układu oddechowego za pomocą pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych. Na przykład zapalenie cytoszkieletu wywołane przez syncytialny wirus oddechowy, które jest niekanonicznym mechanizmem zapalenia oskrzelików.

Zidentyfikowaliśmy również, że przerost komórek kubkowych zwiększa replikację SARS-CoV-2 w przewlekłym obturacyjnym nabłonku dróg oddechowych choroby płuc. Skupiliśmy się na wyjaśnieniu mechanizmu modulacji sygnalizacji cytoszkieletowej przez syncytialny wirus oddechowy w celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych do zwalczania infekcji RSV i zapalenia oskrzelików wywołanego przez wirusa. Na początek weź normalną zawiesinę komórek ludzkiego nabłonka oskrzeli lub NHBE.

Za pomocą pipety P200 dodaj 50 000 ponownie zawieszonych komórek w 200 mikrolitrach kompletnej komórki nabłonka dróg oddechowych lub AEC, pożywki po wierzchołkowej stronie wkładki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych z dwutlenkiem węgla nawilżonym od 85% do 95%. Gdy komórki się zlewają, przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy.

Za pomocą pipety P1000 odessać całe podstawowe podłoże AEC. Następnie dodać 500 mikrolitrów świeżej pożywki do pełnego różnicowania ALI uzupełnionej 2% penicyliną-streptomycyną i 1% amfoterycyną B do studzienki podstawowej. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś wkładki do studzienki podstawowej z dodanym kompletnym podłożem ALI.

Za pomocą pipety P200 delikatnie odessać wierzchołkowe podłoże AEC ze studzienki i przeprowadzić jego inkubację. Po 48 godzinach przenieś wkładki do pustej studzienki za pomocą sterylnych kleszczy. Za pomocą pipety P1000 odessać starą pożywkę i dodać 500 mikrolitrów świeżej, kompletnej pożywki ALI.

Umieść wkładki z powrotem w studzience ze świeżą pożywką za pomocą sterylnych kleszczy. W 26 dniu, za pomocą pipety P200, dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę wkładek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut.

Następnie odessać DPBS za pomocą pipety P200. Aby rozpocząć, włącz mikroskop, dołączony komputer i komorę środowiskową. Otwórz drzwi komory i umieść płytkę zawierającą wkładki z komórkami NBHE na stoliku mikroskopu.

Gdy płyta znajdzie się na scenie, zamknij komorę. Następnie użyj pokrętła operacyjnego stolika mikroskopu, aby przesunąć płytkę i umieścić wkładki w polu widzenia. Na ekranie komputera kliknij ikonę systemu SAVA, aby otworzyć program SAVA.

W interfejsie oprogramowania kliknij Konfiguruj eksperyment. W następnej zakładce kliknij Utwórz eksperyment. Następnie w nowej karcie wprowadź katalog, w którym będą przechowywane dane w polu Enter Experiment Directory Name i podaj szczegóły w polu Enter Experiment Description, a następnie kliknij przycisk OK. Teraz kliknij eksperyment, który został utworzony i jest wyświetlany w katalogu w sekcji Eksperymenty.

Następnie kliknij Modyfikuj i podaj przykładowe szczegóły w polu Przykładowy opis. Kliknij przycisk Dodaj, a następnie kliknij przycisk Zakończ, aby opuścić kartę. W głównym interfejsie oprogramowania wybierz utworzony eksperyment z menu rozwijanego w gnieździe Eksperyment.

Następnie kliknij Nagraj wideo, aby monitorować częstotliwość dudnień rzęsek na ekranie komputera. Na ekranie pojawi się skoncentrowany ruch rzęsek. Dla każdej wstawki nagraj sześć różnych losowych pól przez 2,1 sekundy przy 120 klatkach na sekundę.

Kliknij Zapisz wideo, aby monitorować dane dotyczące częstotliwości uderzeń rzęsek. Aby przeanalizować dane, kliknij Analizuj wideo w interfejsie oprogramowania. A na następnej karcie kliknij OK. Następnie przejdź do następującej zakładki i kliknij Analizuj wszystko.

Pobierz arkusz kalkulacyjny wygenerowany dla każdego eksperymentu z folderu SAVA Data Acquisition na komputerze. Weźmy średnią częstotliwość Gaussa do prezentacji danych. Częstotliwość dudnienia rzęsek osiągnęła co najmniej trzy herce zarówno dla nabłonka dróg oddechowych u zdrowych osób dorosłych, jak i osób z POChP, wykazując porównywalną funkcję rzęsek.

Aby rozpocząć, włącz omomierz EVOM2 za pomocą wyłącznika zasilania. Podłącz rezystor testowy do EVOM2 w gnieździe wejściowym. Monitoruj odczyt na ekranie EVOM2.

Jeśli odczyt jest wyższy lub niższy niż 1 000, przekręć przełącznik ADJ na EVOM2 za pomocą kleszczy, aż pokaże jednolity odczyt 1 000, aby skalibrować urządzenie. Teraz weź pustą wkładkę do eksperymentalnego odczytu kontrolnego. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę pustej wkładki.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów DPBS po stronie podstawowej za pomocą pipety P1000. Następnie odłącz rezystor testowy i podłącz elektrodę STX2 do gniazda wejściowego w EVOM2. Następnie delikatnie wyczyść elektrodę STX2 70% etanolem.

Włóż elektrodę STX2 do pustej wkładki z DPBS, trzymając krótszą nogę elektrody na części wierzchołkowej, a dłuższą nogę elektrody na części podstawnej. Teraz nagraj stabilny odczyt na ekranie EVOM2. Następnie za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów DPBS na wierzchołkową stronę wkładki.

Włóż elektrodę STX2 do wkładki z 26-dniowym zróżnicowanym nabłonkiem dróg oddechowych, jak pokazano wcześniej. Następnie nagraj stabilny odczyt na ekranie EVOM2. Wartości przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej wzrosły u dorosłych z POChP, co wskazuje na zwiększoną nieprzepuszczalność błony w POChP.