Name: Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek nabłonka oskrzeli z tkanki płucnej do biobankowania i hodowli granicy faz powietrze-ciecz. Technika umożliwia badanie funkcji nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania wykorzystujące model opisany w tym artykule były wspierane przez różne organizacje finansujące, w tym Lung Foundation Netherlands, Holenderską Organizację Badań i Rozwoju Zdrowia (ZonMw, COVID-19 MKMD grant), Holenderskie Towarzystwo Wymiany Testów na Zwierzętach (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), a także granty badawcze od firm takich jak Boehringer Ingelheim i Galapagos. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Autorzy oświadczają, że nie występują u nich istotne konflikty interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje izolację ludzkich komórek nabłonkowych oskrzeli z wyresekowanej tkanki płucnej, metodę optymalnej ekspansji komórek bez utraty potencjału różnicowania, procedurę kriokonserwacji oraz procedurę generowania dobrze zróżnicowanych kultur ALI-PBEC. Ponadto zamieszczono opis kontroli jakości, a także instrukcje monitorowania i oceny zróżnicowanych komórek ALI-PBEC.
Opisany protokół rozpoczyna się od makroskopowo prawidłowego, wolnego od nowotworu pierścienia oskrzeli, wyciśniętego z płata płuca pacjentów poddawanych operacji w związku z diagnozą raka płuca. Należy zatem zaznaczyć, że pierścienie te nie mogą być ściśle uznane za tkankę zdrową, co może wpływać na charakterystykę hodowli komórkowych. Alternatywne źródła pozyskiwania komórek nabłonka oskrzeli obejmują wykorzystanie biopsji oskrzeli, szczoteczkowania oskrzeli lub tkanek od dawców transplantacyjnych lub z płuc biorców. Niezależnie od źródła, przy użyciu tkanki płucnej należy brać pod uwagę ryzyko kontaminacji mikrobiologicznej, dlatego w różnych pożywkach stosuje się antybiotyki, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego hodowli komórkowych. W szczególności mycoplasma stanowi wysokie i częste ryzyko w hodowlach komórkowych ze względu na szeroki wachlarz oddziaływań na hodowlę, oporność na antybiotyki powszechnie stosowane w kulturach komórkowych oraz fakt, że kontaminację mycoplasma można potwierdzić jedynie za pomocą testów detekcji mycoplasma. Dlatego w początkowej fazie hodowli komórkowej, po izolacji komórek z tkanki płucnej, stosuje się przeciwmikrobowy preparat o szerokim spektrum Primocin, a w trakcie procesu hodowli losowo wybrane próbki są badane pod kątem obecności mycoplasma.
Procedura izolacji rozpoczynająca się od pierścienia oskrzelowego dostarcza wystarczającego materiału wyjściowego, aby stopień ekspansji tych komórek pierwotnych, niezbędny do rozpoczęcia hodowli w warunkach ALI, nie upośledzał zdolności do różnicowania. Jednakże rozpoczęcie ekspansji izolowanych komórek nabłonkowych z ograniczoną liczbą komórek może stwarzać problemy z uzyskaniem wystarczającej liczby insertów z odpowiednią ilością komórek, które można zasiać do hodowli ALI. Przedłużona hodowla i wielokrotne pasażowanie komórek pierwotnych mogą prowadzić do senescencji replikacyjnej. W celu przezwyciężenia tego ograniczenia zaproponowano różne rozwiązania. Horani i wsp. wykazali, że inhibitor kinazy Rho (ROCK) Y-27632 zwiększa proliferację komórek podstawnych30, Mou i wsp. zastosowali podwójną inhibicję Smad w celu ekspansji macierzystych komórek podstawnych przy zachowaniu charakterystyki zróżnicowanej warstwy komórek nabłonkowych31, a Sachs i wsp. opracowali system organoidów dróg oddechowych, który może być wykorzystany do ekspansji komórek nabłonkowych dróg oddechowych i zachowania ich potencjału różnicowania w trakcie wielu pasażowań32. Tę ostatnią metodę stosowano również do ekspansji komórek z materiałów o bardzo niskiej liczbie komórek, takich jak aspiraty z tchawicy (TAs) od wcześniaków (&lt;28. tydzień wieku poczęciowego) i płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), przed przeniesieniem do hodowli ALI opisanej w niniejszym protokole33. Stwierdzono, że komórki izolowane z BAL i TAs wykazywały zdolność do różnicowania podobną do komórek uzyskanych z tkanki oskrzelowej, choć zaobserwowano różnice, gdy różnicowanie było przesunięte w stronę kultur z większą liczbą komórek rzęsistych lub komórek kubkowych przy użyciu inhibicji sygnalizacji Notch lub cytokiny Th2 IL-1333. Zaleca się zatem, aby w przypadku hodowania ALI-PBECs z materiału wyjściowego o niskiej liczbie komórek nabłonkowych przy użyciu podobnych podejść, zawsze sprawdzać kultury pod kątem podstawowych kryteriów jakości opisanych w sekcji 6 protokołu. Co ważne, zastosowanie komórek zasilających może również pomóc w uzyskaniu większej liczby komórek, co jest kluczowe w kontekście inżynierii rusztowań do transplantacji, gdzie czas i liczba komórek są istotne. Ilustruje to badanie, w którym autologiczne komórki nabłonkowe hodowano z biopsji pobranych od pacjenta z chorobą tchawicy, a komórki szybko powielano w obecności mysiej embrionalnej warstwy zasilającej (mitotycznie inaktywowanych fibroblastów 3T3-J2) oraz wspomnianego wcześniej inhibitora szlaku Rho/ROCK (Y-27632)34. Stwierdzono, że otrzymana hodowla komórkowa była użyteczna do repopulacji rusztowań tchawiczych, co sprawia, że można ją uznać za odpowiedni protokół dla modelu transplantacyjnego.
Podczas stosowania protokołu opisanego w niniejszym opracowaniu, a także przy korzystaniu z innych protokołów hodowli, nieuchronnie wprowadza się błąd selekcji. Należy zdać sobie sprawę, że różnice w szczegółach protokołu, takie jak pochodzenie komórek użytych do zainicjowania hodowli, skład pożywki oraz inne detale metodyczne, mogą prowadzić do zmian w składzie komórkowym hodowli, a tym samym do zmian w odpowiedzi hodowli ALI33,35. Ponadto zaobserwowano różnice we właściwościach komórek podczas porównywania różnych pożywek do różnicowania komórek dróg oddechowych10,11. Przy porównaniu pożywki PneumaCult i cBD odnotowano różnice w markerach mRNA komórek kubkowych i komórek Club, wartościach TEER oraz grubości warstwy komórkowej. Na podstawie tych obserwacji, pomimo braku podstaw statystycznych wynikającego z niskiej liczby wykorzystanych dawców, nieznajomości składu pożywki dla klientów oraz wyższych kosztów pożywki PneumaCult, w naszym laboratorium podjęto decyzję o zastosowaniu pożywki cBD.
Jak wspomniano, komórki można początkowo namnażać w hodowli organoidów, a następnie przenieść do 2D systemu wkładkowego ALI. Jest to istotne, ponieważ organoidy nabłonka dróg oddechowych nie nadają się do ekspozycji na substancje przenoszone drogą powietrzną, podczas gdy zastosowanie systemu 2D ALI umożliwia ocenę wpływu takich substancji jak dym papierosowy23,36 na hodowane komórki nabłonka dróg oddechowych. Innym podejściem do tworzenia hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych w systemie ALI jest generowanie tych komórek poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs)37. W takich protokołach, na końcowym etapie różnicowania, po uzyskaniu progenitorów proksymalnych dróg oddechowych, komórki mogą być różnicowane w hodowli ALI przy użyciu procedur podobnych do opisanych w niniejszej pracy.
W niniejszym protokole do hodowli w warunkach ALI stosowane jest pożywka cBD. Pożywka cBD to medium bezsurowicze, przygotowywane poprzez dodanie mieszaniny różnych suplementów, opracowanej na podstawie prac Fulcher i wsp.38 oraz innych badań. Roztwór suplementów zawiera 52 µg/mL ekstraktu z przysadki wołowej (BPE), 0,5 µg/mL hydrokortyzonu, 0,5 ng/mL ludzkiego EGF, 0,5 µg/mL epinefryny, 10 µg/mL transferyny, 5 µg/mL insuliny, 6,5 ng/mL trijodotyroniny oraz 0,1 ng/mL RA39. Ponieważ BPE jest ekstraktem tkankowym i charakteryzuje się zmiennością między partiami, pożywka ta nie może być uznana za medium w pełni zdefiniowane ani za wolne od składników pochodzenia zwierzęcego. W celu zminimalizowania różnic między partiami preferowane są pożywki do hodowli komórkowej w pełni zdefiniowane. W związku z przejściem na badania bez użycia produktów zwierzęcych, istotne jest podejmowanie wysiłków w celu opracowania zdefiniowanych pożywek, które nie zawierają produktów odzwierzęcych i są przystępne cenowo dla społeczności naukowej.
W zależności od pytania badawczego można zastosować różne układy eksperymentalne oparte na modelu ALI. Na przykład, aby zbadać wpływ związków, które mogą oddziaływać na proces różnicowania, można dodać te związki do hodowli na różnych etapach hodowli zanurzeniowej, podczas różnicowania lub na etapie pełnego zróżnicowania. Skład komórkowy hodowli ALI-PBEC może być modyfikowany poprzez dodawanie określonych związków; na przykład różnicowanie ALI-PBEC w obecności IL-13 prowadzi do powstania hodowli z większą liczbą komórek kubkowych i mniejszą liczbą komórek rzęskowych, natomiast zastosowanie inhibitora γ-sekretazy DAPT (stosowanego do blokowania sygnalizacji Notch) podczas różnicowania skutkuje hodowlą z większą liczbą komórek rzęskowych kosztem komórek kubkowych23,40,41,42.
Ponadto substancje stymulujące komórki lub blokujące określone procesy można aplikować albo do komory podstawnej, albo (w bardzo małej objętości) do komory szczytowej hodowli. Komórki mogą być również eksponowane na substancje przenoszone drogą powietrzną od strony szczytowej. Takie schematy ekspozycji stosowano w celu zbadania wpływu spalin diesla lub całego dymu papierosowego na PBECs23,43,44. Pożywkę można zbierać przy każdej zmianie medium, aby monitorować białka wydzielane po stronie podstawnej; to samo dotyczy strony szczytowej komórek, którą przemywa się PBS podczas odświeżania pożywki podstawnej. Tak zwany płukanie szczytowe (apical wash) jest zbierane, a opcjonalnie dodaje się ditionerytrytol (DTE), aby skuteczniej rozbić śluz produkowany przez komórki kubkowe. Lizaty komórkowe można uzyskać w celu izolacji całkowitego białka, RNA oraz chromosomalnego i mitochondrialnego DNA. Komórki można dalej badać przy użyciu przeciwciał przeciwko specyficznym markerom, wycinając membranę z politereftalanu etylenu (PET) z plastikowego insertu, a następnie dzieląc tę membranę na mniejsze kawałki do wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego45. Ponadto po trypsynizacji komórek w insertach można zastosować cytometrię przepływową lub FACS. W fazie ALI rozwój bariery komórkowej można monitorować, mierząc oporność elektryczną i obliczając na tej podstawie TEER, gdzie oporność elektryczna jest odwrotnie proporcjonalna do powierzchni wkładki membranowej. Obliczenia opierają się na prawie Ohma przy użyciu następującego wzoru: <img alt="Obliczanie TEER: wzór na transepithelialną oporność elektryczną, równania naukowe." src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">, gdzie Rm to zmierzona oporność elektryczna, Rb to bazowa oporność elektryczna insertu bez powłoki i komórek, a SA to powierzchnia membrany insertu. Pomiar oporności elektrycznej przy użyciu EVOM2 i elektrod STX/chopstick jest prosty, ale w dużym stopniu zależy od procedur postępowania podczas wprowadzania elektrody do dołka. Sugerowano również, że kształt elektrody może wpływać na pomiar funkcji bariery w przypadku stosunkowo dużej powierzchni17.
Dalsze ulepszenia systemu hodowli komórkowych ALI, mające na celu zwiększenie dokładności reprezentacji tkanek, obejmują kokulturę z dodatkowymi typami komórek, takimi jak leukocyty, fibroblasty lub komórki śródbłonka46,47,48. Zaobserwowano, że kokultura ALI-PBEC z makrofagami różnicowanymi za pomocą czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) lub M-CSF znacząco wpływa na wrodzone odpowiedzi nabłonkowe i procesy naprawcze48. Należy zauważyć, że w takich modelach kokultury problemem może być kompatybilność pożywki. Ponieważ pożywka stosowana do hodowli komórek nabłonkowych dróg oddechowych jest opracowana specjalnie dla PBEC i może nie być optymalnie dostosowana do innych typów komórek, niezbędna jest optymalizacja. Innym rodzajem postępów w dziedzinie biologii dróg oddechowych, w których można wykorzystać izolowane PBEC, jest zastosowanie technologii Organ-on-a-Chip (OoC)49,50. Dzięki zastosowaniu tej technologii można badać wpływ mechanicznych sił oddychania i przepływu krwi, takich jak rozciąganie, przepływ powietrza i pożywki 29.
Zmienność międzydańcy może być znacząca podczas stosowania PBEC od różnych dawców, dlatego w badaniach nad hodowlami komórek nabłonkowych ważne jest uwzględnienie komórek pochodzących od kilku dawców, aby zniwelować tę zmienność. Ponieważ hodowla ALI-PBEC jest czasochłonna i wiąże się z wysokimi kosztami, zbadano możliwość tworzenia kultur ALI-PBEC poprzez mieszanie komórek od różnych dawców w jednym insercie hodowlanym. W ten sposób można łatwo przeprowadzać eksperymenty pilotażowe z wykorzystaniem komórek pierwotnych przed analizą odpowiedzi kultur pochodzących od poszczególnych dawców. Ponadto w badaniach eksploracyjnych można grupować dawców o różnych charakterystykach (np. z różnych grup wiekowych lub różnej płci). Przy stosowaniu mieszanin dawców ważne jest zapewnienie obecności równej liczby komórek od różnych dawców, aby uniknąć sytuacji, w której jeden dawca dominuje w wynikach ze względu na wyższą szybkość proliferacji. W związku z tym komórki od poszczególnych dawców są namnażane oddzielnie i wysiewane do insertu w większej gęstości niż w przypadku wysiewu komórek od pojedynczego dawcy, co ma na celu zminimalizowanie proliferacji w insercie przed przejściem na ALI. Odpowiedzi mieszanin dawców i odpowiadających im pojedynczych dawców porównano, badając kinetykę infekcji SARS-CoV-2. Przy użyciu RT-qPCR i barwienia immunofluorescencyjnego zaobserwowano, że mieszanina dawców stanowi dobrą reprezentację poszczególnych dawców, wykazując podobną liczbę wyprodukowanych cząsteczek wirusa oraz podobną liczbę zakażonych komórek28.
Aby stać się akceptowalną alternatywą dla modeli zwierzęcych, edycja genów w hodowlach komórek nabłonkowych oskrzeli powinna być wykonalna51. Badano technologię interferencji RNA z wykorzystaniem małych interferujących RNA (siRNA) w ALI-PBECs, jednak ponieważ komórki muszą zostać przetransfekowane siRNA podczas fazy zanurzenia hodowli, wyciszenie genów nie jest utrzymywane w stopniu wystarczającym podczas hodowli ALI ze względu na długi czas trwania hodowli, chyba że transfekcja siRNA jest często powtarzana w trakcie procesu52. Niemniej jednak, siRNA mogą być z powodzeniem stosowane do modyfikacji ekspresji genów w zanurzonych komórkach podstawnych. Inni badacze z powodzeniem wykorzystali technologię CRISPR/Cas9 do edycji genów w pierwotnych hodowlach komórek nabłonkowych dróg oddechowych w warunkach ALI poprzez dostarczanie rybonukleoprotein (RNP)53. Przy stosowaniu takich technik kluczowe jest, aby komórki zachowały pełną zdolność do różnicowania. Ponieważ pierwotne hodowle komórek dróg oddechowych nie mogą być pasażowane w nieskończoność, klonalna ekspansja komórek poddanych edycji genów nie jest łatwa, a dodawanie pożywki do selekcji przetransfekowanych komórek jest uciążliwe. W związku z tym trudno jest osiągnąć pożądane wyciszenie we wszystkich hodowanych komórkach. Alternatywą w celu generowania klonów z nokautem jest zastosowanie strategii nokautu w hiPSCs54 i wykorzystanie tych komórek do generowania komórek nabłonkowych dróg oddechowych. Inną, choć suboptymalną alternatywą, jest ustanowienie unieśmiertelnionej linii PBEC w celu klonalnej ekspansji komórek z edytowanymi genami55.
Protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu jest jednym ze sposobów generowania dobrze zróżnicowanych, rzekomo warstwowych kultur ALI-PBEC, jednak opracowano również inne protokoły pozwalające na ustanowienie takiej hodowli, wykazujące mniejsze lub większe różnice w porównaniu z zaprezentowaną metodą. Naszym zdaniem walidacja metod hodowli w różnych laboratoriach oraz rygorystyczna kontrola jakości są niezbędne, aby system ALI-PBEC oraz podobne systemy hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych mogły stać się wiarygodną alternatywą dla eksperymentów na zwierzętach.

Rola nabłonka dróg oddechowych w wielu ostrych i przewlekłych chorobach płuc została opisana w różnych recenzjach1,2,3,4,5,6,7. Dobrze zróżnicowane hodowle komórek nabłonka dróg oddechowych są ważnym narzędziem do wyjaśnienia roli nabłonka dróg oddechowych. Hodowla komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy przepływu powietrza i cieczy (ALI) jest szeroko stosowana w celu promowania różnicowania komórek podstawnych nabłonka dróg oddechowych, a tym samym wiarygodnego badania nabłonka dróg oddechowych in vitro8,9. W ostatnich latach wykorzystanie takich modeli jeszcze bardziej wzrosło w wyniku nowych inicjatyw badawczych związanych z pandemią COVID-19 i ogólnoświatowym przejściem na badania bez udziału zwierząt. W związku z tym zwiększone wykorzystanie tej modelowej linii komórkowej podkreśla potrzebę dzielenia się procedurami i doświadczeniami w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Pozwoli to również na porównanie wyników pomiędzy grupami badawczymi. Solidność procedury jest kluczową cechą i dlatego musi zostać poddana kontroli jakości. Kilka laboratoriów zainwestowało w opracowanie protokołów hodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych w ALI. Czas, wysiłek i wymagany budżet można zmniejszyć, gdy te procedury zostaną szczegółowo udostępnione. Szczegóły te obejmują na przykład wybór tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych i pożywek dostarczanych przez różnych producentów, ponieważ stwierdzono, że ma to wpływ na charakterystykę uzyskanych kultur10,11,12. Podkreśla to znaczenie dzielenia się doświadczeniami i szczegółami procedur hodowlanych, ponieważ brak takich spostrzeżeń może mieć wpływ na wyniki i/lub wysiłki walidacyjne w różnych laboratoriach mogą być utrudnione.
Nabłonek płuc człowieka składa się z różnych typów komórek, w tym głównych, takich jak komórki podstawne, komórki rzęskowe, komórki kubkowe i komórki maczugowe. Aby wiarygodnie naśladować warstwę komórek nabłonka w drogach oddechowych in vitro, te typy komórek muszą być reprezentowane w modelach hodowlanych, a ich polaryzacja i funkcja muszą być zachowane13,14,15,16. Równie ważne jest uświadomienie sobie, że cechy dawcy (w tym stan choroby) i anatomiczne pochodzenie komórek (tj. nos, tchawica, duże i małe drogi oddechowe) mogą wpływać na skład komórkowy i funkcjonalne odpowiedzi hodowli komórkowej. Odpowiednia wiedza specjalistyczna i praktyka są warunkiem wstępnym pomyślnej hodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych i oceny jakości hodowli zarówno intuicyjnie (poprzez oględziny podczas hodowli), jak i ilościowo. Celem tego wkładu jest zapewnienie opłacalnej i efektywnej czasowo metody izolacji i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (PBEC), która może być również stosowana do hodowli komórek tchawicy i małych komórek nabłonka dróg oddechowych. Oprócz opisu metody izolowania takich komórek z wyciętej tkanki płucnej, przedstawiono i omówiono metodę ekspansji i biobankowania, a na końcu ustanowienia i scharakteryzowania dobrze zróżnicowanej kultury ALI w rozsądnym okresie kosztów i czasu.

<table><tbody><tr><td>Rezystor testowy 1,000 omów</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>Służy do kalibracji woltoomomierza nabłonkowego EVOM2</td></tr><tr><td>Kwas 4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametylo-2-naftalenylo)etynylo)-benzoesowy (EC 23)</td><td>Tocris</td><td>4011</td><td>Stosowany w pożywce z bBD</td></tr><tr><td>6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe traktowane TC</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Stosowany w pierwszym etapie do wzrostu komórek wyizolowanych z oskrzeli pierścień&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do pomiaru wzrostu komórek nabłonka dróg oddechowych</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>Używany do porównania z pożywką do kąpieli</td></tr><tr><td>perełkowej cBD 20 litrów</td><td>Lab Armor</td><td>74220-720</td><td>Służy do wstępnego podgrzewania roztworów do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>BEGM Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli</td><td>BulletKit LONZA</td><td>CC-3170</td><td>Służy do porównania z pożywką cBD</td></tr><tr><td>Frakcja albuminy bydlęcej V (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td>Stosowany w roztworze powlekającym</td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Stosowany w c-KSFM</td></tr><tr><td>Suplement wzrostu komórek nabłonka oskrzeli (BEpiCGS)</td><td>Laboratoria badawcze ScienCell</td><td>3262</td><td>Stosowany w podłożu cBD</td></tr><tr><td>Komórka nabłonka oskrzeli średnio podstawna (BEpiCM-b)</td><td>Laboratoria Badawcze ScienCell</td><td>SCC3211-b</td><td>Stosowany w podłożu</td></tr> <tr><td>cBDWkładki do hodowli komórkowych; 12 mm Transwell z 0,4 i mikro; Wkładka z membrany poliestrowej o m porach</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>Wkładki do hodowli komórkowych stosowane w protokole</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych; Wkładki 12-dołkowe, 0,4 i mikro; m Bezbarwny PET</td><td>CellQART firmy SABEU</td><td>9310412</td><td>Wkładki do hodowli komórkowych używane do porównania z wkładkami do hodowli komórkowych Corning</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych; 12-dołkowe wkładki do hodowli tkankowych ThinCert</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>Wkładki do hodowli komórkowych stosowane do porównania z wkładkami do hodowli komórkowych Corning</td></tr><tr><td>Kolba CELLSTAR, TC, PS, 250 ml, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>Służy do rozszerzania komórek liczbowych</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Program do analizy danych qPCR generowanych za pomocą systemu CFX384</td></tr><tr><td>CFX384 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym System wykrywania</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Zestaw elektrod pałeczkowych</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td>Służy do pomiaru oporu elektrycznego w inkubatorze ALI-PBEC</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>Inkubator do hodowli komórkowych używany do hodowli komórek wolnych od mycplazmy</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>Inkubator do hodowli komórkowych zakażonych mycplazmą</td></tr><tr><td>Pojemnik Coolcell</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>Służy do kriokonserwacji komórek w temperaturze -80 &deg; C przed przeniesieniem do cieczy N2</td></tr><tr><td>Hrabina 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>Służy do liczenia komórek i określania stężenia komórek</td></tr><tr><td>Kriowialne</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td><td>Służy do kriokonserwacji komórek w</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>Stosowany w miękkiej trypsynie</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Avantor VWR</td><td>0231</td><td>Stosowany w pożywce do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>Stosowany w syntezie cDNA</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle'a (DMEM) firmy Dulbecco + 4500 mg/l D-Glucose</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36250</td><td>Stosowany w pożywce cBD</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM) 4,5 g/l glukozy z l-glutaminą</td><td>LONZA</td><td>LOBE12-604F</td><td>Stosowany w pożywce z CBD w porównaniu z DMEM innych producentów&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), o wysokiej zawartości glukozy, pirogronianu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966029</td><td>Stosowany w pożywce z CBD, aby porównać z DMEM innych producentów&nbsp;</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Stosowany w c-KSFM</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>Stosowany w miękkiej trypsyny</td></tr><tr><td>EVOM2 Woltoomomierz nabłonkowy</td><td>World Precision Instruments</td><td>91799</td><td>Używany z zestawem elektrody pałeczki do pomiaru oporu elektrycznego w</td></tr><tr><td>roztworze fibronektyny ALI-PBEC, Człowiek&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>Stosowany w roztworze powlekającym</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Stosowany w podłożu cBD</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>Służy do rozpuszczania proteazy XIV&nbsp;</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>odczynnik qPCR</td></tr><tr><td>Chlorowodorek izoproterenolu, (-)-</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>Stosowany w c-KSFM</td></tr><tr><td>Keratynocyty-SFM (KSFM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Stosowany w c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>Zautomatyzowany system izolacji RNA</td></tr><tr><td>Maxwell RSC po prostu Zestaw tkanek RNA</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>Służy do izolacji całkowitego RNA za pomocą Maxwell RSC Instrument</td></tr><tr><td>M-MLV Odwrotna transkryptaza</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>Stosowany w syntezie cDNA</td></tr><tr><td>M-MLV Odwrotna transkryptaza 5X bufor reakcyjny</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>Stosowany w syntezie cDNA</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td><td>Używany do wykrywania obecności mykoplazmy w próbkach hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td>Stosowany w pożywce cBD</td></tr><tr><td>Oligo(dT)15</td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>Stosowany w syntezie roztworu</td></tr><tr><td>cDNA Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0513</td><td>Stosowany jako antybiotyk w pożywce c-KSFM i cBD</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>LUMC apteka</td><td>Nie dotyczy</td><td>Stosowany w różnych etapach protokołu</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05002</td><td>Służy do hodowli komórek w fazie różnicowania w porównaniu z pożywką CBD</td></tr>, <tr><td>Pneumacult-Ex Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05040</td><td>Służy do hodowli komórek w fazie zanurzonej w celu porównania z pożywką CBD</td></tr><tr><td>, Starter, ATP5B, naprzód</td><td>Zintegrowane DNA Technologie</td><td>Nie dotyczy</td><td>Sekwencja nukleotydowa: TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, odwrotny</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sekwencja nukleotydowa: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, naprzód</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sekwencja nukleotydowa: GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, odwrotna</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sekwencja nukleotydowa: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, naprzód</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Sekwencja nukleotydowa: CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, odwrotna</td><td>Zintegrowana Technologia DNA Nie</td><td>dotyczy</td><td>Sekwencja nukleotydowa: TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, naprzód</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy</td><td>Sekwencja nukleotydowa: GGGCTTTGACAAGAGAGT</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, odwrotna</td><td>sekwencja nukleotydowa Integrated Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>: AGGATGGTCGTGTTGATGCG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, naprzód</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sekwencja nukleotydowa: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sekwencja nukleotydowa: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, naprzód</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Nie dotyczy</td><td>Sekwencja nukleotydowa: ACATGAGAGGAGGCAGGGGCTC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, odwrotna</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Sekwencja nukleotydowa: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>Starter, TP63, naprzód</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sekwencja nukleotydowa: CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>Primer, TP63, odwrotna</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Sekwencja nukleotydowa: TCGAATCAAATGACTAGGGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Stosowany jako środek przeciwdrobnoustrojowy przeciwko bakteriom, mykoplazmom i grzybom w pożywce c-KSFM</td></tr><tr><td>Proteaza XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>Stosowany do enzymatycznego leczenia pierścienia oskrzelowego</td></tr><tr><td>RNAsin Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>Stosowany w syntezie cDNA</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej ( SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>Służy do hamowania działania miękkiej trypsyny</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>Stosowany w syntezie cDNA</td></tr><tr><td>TissueSAFE plus</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>System transferu próżniowego do próbek biologicznych</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Służy do liczenia żywych i martwych komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsyna 1:250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250-018</td><td>Stosowany w miękkim</td></tr><tr><td>roztworze kolagenu trypsyna typu I (PureCol)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>Stosowany w roztworze do powlekania</td></tr><tr><td>Pojemnik uniwersalny, PP, z nakrętką PE</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>Stosowany w protokole leczenia proteazy XIV pierścienia oskrzelowego</td></tr></tbody></table>

izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

Warstwa komórek nabłonka dróg oddechowych tworzy pierwszą barierę między tkanką płucną a środowiskiem zewnętrznym i dlatego jest stale narażona na wdychane substancje, w tym czynniki zakaźne i zanieczyszczenia powietrza. Warstwa nabłonka dróg oddechowych odgrywa kluczową rolę w wielu różnych ostrych i przewlekłych chorobach płuc, a różne leki ukierunkowane na ten nabłonek są stosowane przez wdychanie. Zrozumienie roli nabłonka w patogenezie i sposobu, w jaki można go ukierunkować na terapię, wymaga solidnych i reprezentatywnych modeli. Coraz częściej stosuje się modele hodowli nabłonka in vitro, które oferują przewagę w postaci przeprowadzania eksperymentów w kontrolowanym środowisku, wystawiając komórki na różnego rodzaju bodźce, toksyny lub czynniki zakaźne. Zastosowanie komórek pierwotnych zamiast unieśmiertelnionych lub nowotworowych linii komórkowych ma tę zaletę, że komórki te różnicują się w hodowli do pseudowarstwowej spolaryzowanej warstwy komórek nabłonka z lepszą reprezentacją nabłonka w porównaniu z liniami komórkowymi.
Prezentowany tutaj jest solidny protokół, który został zoptymalizowany w ciągu ostatnich dziesięcioleci, do izolacji i hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych z tkanki płucnej. Procedura ta umożliwia skuteczną izolację, ekspansję, hodowlę i różnicowanie śluzowo-rzęskowe pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli (PBEC) poprzez hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) i obejmuje protokół biobankowania. Ponadto opisano charakterystykę tych kultur przy użyciu genów markerowych specyficznych dla komórki. Te kultury ALI-PBEC mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do ekspozycji na cały dym papierosowy lub mediatory stanu zapalnego oraz do kohodowli/infekcji wirusami lub bakteriami. 
Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie, ilustrujący procedurę krok po kroku, ma stanowić podstawę i/lub odniesienie dla osób zainteresowanych wdrożeniem lub adaptacją takich systemów hodowlanych w swoim laboratorium.

Namnażanie z wykorzystaniem hodowli zanurzeniowej 
Stosując przedstawioną tutaj metodę, z jednej płytki 6-dołkowej można uzyskać średnio osiem krioprobek zawierających 400 000 komórek na krioprobówkę do długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie (Rycina 2A). Aby to osiągnąć, izolowane PBEC hoduje się w płytkach 6-dołkowych przez minimum 7 dni i maksymalnie 14 dni (Rycina 2B) w obecności Primocinu, aby wykluczyć zanieczyszczenie drobnoustrojami (zwłaszcza mycoplasmas). Rycina 2A,B zapewnia wgląd w liczbę uzyskanych komórek oraz wymagany czas hodowli w przypadku różnych izolacji od wielu dawców. Przed zebraniem komórek poprzez trypsynizację w celu przechowywania w ciekłym azocie, stopień konfluencji musi przekraczać 80%. Jeśli nie zostanie to osiągnięte w ciągu 14 dni, komórek nie należy krio konserwować. Co ważne, podczas zbioru do przechowywania oraz pasażowania, konfluencja warstwy komórkowej nie powinna przekraczać ok. 95% (Rysunek 2C). Po przechowywaniu w ciekłym azocie komórki można rozmrozić i hodować w celu ich namnożenia, aż do uzyskania liczby komórek wystarczającej do hodowli ALI. Medium stosowane na tym etapie do namnażania komórek to c-KSFM, analogicznie jak podczas wstępnej hodowli po pobraniu z pierścienia oskrzela.18Na tym etapie nie ma jednak potrzeby stosowania Primocinu, ponieważ ryzyko dodatkowego zanieczyszczenia mikrobiologicznego pochodzącego z tkanki płucnej jest nieobecne, w związku z czym Primocin można zastąpić penicyliną/streptomycyną. Pożywka ta sprzyja wzrostowi komórek nabłonkowych w stosunku do fibroblastów, co zapobiega możliwości przerostu kultury przez szybciej proliferujące fibroblasty.19,20,21Stosując medium c-KSFM, komórki rozprzestrzeniają się w kolbie i nie łączą się ze sobą, co wyraźnie różni się od morfologii komórek hodowanych w warunkach zanurzenia w medium cBD na tym etapie (Rycina 2D,E). Po 5 lub 6 dniach hodowania rozmrożonych komórek w kolbie T75, warstwa komórkowa powinna osiągnąć 80%–95% konfluencji, co odpowiada około 3 x 106 łącznie komórek (Rysunek 2F). Z tej ilości można przygotować około 75 wkładników (w rozmiarze do płytki 12-dołkowej) do hodowli ALI.
Opisana w niniejszym opracowaniu metoda izolacji i hodowli może zostać również dostosowana do wykorzystania biopsji oskrzeli lub wymazów z oskrzeli jako materiału wyjściowego.
<img alt="Wykresy rozrzutu liczby komórek względem dawcy (A, F), obrazy mikroskopowe kultur komórkowych (C, D, E), dane badania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ekspansja komórek podstawowych przed i po kriokonserwacji. Komórki izolowano zgodnie z opisanym protokołem i hodowano w c-KSFM. Monitorowano liczbę komórek uzyskanych od każdego dawcy; zliczanie żywych komórek przeprowadzono za pomocą automatycznego licznika komórek (A) podczas zbierania komórek pasażu 0 (P0) z płytek 6-dołkowych (krok 2 protokołu), n = 123 dawców; liczba komórek została przedstawiona jako liczba komórek zebranych z jednego dołka; każda kropka reprezentuje jednego dawcę, a medianę zaznaczono poziomą kreską. (B) W ramach kontroli jakości monitorowano czas, w jakim komórki P0 osiągnęły 80% do 90% konfluencji w płytkach 6-dołkowych, przedstawiony jako liczba dni po rozpoczęciu hodowli zanurzeniowej w c-KSFM (n = 127 różnych dawców). Każdy pojedynczy dawca jest oznaczony kropką, a wszystkie kropki przypadające na ten sam dzień zlewają się w linię; im szersza linia, tym więcej dawców ona reprezentuje; medianę liczby dni przebywania komórek w kulturze zaznaczono cieńszą poziomą kreską. (C) Reprezentatywny obraz w jasnym polu komórek P0 hodowanych zanurzeniowo w c-KSFM w momencie zbierania komórek do długoterminowej kriokonserwacji. (D) Reprezentatywny obraz w jasnym polu komórek P1 hodowanych zanurzeniowo w c-KSFM w momencie zbierania komórek i przenoszenia ich do insertów oraz (E) komórek P1 hodowanych zanurzeniowo w medium cBD. (F) Liczbę żywych komórek uzyskanych od każdego dawcy monitorowano za pomocą automatycznego licznika komórek podczas zbierania komórek P1 z kolby T75 (sekcja 4 protokołu), n = 63 różnych dawców; liczba komórek jest przedstawiona jako liczba komórek na kolbę T75, każdego dawcę oznacza kropka, a medianę liczby komórek zaznaczono poziomą kreską. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Kultura na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) 
W 7. dniu po rozpoczęciu kultury ALI mierzy się oporność elektryczną warstwy komórkowej, która powinna wynosić ponad 300 Ω (Rysunek 3A); jeśli taka wartość nie zostanie osiągnięta, kulturę uznaje się za nieudaną ze względu na możliwy brak formowania się połączeń ścisłych. Zaleca się wykluczenie możliwości uzyskania niskich wartości TEER spowodowanych uszkodzeniem warstwy nabłonkowej w poszczególnych insertach, wynikającym na przykład z uszkodzenia warstwy komórkowej podczas mycia i aspiracji. Można to sprawdzić poprzez wizualną inspekcję mikroskopową insertów z kulturą. W naszym doświadczeniu zmienność międzyodonorowa oporności elektrycznej może być znaczna (Rysunek 3B), co jest również zgłaszane w literaturze14, a jak zaobserwowano, jest ona także wyraźnie zależna od pochodzenia stosowanego DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) (Rysunek 3C).
<img alt="Wykresy pomiarów TEER; Dni po ALI vs. TEER; analiza różnych warunków hodowli komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Transepitelialna oporność elektryczna jako kontrola jakości hodowli ALI-PBEC. Komórki PBEC zostały wyizolowane i namnożone, a następnie utworzono dobrze zróżnicowane hodowle ALI-PBEC. W kilku punktach czasowych podczas hodowli mierzono oporność elektryczną, a następnie obliczano TEER (Ω·cm2). (A) Oporność elektryczną mierzono w ciągu 14 dni po ALI. n = 4 różnych dawców. Dane przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie standardowe (SD). (B) W ramach kontroli jakości hodowli komórkowych ALI-PBEC oporność elektryczną mierzono w 7. dniu (n = 50) i 14. dniu po ALI (n = 25); każda kropka reprezentuje jednego dawcę, a mediana TEER (Ω·cm2) jest zaznaczona poziomym paskiem. Istotność danych sprawdzono za pomocą nieparametrycznego testu Mann-Whitney, nie stwierdzając istotnych różnic. (C) Przebadano pożywki od trzech różnych dostawców DMEM, aby ocenić ich wpływ na tworzenie TEER. n = 4 różnych dawców; wartości średnie przedstawiono ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Podczas tworzenia dobrze zróżnicowanej hodowli ALI-PBEC, od momentu ekspozycji na powietrze, stężenie RA wzrasta22. W ten sposób komórki przechodzą z proliferacji do różnicowania śluzowo-rzęskowego, co jest widoczne już 9 dni (zależnie od dawcy) po ekspozycji na powietrze w badaniu za pomocą mikroskopii w polu jasnym. W tym punkcie widoczny jest ruch pierwszych rzęsek, a nieco wcześniej w oparciu o ekspresję genów markerów zróżnicowanych komórek światła23 (Rycina 4).
Zgodnie z opisem w protokole, produkcję śluzu można zaobserwować również podczas płukania powierzchni apikalnej podczas wymiany medium. RA jest bardzo wrażliwe na światło, co prowadzi do znacznych różnic w aktywności przy tym samym stężeniu roztworu roboczego. Z tego powodu RA zastąpiono syntetycznym analogiem RA, EC 23, stosowanym w tym samym stężeniu, co pozwoliło uzyskać podobne wyniki w badaniach eksperymentalnych. Ze względu na to oraz aby uniknąć zmiany procedury, wybrane stężenie EC 23 utrzymano na poziomie stężenia RA (tj. 50 nM) stosowanego wcześniej24,25 (Rysunek 5). Rysunek 5A przedstawia wartości TEER uzyskane przy zastosowaniu różnych stężeń EC 23, wykazując maksymalny TEER przy 50 nM w badanym zakresie stężeń. Wyniki przedstawione na Rysunku 5B potwierdzają, że ekspresja genów markerów dla komórek rzęskowych i kubkowych jest podobna przy zastosowaniu 50 nM EC 23 lub RA. EC 23 jest również wymagane podczas hodowli w fazie zanurzonej (choć w znacznie niższym stężeniu), ponieważ pominięcie go w tej fazie i dodanie go dopiero na etapie ALI skutkuje kulturą, która nigdy nie osiąga pełnej konfluencji. Czas potrzebny do wygenerowania dobrze zróżnicowanej kultury ALI-PBEC z widoczną aktywnością ruchów rzęsek i produkcją śluzu wynosi około 14 dni, dlatego większość eksperymentów rozpoczyna się na kulturach ALI w dniach 14-21 (Rysunek 4). Wszystkie główne typy komórek (komórki podstawowe, rzęskowe, kubkowe i komórki Club) są obserwowane po 14 dniach hodowli ALI, choć poziomy ekspresji są w dużym stopniu zależne od dawcy. Wykazano to poprzez ocenę ekspresji genów TP63, FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1 za pomocą RT-qPCR lub ekspresji białek przy użyciu przeciwciał przeciwko p63, α-tubulinie, Muc5AC i CC-16 w barwieniu immunofluorescencyjnym (IF), aby wykryć odpowiednio markery komórek podstawowych, rzęskowych, kubkowych i komórek Club25,26. Jednak o ile okres 14-21 dni można uznać za ogólną zasadę dla większości eksperymentów, o tyle w wybranych badaniach można rozważyć dłuższy czas różnicowania, co stwierdzono w przypadku metabolizmu ksenobiotyków, zakażenia SARS-CoV-2 oraz oceny transportu śluzowo-rzęskowego27,28,29.
<img alt="Wykresy ekspresji genów dla komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i komórek Clara; dni po ALI; analiza porównawcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Hodowla na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). PBECs zostały wyizolowane i namnożone, a następnie utworzono dobrze zróżnicowane hodowle ALI-PBEC. Hodowle ALI-PBEC monitorowano przez 14 dni po ALI. Kultury komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA w 0, 7 i 14 dniu po ALI. Przedstawiono dane od dwóch różnych dawców; każda kropka reprezentuje jednego indywidualnego dawcę monitorowanego w czasie, a mediana jest zaznaczona poziomą kreską. Ekspresję genów markerów komórek podstawnych, rzęskowych, kubkowych i komórek Clara (TP63, FOXJ1, MUC5B oraz SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono za pomocą qPCR i znormalizowano względem ekspresji genów RPL13A i ATP5B (szczegóły patrz w referencji 23). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Opór transepitelialny i różnicowanie komórek, pomiar TEER, wykres słupkowy, wyniki badań komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Porównanie kwasu retinowego (RA) i jego syntetycznego analogu EC 23. Komórki PBEC zostały wyizolowane i namnożone, a następnie utworzono dobrze zróżnicowane hodowle ALI-PBEC. W momencie rozpoczęcia ekspozycji hodowli PBEC na powietrze, RA (50 nM) zastąpiono różnymi stężeniami EC 23. (A) Opór elektryczny zmierzono w 14. dniu po ALI, a następnie obliczono TEER (Ω·cm2), n = 2 dawców; słupki przedstawiają wartość średnią ± SD. (B) W 14. dniu po ALI hodowle komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA i późniejszej analizy ekspresji genów markerów komórek rzęskowych oraz kubkowych (FOXJ1, MUC5AC) za pomocą qPCR, z normalizacją względem RPL13A (n = 3 dawców). Przedstawiono krotność wzrostu w stosunku do ALI-PBEC hodowanych z 50 nM RA jako wartość średnią ± SD. (Szczegóły znajdują się w referencji 23) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W ciągu ostatnich lat badano wydajność alternatywnych produktów w systemie hodowli, takich jak pożywki i tworzywa sztuczne do hodowli. Przyczyn takich ocen było wiele, w tym zmiany w składzie pożywek wprowadzane przez producentów, wprowadzenie nowych mediów, a także niedobory produktów podczas pandemii COVID-19 (2020-2022). Zaobserwowano, że podobne produkty od różnych dostawców prowadzą do zróżnicowania hodowli komórek nabłonkowych na podstawie oceny markerów typów komórek nabłonkowych, choć końcowy skład komórkowy może się znacznie różnić (Rysunek 6A), podczas gdy różnice w TEER były mniej wyraźne (Rysunek 6B). Z drugiej strony, pożywki od różnych dostawców rzeczywiście powodowały istotne różnice w składzie komórkowym; w przypadku zastosowania insertów różnych marek różnice te były ograniczone (Rysunek 6C). W szczególności, przy zastosowaniu pożywki do hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych PneumaCult firmy STEMCELL Technologies, zaobserwowano inną morfologię i szybsze powstanie widocznej aktywności rzęsek. Oprócz tych obserwacji odnotowano również różnicę w wartościach TEER oraz różnicę w składzie komórkowym ALI-PBEC w porównaniu z pożywką cBD (Rysunek 6D).
<img alt="Wykresy słupkowe i liniowe porównujące znormalizowaną ekspresję TP63, FOXJ1, MUC5AC, SCGB1A1 w typach komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Porównanie różnych dostawców pożywki do komórek nabłonkowych i insertów do hodowli komórkowych. Wyizolowano PBEC, przeprowadzono ich ekspansję i ustanowiono dobrze zróżnicowane kultury ALI-PBEC. (A) ALI-PBEC hodowano przez 14 dni, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek podstawkowych, rzęsatych, kubkowych i komórek klubu (TP63, FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono metodą qPCR i znormalizowano względem RPL13A oraz ATP5B. n = 2 dawców; słupki przedstawiają wartość średnią ± SD. (B) W ciągu 9 dni po ALI mierzono oporność elektryczną, a następnie obliczono TEER (Ω·cm2). n = 3 różnych dawców; przedstawiono wartości średnie ± SD. (C) ALI-PBEC hodowano przez 14 dni, używając insertów do hodowli komórkowych zakupionych od trzech różnych dostawców, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek rzęsatych, kubkowych i komórek klubu (FOXJ1, MUC5AC i SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono metodą qPCR i znormalizowano względem RPL13A. n = 18 różnych dawców; słupki przedstawiają wartość średnią ± SD. Dane przetestowano pod kątem istotności statystycznej za pomocą nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa (jednoczynnikowa ANOVA) i nie stwierdzono istotnych różnic. (D) ALI-PBEC hodowano albo w pożywce cBD, albo w pożywce PneumaCult (STEMMCELL technologies) przez 14 dni po ALI, a następnie warstwy komórkowe poddano lizie w celu izolacji RNA. Ekspresję genów markerów komórek podstawkowych, rzęsatych, kubkowych i komórek klubu (TP63, FOXJ1, MUC5B i SCGB1A1, odpowiednio) zmierzono metodą qPCR i znormalizowano względem RPL13A (słupki przedstawiają wartość średnią ± SD), a oporność elektryczną mierzono w 5. i 12. dniu po ALI i wykorzystano do obliczenia TEER (Ω·cm2). n = 2; przedstawiono wartość średnią ± SD (szczegóły w referencji 23). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Skład roztworów i pożywek użytych w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

Protokół ten ma na celu solidną i opłacalną metodę, którą można wykorzystać do rozwiązania różnych pytań badawczych związanych z funkcją i rolą komórek nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona warstwę komórkową, która jest dobrą reprezentacją warstwy komórek ludzkiego nabłonka, w tym produkcji śluzu i aktywności rzęsek. Ta technika jest wszechstronna i może być stosowana do badania zniewag związanych z chorobą lub terapii.Na początek przepłucz pierścień oskrzelowy wyizolowany z ludzkiej tkanki płucnej 10 mililitrami sterylnego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego. Trzymając pierścień pęsetą, użyj małych nożyczek, aby usunąć nadmiar tkanki łącznej i resztki krwi. Przetnij pierścień na dwie części i zanurz dwie połówki w 10 mililitrach wstępnie podgrzanego roztworu proteazy 14 w HBSS zawierającym Primocin w zamkniętym sterylnym pojemniku.Inkubuj fragmenty pierścienia oskrzelowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji przenieś kawałki na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów ciepłego PBS i za pomocą zgiętej pęsety zeskrob wnętrze pierścienia, aby uzyskać roztwór komórkowy. Wyrzuć pierścień.Przenieś roztwór komórkowy do 50-mililitrowej probówki i dodaj ciepły PBS, aby uzyskać końcową objętość 50 mililitrów. Odwirować roztwór komórkowy i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 10 mililitrach ciepłego PBS. Uzupełnić objętość do 50 mililitrów za pomocą PBS i powtórzyć wirowanie.Ponownie zawiesić osad w ciepłym, kompletnym KSFM zawierającym Primocin. Następnie zastąp roztwór powlekający z płytki sześciodołkowej dwoma mililitrami zawiesiny komórek na dołek. Pozwól komórkom rosnąć, aż zostanie osiągnięte 80 do 90% zbieżności, W celu kriokonserwacji PBEC odessać pożywkę ze studzienek i umyć komórki raz dwoma mililitrami ciepłego PBS na studzienkę.Trypsynizuj komórki, dodając 500 mikrolitrów miękkiej trypsyny na dołek i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zakręć roztworem trypsyny i uwolnij komórki, delikatnie stukając w płytkę. Przenieś oderwane komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej inhibitor trypsyny sojowej.Odwirować zawiesinę i wyrzucić supernatant przed ponownym zawiesieniem osadu w 10 mililitrach KSFM zawierającego penicylinę i streptomycynę. Po zliczeniu komórek na automatycznym liczniku komórek, ponownie zawiesić komórki do stężenia 400 000 komórek na mililitr w pożywce zamrażającej i dodać jeden mililitr tej zawiesiny do kriowialu. Przenieść fiolki do pojemnika z chłodnymi komórkami i umieścić je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Po 24 godzinach przenieść fiolki do ciekłego azotu o temperaturze minus 196 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Aby pokryć kolbę do hodowli komórkowych T75, dodaj 10 mililitrów roztworu powlekającego do PBS i szczelnie zamknij pokrywkę przed umieszczeniem kolby w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp roztwór powlekający z kolby 10 mililitrami kompletnego KSFM.Pozwól pożywce ogrzać się do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z lekko uchyloną pokrywą, aby wpuścić powietrze do inkubatora. Szybko rozmrozić kriokonserwowane PBEC w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj całą zawartość kriowialu do wstępnie podgrzanej kolby T75 i równomiernie rozprowadź komórki.Po upewnieniu się, że komórki są mocno przymocowane, zastąp podłoże 10 mililitrami świeżego i ciepłego kompletnego KSFM i hoduj je, aż zostanie osiągnięte 80 do 90% zgryzu. Pokryj wkładki do hodowli komórkowych, dodając 400 mikrolitrów roztworu powlekającego na wkładkę i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Trypsynizować PBEC w kolbie, dodając dwa mililitry miękkiej trypsyny i inkubować przez pięć do 10 minut.Ułatw odłączanie komórek, obracając i delikatnie stukając w kolbę. Następnie dodaj cztery mililitry inhibitora trypsyny sojowej do kolby i przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 25 mililitrów. Odwirować zawiesinę i ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach kompletnego podłoża BD.Policz komórki w automatycznym liczniku komórek. Po nałożeniu powłoki usuń roztwór powlekający z wkładek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek kompletną pożywką BD uzupełnioną jednym nanomolem EC 23 i dodać 500 mikrolitrów na wierzch membrany wkładek.Dodaj 1,5 mililitra kompletnej pożywki BD do dołka pod wkładką. Gdy komórki są gotowe do przeniesienia do granicy faz powietrze-ciecz lub ALI, usuń pożywkę z wkładek i studzienki i dodaj nową kompletną pożywkę BD uzupełnioną 50 nanomolowym EC 23 tylko do studzienki. Zmieniaj podłoże w studzienkach trzy razy w tygodniu.Aby usunąć nadmiar śluzu i resztek komórkowych, delikatnie dodaj 200 mikrolitrów ciepłego PBS po wierzchołkowej stronie warstwy komórkowej wewnątrz wkładki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji odessać PBS zawierający nadmiar śluzu i resztek komórkowych. Zmierzono TEER w celu oceny jakości kultur ALI PBEC.Po siedmiu dniach rezystancja elektryczna warstwy ogniwa wyższa niż 300 omów jest uważana za udaną hodowlę. Co więcej, zmienność oporności elektrycznej między donorami zmniejszyła się w czasie między siódmym a czternastym dniem hodowli na granicy faz powietrze-ciecz i jest pod wyraźnym wpływem pochodzenia zastosowanego DMEM. Wszystkie główne typy komórek, takie jak komórki podstawne, rzęskowe, kielichowe i maczugowate, obserwowano po 14 dniach hodowli ALI, a poziomy ekspresji były zależne od dawcy.Spośród różnych stężeń badanego EC 23 maksymalne TEER zaobserwowano przy 50 nanomolach. Porównanie kwasu retinowego i jego syntetycznego analogu, EC 23, potwierdza, że ekspresja genów markerów dla komórek rzęskowych i kubkowych była podobna między 50 nanomolowym EC 23 a kwasem retinowym. Stosowanie pożywek pochodzących od różnych dostawców skutkowało znacznymi różnicami w składzie komórkowym, podczas gdy różnice w TEER były mniej wyraźne.Z drugiej strony, stosowanie wkładek od różnych dostawców nie skutkowało istotnymi różnicami w rozkładzie komórkowym. Ponadto zaobserwowano również różnicę w wartościach TEER i składzie komórkowym pożywki ALI PBEC i pożywki PneumaCult w porównaniu z kompletną pożywką BD. Gdy komórki są gotowe do przeniesienia do ALI, zwiększ stężenie EC 23.Nie należy również odwirowywać komórek po rozmrożeniu i szybko usuwać komórki z tworzyw sztucznych kultur komórkowych po dodaniu SBTI. Korzystając z hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych w sposób przewidziany w niniejszym protokole, można to śledzić, korzystając z różnych metod analizy, aby przyjrzeć się, na przykład, funkcji, ekspresji genów, produkcji mediatorów w komórkach nabłonka dróg oddechowych, a tym samym, na przykład, uzyskać wgląd w konsekwencje narażenia, na przykład, na dym papierosowy. Kolejnym krokiem w tym protokole hodowli komórkowej jest integracja dodatkowych typów komórek, takich jak komórki odpornościowe lub komórki naczyniowe, co pomoże zwiększyć reprezentację tkanek.

isolating-bronchial-epithelial-cells-from-resected-lung-tissue-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy szczegółową metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów tkanki dróg oddechowych człowieka, w tym ich różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Metoda ta zapewnia obfite źródło pierwotnych komórek do badania roli nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobach ludzkich płuc.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

Ten film opisuje protokół tworzenia ex vivo modelu płuc świni z biofilmu bakteryjnego na zakażonej tkance oskrzelików. Biofilmy to agregaty bakteryjne osadzone w matrycy przylegającej do powierzchni. Model ten służy do badania wrażliwości bakterii na antybiotyki na różnych etapach tworzenia biofilmu.

Model biofilmu płuc świni ex vivo: technika opracowywania modelu płuc do badania biofilmów bakteryjnych w tkance oskrzelików świni

Ten artykuł opisuje techniki bronchoskopowe w płucach bydlęcych w warunkach eksperymentalnych, tj. inokulację pod kontrolą bronchoskopową, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelową biopsję płuc.

Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania wypełnionych agarozą precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc z wyciętej tkanki pacjenta, które są odpowiednie do generowania 3D kultur tkanki płucnej do modelowania ludzkich chorób płuc w badaniach biologicznych i biomedycznych.

Generowanie ludzkich kultur 3D tkanki płuc (3D-LTC) do modelowania chorób

Opisana jest metoda hodowli komórkowej i ekspozycji modelu oskrzelowego in vitro dla realistycznej, powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki do testów toksyczności.

Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Kultura interfejsu powietrze-ciecz jest powszechnie stosowana do tworzenia pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli, które naśladują wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. W tym miejscu opisujemy prosty protokół określania jego jakości poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i integralność błony.

Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

Poznaj metodę izolacji komórek nabłonka oskrzeli z tkanki płucnej do biobankowania i hodowli granicy faz powietrze-ciecz. Technika umożliwia badanie funkcji nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz (Wideo) | JoVE Journal

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Przeglądaj więcej filmów