Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Protokół ten ma na celu solidną i opłacalną metodę, którą można wykorzystać do rozwiązania różnych pytań badawczych związanych z funkcją i rolą komórek nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona warstwę komórkową, która jest dobrą reprezentacją warstwy komórek ludzkiego nabłonka, w tym produkcji śluzu i aktywności rzęsek. Ta technika jest wszechstronna i może być stosowana do badania zniewag związanych z chorobą lub terapii.

Na początek przepłucz pierścień oskrzelowy wyizolowany z ludzkiej tkanki płucnej 10 mililitrami sterylnego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego. Trzymając pierścień pęsetą, użyj małych nożyczek, aby usunąć nadmiar tkanki łącznej i resztki krwi. Przetnij pierścień na dwie części i zanurz dwie połówki w 10 mililitrach wstępnie podgrzanego roztworu proteazy 14 w HBSS zawierającym Primocin w zamkniętym sterylnym pojemniku.

Inkubuj fragmenty pierścienia oskrzelowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji przenieś kawałki na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów ciepłego PBS i za pomocą zgiętej pęsety zeskrob wnętrze pierścienia, aby uzyskać roztwór komórkowy. Wyrzuć pierścień.

Przenieś roztwór komórkowy do 50-mililitrowej probówki i dodaj ciepły PBS, aby uzyskać końcową objętość 50 mililitrów. Odwirować roztwór komórkowy i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 10 mililitrach ciepłego PBS. Uzupełnić objętość do 50 mililitrów za pomocą PBS i powtórzyć wirowanie.

Ponownie zawiesić osad w ciepłym, kompletnym KSFM zawierającym Primocin. Następnie zastąp roztwór powlekający z płytki sześciodołkowej dwoma mililitrami zawiesiny komórek na dołek. Pozwól komórkom rosnąć, aż zostanie osiągnięte 80 do 90% zbieżności, W celu kriokonserwacji PBEC odessać pożywkę ze studzienek i umyć komórki raz dwoma mililitrami ciepłego PBS na studzienkę.

Trypsynizuj komórki, dodając 500 mikrolitrów miękkiej trypsyny na dołek i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zakręć roztworem trypsyny i uwolnij komórki, delikatnie stukając w płytkę. Przenieś oderwane komórki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej inhibitor trypsyny sojowej.

Odwirować zawiesinę i wyrzucić supernatant przed ponownym zawiesieniem osadu w 10 mililitrach KSFM zawierającego penicylinę i streptomycynę. Po zliczeniu komórek na automatycznym liczniku komórek, ponownie zawiesić komórki do stężenia 400 000 komórek na mililitr w pożywce zamrażającej i dodać jeden mililitr tej zawiesiny do kriowialu. Przenieść fiolki do pojemnika z chłodnymi komórkami i umieścić je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach przenieść fiolki do ciekłego azotu o temperaturze minus 196 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Aby pokryć kolbę do hodowli komórkowych T75, dodaj 10 mililitrów roztworu powlekającego do PBS i szczelnie zamknij pokrywkę przed umieszczeniem kolby w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp roztwór powlekający z kolby 10 mililitrami kompletnego KSFM.

Pozwól pożywce ogrzać się do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z lekko uchyloną pokrywą, aby wpuścić powietrze do inkubatora. Szybko rozmrozić kriokonserwowane PBEC w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj całą zawartość kriowialu do wstępnie podgrzanej kolby T75 i równomiernie rozprowadź komórki.

Po upewnieniu się, że komórki są mocno przymocowane, zastąp podłoże 10 mililitrami świeżego i ciepłego kompletnego KSFM i hoduj je, aż zostanie osiągnięte 80 do 90% zgryzu. Pokryj wkładki do hodowli komórkowych, dodając 400 mikrolitrów roztworu powlekającego na wkładkę i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Trypsynizować PBEC w kolbie, dodając dwa mililitry miękkiej trypsyny i inkubować przez pięć do 10 minut.

Ułatw odłączanie komórek, obracając i delikatnie stukając w kolbę. Następnie dodaj cztery mililitry inhibitora trypsyny sojowej do kolby i przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 25 mililitrów. Odwirować zawiesinę i ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach kompletnego podłoża BD.

Policz komórki w automatycznym liczniku komórek. Po nałożeniu powłoki usuń roztwór powlekający z wkładek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek kompletną pożywką BD uzupełnioną jednym nanomolem EC 23 i dodać 500 mikrolitrów na wierzch membrany wkładek.

Dodaj 1,5 mililitra kompletnej pożywki BD do dołka pod wkładką. Gdy komórki są gotowe do przeniesienia do granicy faz powietrze-ciecz lub ALI, usuń pożywkę z wkładek i studzienki i dodaj nową kompletną pożywkę BD uzupełnioną 50 nanomolowym EC 23 tylko do studzienki. Zmieniaj podłoże w studzienkach trzy razy w tygodniu.

Aby usunąć nadmiar śluzu i resztek komórkowych, delikatnie dodaj 200 mikrolitrów ciepłego PBS po wierzchołkowej stronie warstwy komórkowej wewnątrz wkładki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji odessać PBS zawierający nadmiar śluzu i resztek komórkowych. Zmierzono TEER w celu oceny jakości kultur ALI PBEC.

Po siedmiu dniach rezystancja elektryczna warstwy ogniwa wyższa niż 300 omów jest uważana za udaną hodowlę. Co więcej, zmienność oporności elektrycznej między donorami zmniejszyła się w czasie między siódmym a czternastym dniem hodowli na granicy faz powietrze-ciecz i jest pod wyraźnym wpływem pochodzenia zastosowanego DMEM. Wszystkie główne typy komórek, takie jak komórki podstawne, rzęskowe, kielichowe i maczugowate, obserwowano po 14 dniach hodowli ALI, a poziomy ekspresji były zależne od dawcy.

Spośród różnych stężeń badanego EC 23 maksymalne TEER zaobserwowano przy 50 nanomolach. Porównanie kwasu retinowego i jego syntetycznego analogu, EC 23, potwierdza, że ekspresja genów markerów dla komórek rzęskowych i kubkowych była podobna między 50 nanomolowym EC 23 a kwasem retinowym. Stosowanie pożywek pochodzących od różnych dostawców skutkowało znacznymi różnicami w składzie komórkowym, podczas gdy różnice w TEER były mniej wyraźne.

Z drugiej strony, stosowanie wkładek od różnych dostawców nie skutkowało istotnymi różnicami w rozkładzie komórkowym. Ponadto zaobserwowano również różnicę w wartościach TEER i składzie komórkowym pożywki ALI PBEC i pożywki PneumaCult w porównaniu z kompletną pożywką BD. Gdy komórki są gotowe do przeniesienia do ALI, zwiększ stężenie EC 23.

Nie należy również odwirowywać komórek po rozmrożeniu i szybko usuwać komórki z tworzyw sztucznych kultur komórkowych po dodaniu SBTI. Korzystając z hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych w sposób przewidziany w niniejszym protokole, można to śledzić, korzystając z różnych metod analizy, aby przyjrzeć się, na przykład, funkcji, ekspresji genów, produkcji mediatorów w komórkach nabłonka dróg oddechowych, a tym samym, na przykład, uzyskać wgląd w konsekwencje narażenia, na przykład, na dym papierosowy. Kolejnym krokiem w tym protokole hodowli komórkowej jest integracja dodatkowych typów komórek, takich jak komórki odpornościowe lub komórki naczyniowe, co pomoże zwiększyć reprezentację tkanek.