Name: Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę barwienia falloidyną do oceny monowarstw komórek nabłonka płuc w mikroprzepływowym urządzeniu hodowlanym. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórek w warunkach dynamicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Alanowi Shepardsonowi za zaprojektowanie wzoru cięcia dla kleju 3M i arkusza mylarowego używanego do budowy kanałów mikroprzepływowych oraz za testowanie szybkości przepływu pożywki do hodowli komórkowej i programowania pompy strzykawkowej. Finansowanie zostało zapewnione przez NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 oraz Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

<ol><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory distress syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).</li>
<li>Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+distress+syndrome%3A+An+update+and+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory distress syndrome: An update and Review.</a> Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).</li>
<li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+surface-tension-induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).</li>
<li>Modrykamien, A. M., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Baylor+University+Medical+Center+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).</li>
<li>Jacob, A. -M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+Claudin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4.</a> Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).</li>
<li>Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+gradient%2C+not+exposure+duration%2C+determines+the+extent+of+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).</li>
<li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+influence+of+cell+topography+on+epithelial+mechanical+stresses+during+pulmonary+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Fluids%22%5BJournal%5D)">An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening.</a> Physics of Fluids. 17 (3), 031502(1994).</li>
<li>Gaver, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+POOR+get+POORer%3A+A+hypothesis+for+the+pathogenesis+of+ventilator-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+ultra-thin+alveolar-capillary+basement+membrane+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics.</a> Advanced Biology. 5 (8), 2000427(2021).</li>
<li>Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+the+tumor+microenvironment+under+controlled+oxygen+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions.</a> Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).</li>
<li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation%2C+barrier+function%2C+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).</li>
<li>Jaccard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+the+rapid+and+precise+estimation+of+adherent+cell+culture+characteristics+from+phase+contrast+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).</li>
<li>Hagiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modest+static+pressure+suppresses+columnar+epithelial+cell+growth+in+association+with+cell+shape+and+cytoskeletal+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications.</a> Frontiers in Physiology. 8, 00997(2017).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids.</a> The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+on+bacterial+cellular+dimensions+and+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Iscience%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity.</a> Iscience. 24 (4), 102348(2021).</li>
<li>Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLust%2C+RM+%22The+Pulmonary+System.+XPharm%3A+The+Comprehensive+Pharmacology+Reference%22">The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference</a>. , Elsevier. 1-6 (2007).</li>
<li>EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EpilogueLaser%22">EpilogueLaser</a>. , Golden, CO: Author. (2022).</li>
<li>Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+disinfection+by+exposure+to+germicidal+UV+light%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Surface disinfection by exposure to germicidal UV light.</a> Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241(2008).</li>
<li>Sandell, L., Sakai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell culture.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4(2011).</li>
<li>New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22New+Era+Pump+Systems%22">New Era Pump Systems</a>. , Farmingdale, NY. (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Thermo+Fisher+Scientific%22">Thermo Fisher Scientific</a>. , Waltham, MA. (2018).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunocytochemical+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Thermo+Fisher+Scientific%22">Thermo Fisher Scientific</a>. , Walther, MA. (2022).</li>
<li>Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML</a> (2022).</li>
<li>Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+media%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dr.+NTR+University+of+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mounting media: An overview.</a> Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).</li>
<li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916(2021).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Ferriera, F., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+User+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">ImageJ User Guide.</a> National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+fibronectin+by+human+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Production of fibronectin by human epithelial cells in culture.</a> American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).</li>
<li>Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSieck%2C+GC+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 307, Academic Press. 296-315 (1999).</li>
<li>Heijink, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell+adhesion+in+airway+epithelial+cell+types+using+electric+cell-substrate+impedance+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretchable+impedance+sensor+for+mammalian+cell+proliferation+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony protokół opisuje hodowlę, utrwalanie sieciowania, barwienie, przenikanie i konfokalną wizualizację mikroskopową ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 w dynamicznym środowisku jednokanałowego mikroprzepływowego układu przepływowego, a także w środowisku statycznym tradycyjnego ośmiokomorowego szkła nakrywkowego. W przypadku każdego protokołu mikroprzepływowej hodowli komórkowej warunki przepływu pożywki do hodowli komórkowych mają ogromne znaczenie, ponieważ przepływ o dużej szybkości może zmyć komórki lub...

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) to ostry stan wynikający z uszkodzenia i rozprzestrzeniania się uszkodzenia miąższu płuc, skutkujący obrzękiem płuc pęcherzyków płucnych, niedostateczną wymianą gazową i późniejszą hipoksemią1. To inicjuje cykl uwalniania cytokin prozapalnych, rekrutacji neutrofili, uwalniania toksycznych mediatorów i uszkodzenia tkanek, co z kolei wywołuje dalszą reakcję zapalną2. Dodatkowo, płucny środek powierzchniowo czynny, który stabilizuje drogi oddechowe i zapobiega uszkodzeniom spowodowanym powtarzającą się rekrutacją/derekrutacją (R/D), może zostać dezaktywowany lub w inny sposób dysfunkcyjny przez procesy chemiczne zachodzące podczas ARDS, powodując dalszy stres i uszkodzenie otaczającego miąższu3. Jeśli dojdzie do wystarczającego uszkodzenia, może być konieczna wentylacja mechaniczna, aby zapewnić odpowiednie natlenienie ogólnoustrojowe4. Jednak wentylacja mechaniczna wiąże się z własnymi wyzwaniami i urazami, w tym możliwością uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem (VILI), charakteryzującego się uszkodzeniem miąższu płuc spowodowanym naprężeniami mechanicznymi wywieranymi podczas nadmiernego napompowania (volutrauma) i/lub R/D granicy faz powietrze-ciecz w drożach oddechowych zamkniętych płynem (atelectrauma)5. Gradient ciśnienia doświadczany przez komórki nabłonkowe wystawione na działanie granicy faz powietrze-ciecz (jak w oskrzeliku zamkniętym płynem) w modelu atelektraumy może powodować reakcję obturacyjną wynikającą z przepuszczalności (POOR), prowadząc do pozytywnego cyklu urazów POOR-get-POORer6,7,8.
Eksperymenty in vitro mogą dostarczyć wglądu w te zjawiska w mikroskali, ale obecne badania w środowiskach kanałów mikroprzepływowych o fizjologicznie istotnych wymiarach napotykają na kilka wyzwań9. Po pierwsze, optymalizacja warunków hodowli komórkowej stanowi istotną barierę wejścia do badań nad hodowlami komórkowymi w środowiskach mikroprzepływowych, ponieważ istnieje wąskie przecięcie, w którym parametry przepływu pożywki, czas trwania hodowli i inne warunki hodowli umożliwiają optymalne tworzenie warstwy komórkowej. Obejmuje to ograniczenia dyfuzji wynikające z nieprzepuszczalności tlenu w obudowie kanału hodowli mikroprzepływowej. Wymaga to starannego rozważenia parametrów przepływu mediów, ponieważ niskie natężenia przepływu mogą pozbawić komórki tlenu, zwłaszcza te najbardziej oddalone od wlotu; Z drugiej strony, wysokie prędkości przepływu mogą wypchnąć komórki z kanału hodowlanego lub spowodować nieprawidłowy lub nierównomierny rozwój warstw. Ograniczenia dyfuzji można rozwiązać, stosując materiały przepuszczalne dla tlenu, takie jak polidimetylosiloksan (PDMS) w aparacie do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI); jednak wiele konwencjonalnych kanałów hodowli mikroprzepływowej, takich jak te z systemu wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i podłoża (ECIS), jest z natury nieprzepuszczalnych dla tlenu, biorąc pod uwagę charakter produkowanej obudowy<klasa SUP="xref">10. Protokół ten ma na celu zapewnienie techniki analizy warstw komórkowych hodowanych w obudowie nieprzepuszczalnej dla tlenu.
Podczas porównywania żywotności warunków hodowli, obserwacje konkretnych cech warstwy, takich jak obecność monowarstwy, topologia powierzchni, konfluencja i jednorodność grubości warstwy, są niezbędne do określenia, czy warstwa komórkowa wytworzona przez określony zestaw warunków hodowli spełnia pożądane specyfikacje i jest rzeczywiście istotna dla projektu eksperymentalnego. Ograniczoną ocenę można przeprowadzić za pomocą metod takich jak ECIS, która wykorzystuje pomiary potencjału elektrycznego (napięcia) wytwarzanego przez rezystancję prądu przemiennego o wysokiej częstotliwości (AC) (impedancji) wywieranej przez elektrycznie izolujące membrany komórek hodowanych na złotych elektrodach w układzie przepływowym. Modulując częstotliwość prądu przemiennego przyłożonego do komórek, można celować i badać specyficzne, zależne od częstotliwości właściwości komórkowe komórek i warstw komórkowych, takie jak siła przylegania do powierzchni, tworzenie ścisłych połączeń oraz proliferacja lub konfluencja komórek11. Jednak te pośrednie formy pomiarów są nieco trudne do zinterpretowania na początku eksperymentu i mogą nie określać ilościowo wszystkich istotnych aspektów warstwy komórkowej. Zwykła obserwacja warstwy komórkowej pod mikroskopem z kontrastem fazowym może ujawnić naturę pewnych cech, takich jak zbieganie się; jednak wiele istotnych cech, takich jak obecność monowarstwy i jednorodność grubości warstwy, wymaga trójwymiarowej (3D) oceny, która nie jest możliwa w przypadku obrazowania w jasnym polu, kontraście fazowym lub mikroskopii fluorescencyjnej12.
Celem tego badania było opracowanie techniki barwienia aktyną nitkową, aby umożliwić weryfikację monowarstwy na podstawie obrazowania i ocenę jednorodności warstwy komórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Aktyna nitkowa (F-aktyna) została uznana za odpowiedni cel dla koniugatu fluoroforu, częściowo ze względu na sposób, w jaki F-aktyna ściśle podąża za błoną komórkową, co pozwala na wizualne przybliżenie całej objętości komórki13. Inną ważną korzyścią płynącą z celowania w F-aktynę jest sposób, w jaki barwienie F-aktyny wizualnie wyjaśnia zakłócenia cytoszkieletu lub zmiany narzucone przez stresy i napięcia doświadczane przez komórki. Sieciowanie za pomocą formaldehydu wolnego od metanolu zastosowano w celu zachowania morfologii komórek i warstwy komórkowej, ponieważ utrwalacze odwadniające, takie jak metanol, mają tendencję do spłaszczania komórek, rażąco zniekształcając warstwę komórkową i zmieniając jej właściwości14,15.
Aby określić zdolność techniki oceny warstw do złagodzenia tych wyzwań, komórki hodowano w tradycyjnych ośmiodołkowych komorach hodowlanych, jak również w kanałach mikroprzepływowych, aby ocenić różnice, jeśli takie istnieją, w warstwach komórek, które zostały wyprodukowane. W przypadku stałych studni hodowlanych zastosowano ośmiodołkowe komorowe jednostki ze szkła nakrywkowego. W przypadku hodowli mikroprzepływowej matryce przepływowe (długość kanału 50 mm, szerokość 5 mm, głębokość 0,6 mm) zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli unieśmiertelnionych komórek ludzkiego nabłonka płuc (NCI-H441) w środowisku o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików obecnych w strefie oddechowej ludzkiego płuca16. Chociaż protokół ten został opracowany z myślą o środowisku hodowli w układach przepływowych ECIS, może on mieć zastosowanie do każdego nieprzepuszczalnego dla tlenu środowiska hodowli dynamicznej, dla którego konieczna jest ocena charakterystyki warstwy komórkowej hodowli lub warunków hodowli.

<table><tbody><tr><td>System mikroskopu konfokalnego A1R HD25</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/produkty/mikroskopy-konfokalne/A1HD25-A1RHD25/specyfikacje</td></tr><tr><td>Odczynnik ActinGreen 488 ReadyProbes (AlexaFluor 488 phalloidyna)</td><td>Invitrogen</td><td>R37110</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td></tr><tr><td>Taśma transferowa samoprzylepna podwójnie wyściółkowana</td><td>3M</td><td>468MP</td><td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td></tr> <tr><td>Air-Tite&nbsp; Jednorazowe strzykawki HSW Soft-Ject</td><td>Air-Tite RL5</td><td>14-817-53</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td></tr><tr><td>BAISDY 4 mil (0,1 mm) gruby arkusz mylarowy</td><td>BAISDY</td><td>AS022</td><td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics&nbsp; Ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca serii</td><td>M Branson Ultrasonics</td><td>15-336-100</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Fibronektyna, Human</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40008</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td></tr><tr><td>DPBS, wapń, magnez</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133</td></tr><tr><td>ECIS Cultureware Jednorazowe matryce elektrod 8 x 10 ECIS Flow Array</td><td>BioFizyka stosowana</td><td>1F8x10E PC</td><td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td></tr><tr><td>Enterprise Technology Solutions Szafka na sterylizator UV, biała</td><td>Enterprise Technology Solutions</td><td>50-211-1163</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td></tr><tr><td>Finnpipette F2 o zmiennej objętości Pipety</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td></tr><tr><td>Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastikowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-21</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Okulary nakrywkowe: prostokąty (#1.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-GP</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Sterylne strzykawki jednorazowego użytku</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td></tr><tr><td>Image-iT Utrwalacz Roztwór (4% formaldehydu, bez metanolu)</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td></tr><tr><td>ImageJ Fidżi</td><td>ImageJ ImageJ</td><td>Fidżi</td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny F 30 cc</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/produkty/akcesoria/olejek-immersyjny/specyfikacje</td></tr><tr><td>Duży zasięg CO2&nbsp; Inkubator, 821 l, polerowana stal nierdzewna</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td></tr><tr><td>Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System</td><td>Laxco</td><td>LMC3BF1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, nylonowa, prosta, męska Luer Lock do adaptera kolczastego węża, 1/16" ID; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>ZY-45505-31</td><td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&amp; gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>0016</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki z</td> tworzywa sztucznego National Target <td>Thermo Scientific</td><td>03-377-24</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td></tr><tr><td>NCI-H441 Ludzkie nabłonkowe komórki płuc</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td><td>HTB-174</td><td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td></tr><tr><td>NE-1600 Sześciokanałowa programowalna pompa strzykawkowa</td><td>New Era Systemy pomp</td><td>NE-1600</td><td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements AR</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td></tr><tr><td>Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek Komorowa szklana osłona</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td></tr><tr><td>Parafilm M Folia do owijania</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37441</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td></tr><tr><td>Zawór blokujący PendoTech 3-kierunkowy, polisulfon, męski/ Żeński wlot Luer x żeński Luer Branch</td><td>PendoTech</td><td>ZY-19406-49</td><td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanem (PBS), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Gibco</td><td>A3890401</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td></tr><tr><td>Reynolds Folia aluminiowa</td><td>Reynolds</td><td>458742928317</td><td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Millipore Sigma (Sigma Aldrich)</td><td>47036</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td></tr><tr><td>Szkło SlowFade Soft-set Anti-fade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>S36917-5X2ML</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 1300 Series klasa II, pakiet szafy bezpieczeństwa biologicznego typu A2</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-100-752PM</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood</td></tr><tr><td>Rurka transferowa Tygon, silikon utwardzany platyną BioPharm, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 stóp</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

Eksperymenty mikroprzepływowe in vitro mają ogromny potencjał, aby ujawnić wiele wglądów w zjawiska mikrofizjologiczne występujące w stanach takich jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) i uszkodzenie płuc wywołane respiratorem (VILI). Jednak badania nad kanałami mikroprzepływowymi o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca stoją obecnie przed kilkoma wyzwaniami, zwłaszcza ze względu na trudności w ustaleniu odpowiednich warunków hodowli komórkowej, w tym szybkości przepływu pożywki, w danym środowisku hodowli. Prezentowany protokół opisuje obrazowe podejście do oceny struktury ludzkich komórek nabłonka płuc NCI-H441 hodowanych w nieprzepuszczalnym dla tlenu kanale mikroprzepływowym o wymiarach fizjologicznie istotnych dla końcowych oskrzelików ludzkiego płuca. Za pomocą barwienia aktyną nitkową na bazie falloidyny, struktury cytoszkieletu komórek są ujawniane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, co pozwala na wizualizację zarówno pojedynczych, jak i warstwowych komórek. Dalsza kwantyfikacja określa, czy stosowane warunki hodowli komórkowej wytwarzają jednolite monowarstwy nadające się do dalszych eksperymentów. Protokół opisuje metody hodowli komórkowej i oceny warstw w kanałach mikroprzepływowych i tradycyjnych środowiskach ze stałą studzienką. Obejmuje to budowę kanałów, hodowlę komórkową i wymagane warunki, utrwalanie, przepuszczalność i barwienie, konfokalne obrazowanie mikroskopowe, przetwarzanie obrazu i analizę danych.

Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację warstw komórek nabłonkowych hodowlanych w mikrofluidycznych kanałach hodowlanych i wykorzystuje demonstrację w tradycyjnych środowiskach hodowli komórkowych w studzienkach jako walidację. Uzyskane obrazy będą charakteryzować się różną jakością, intensywnością sygnału i specyficznością względem celu komórkowego. Prawidłowe obrazy będą wykazywać wysoki kontrast, umożliwiając analizę obrazu i kwantyfikację danych do późniejszej ewaluacji statystycznej. Obrazy nieudane będą ciemne,...

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

Protokół ten służy obniżeniu bariery wejścia dla eksperymentów z hodowlami komórkowymi i umożliwia naukowcom ocenę i scharakteryzowanie przylegających monowarstw komórkowych hodowanych w dynamicznych środowiskach mikroprzepływowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona zarówno jakościową, jak i ilościową ocenę charakterystyki monowarstwy komórkowej, która służy jako podstawa do dalszych eksperymentów zależnych od monowarstw. Metoda ta umożliwia rekapitulację nabłonka wyrostka zębodołowego in vitro, umożliwiając zbadanie dynamicznych reakcji podczas zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), a także uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem (VILI).Aby rozpocząć, uzyskaj jednokanałową tablicę przepływu. Oczyść powierzchnię szkła nakrywkowego w kąpieli ultradźwiękowej. Zanurz szkło nakrywkowe w poli-d-lizynie w temperaturze pokojowej na pięć minut.Następnie suszyć w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przymocuj dwustronne kleje w przekładkach Mylar. Przyciąć laserowo zgodnie z opisem w manuskrypcie do szkła nakrywkowego i upewnić się, że wycięcia kanałów są dokładnie wyrównane.Przymocuj prostokątną szklaną szklankę nakrywkową do najniższego paska samoprzylepnego. Użyj oklejonych papierów samoprzylepnych, aby przykryć części kleju, które są nadal odsłonięte. Po zakończeniu montażu należy mocno i równomiernie docisnąć konstrukcję.Za pomocą strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną przepłukać kanał. Sterylizuj obudowę kanału w sterylizatorze ultrafioletowym przez 30 minut. Stosując sterylną technikę, potraktuj kanał roztworem ludzkiej fibronektyny przygotowanym w PBS i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym przygotować zawiesinę komórek NCI H441 przy użyciu pożywki RPMI 1640 z 10% FBS. Użyj 0,25 mililitra tej zawiesiny komórek, aby wypełnić kanał i część portów. Za pomocą mikroskopii jasnego pola sprawdź, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone w kanałach.Dodaj zbiornik mediów i kran do kanału. Rozpocznij hodowlę kanału w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Użyj programowalnej pompy strzykawkowej, aby wyciągnąć zużyte media z kanału i świeże media do kanału ze sterylnego zbiornika mediów podłączonego do wlotu kanału.W dygestorium chemicznym rozcieńczyć 4% roztwór formaldehydu w DPBS, aby uzyskać 1% roztwór i przechowywać w odpowiednio oznakowanej tubie. Przygotuj 2% roztwór formaldehydu w podobny sposób. Przenieś roztwory formaldehydu do odpowiednio oznakowanych pięciomililitrowych strzykawek.Pobrać 20 mililitrów DPBS do oddzielnej strzykawki o pojemności 20 mililitrów, która będzie używana do etapów mycia. Następnie należy usunąć kanał mikroprzepływowy z aparatu hodowlanego i zabezpieczyć go w okapie oparów chemicznych. Aby zmontować aparat do utrwalania i barwienia, należy przymocować segment rurki przesyłowej do bocznego portu trójdrogowego kurka za pomocą męskiej blokady Luer do adaptera zadzioru węża.Następnie podłącz kran do portu wlotowego układu przepływowego. Podłącz kolejny segment rurki przesyłowej do portu wylotowego istniejącego kranu za pomocą tego samego typu adaptera króćca węża. Na koniec zabezpiecz wolne końce obu rurek przesyłowych, które są teraz oznaczone jako przewody odpadowe, w pojemniku na odpady odpowiednie dla substancji chemicznych i zagrożeń biologicznych.Upewnij się, że kran odcinający blokuje port wlotowy układu przepływowego i przepłucz przewód odpływowy za pomocą DPBS. Następnie przekręć kurek, aby zablokować linię odpływową i powoli umyj komórki dwoma mililitrami DPBS. Powoli przepchnij dwa mililitry 1% utrwalacza przez kanał.Pozostaw na pięć minut i powtórz z 2% utrwalaczem. Następnie umyj komórki trzykrotnie świeżym DPBS, jak pokazano wcześniej. Przygotować 0,1% roztwór saponiny zgodnie z opisem w manuskrypcie.Pobrać dodatkowe DPBS do 20-mililitrowej strzykawki do użycia na etapach mycia. Przykryj rurkę folią aluminiową. Dodać nitkowaty odczynnik falloidyny do barwienia aktyny i odczynnik Hoechsta do barwienia jądra do 0,1% roztworu saponiny.Następnie przenieść roztwór do strzykawki pokrytej folią. Przepłukać linię odpływową niewielką ilością roztworu przepuszczalnego i barwiącego. Następnie wprowadź dwa mililitry roztworu do kanału mikroprzepływowego.Przykryj kanał folią aluminiową, aby zablokować światło. Po 30 minutach przepłukać roztwór przepuszczalny dwoma mililitrami DPBS dwa razy przez pięć minut każdy, a następnie delikatnie wysuszyć kanał. Za pomocą mikropipety wprowadź minimalną ilość miękko ustawionego środka mocującego zapobiegającego blaknięciu do kanału mikroprzepływowego, upewniając się, że całkowicie pokryje dolną powierzchnię.Następnie uszczelnij koniec do kanału. Za pomocą mikroskopu jasnego pola szybko sprawdź integralność warstwy komórkowej przed przechowywaniem kanału w pojemniku w celu ochrony przed światłem. Testuj lokalizacje obrazowania, wykonując skany referencyjne i stosy z, aż do spełnienia żądanych parametrów i warunków obrazu.Używając płyty podstawy tablicy przepływowej jako odniesienia, skonstruuj stosy z w różnych miejscach wzdłuż kanału. Na koniec przeanalizuj dane przekrojowe, dane mapy głębokości i wszelkie inne istotne cechy, aby ocenić właściwości warstwy komórek. Skuteczne zastosowanie tej techniki wykazano w środowisku dynamicznej hodowli mikroprzepływowej poprzez akwizycję obrazu w odległości co najmniej jednego centymetra od wlotu i wylotu.W reprezentatywnym eksperymencie czasu trwania hodowli zaobserwowano udaną produkcję jednowarstwową, gdy komórki były hodowane przez 24 godziny. Jednak podczas hodowli przez 48 godzin zaobserwowano niepożądane tworzenie się wielowarstw. Dane zebrane z każdej z pięciu lokalizacji obrazowania kanałów mikroprzepływowych ujawniają również związek między wydłużonym czasem trwania hodowli a zwiększonym obszarem przekroju poprzecznego, co sugeruje, że nierównomierne tworzenie się warstw lub przerost następuje w ciągu 48 godzin od hodowli.Uzyskano mapę głębokości centralnego miejsca w kanale mikroprzepływowym hodowanym przez 24 godziny, która jest przydatna do jakościowej oceny charakterystyki warstw. Trzy najważniejsze aspekty tego protokołu to prawidłowa budowa kanałów, dokładne warunki hodowli i przepływu pożywki oraz ostrożne korzystanie z aparatu do utrwalania i barwienia. Zgodnie z tą procedurą, inne metody mogą być stosowane równolegle w celu walidacji eksperymentalnej żywotności wytworzonych monowarstw komórek, takich jak wykrywanie impedancji elektrycznej komórki-substratu, ECIS lub transepiteliczny opór elektryczny, TEER.

preparation-structural-evaluation-epithelial-cell-monolayers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Trójwymiarowe (3D) systemy komórkowe są istotnymi modelami do badania organogenezy. Zaproponowano metodę wytwarzania torbieli żółciowych opartą na hydrożelu i ich charakterystykę. Protokół ten odkrywa bariery w charakteryzacji 3D, dzięki prostej i niezawodnej metodzie oceny wydajności tworzenia torbieli, rozmiarów i testowania ich funkcjonalności.

Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.

Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj metodę barwienia falloidyną do oceny monowarstw komórek nabłonka płuc w mikroprzepływowym urządzeniu hodowlanym. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórek w warunkach dynamicznych.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów