Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej
July 1st, 2022
Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.
Protokół ten służy obniżeniu bariery wejścia dla eksperymentów z hodowlami komórkowymi i umożliwia naukowcom ocenę i scharakteryzowanie przylegających monowarstw komórkowych hodowanych w dynamicznych środowiskach mikroprzepływowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona zarówno jakościową, jak i ilościową ocenę charakterystyki monowarstwy komórkowej, która służy jako podstawa do dalszych eksperymentów zależnych od monowarstw. Metoda ta umożliwia rekapitulację nabłonka wyrostka zębodołowego in vitro, umożliwiając zbadanie dynamicznych reakcji podczas zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), a także uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem (VILI).
Aby rozpocząć, uzyskaj jednokanałową tablicę przepływu. Oczyść powierzchnię szkła nakrywkowego w kąpieli ultradźwiękowej. Zanurz szkło nakrywkowe w poli-d-lizynie w temperaturze pokojowej na pięć minut.
Następnie suszyć w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przymocuj dwustronne kleje w przekładkach Mylar. Przyciąć laserowo zgodnie z opisem w manuskrypcie do szkła nakrywkowego i upewnić się, że wycięcia kanałów są dokładnie wyrównane.
Przymocuj prostokątną szklaną szklankę nakrywkową do najniższego paska samoprzylepnego. Użyj oklejonych papierów samoprzylepnych, aby przykryć części kleju, które są nadal odsłonięte. Po zakończeniu montażu należy mocno i równomiernie docisnąć konstrukcję.
Za pomocą strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną przepłukać kanał. Sterylizuj obudowę kanału w sterylizatorze ultrafioletowym przez 30 minut. Stosując sterylną technikę, potraktuj kanał roztworem ludzkiej fibronektyny przygotowanym w PBS i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym przygotować zawiesinę komórek NCI H441 przy użyciu pożywki RPMI 1640 z 10% FBS. Użyj 0,25 mililitra tej zawiesiny komórek, aby wypełnić kanał i część portów. Za pomocą mikroskopii jasnego pola sprawdź, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone w kanałach.
Dodaj zbiornik mediów i kran do kanału. Rozpocznij hodowlę kanału w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Użyj programowalnej pompy strzykawkowej, aby wyciągnąć zużyte media z kanału i świeże media do kanału ze sterylnego zbiornika mediów podłączonego do wlotu kanału.
W dygestorium chemicznym rozcieńczyć 4% roztwór formaldehydu w DPBS, aby uzyskać 1% roztwór i przechowywać w odpowiednio oznakowanej tubie. Przygotuj 2% roztwór formaldehydu w podobny sposób. Przenieś roztwory formaldehydu do odpowiednio oznakowanych pięciomililitrowych strzykawek.
Pobrać 20 mililitrów DPBS do oddzielnej strzykawki o pojemności 20 mililitrów, która będzie używana do etapów mycia. Następnie należy usunąć kanał mikroprzepływowy z aparatu hodowlanego i zabezpieczyć go w okapie oparów chemicznych. Aby zmontować aparat do utrwalania i barwienia, należy przymocować segment rurki przesyłowej do bocznego portu trójdrogowego kurka za pomocą męskiej blokady Luer do adaptera zadzioru węża.
Następnie podłącz kran do portu wlotowego układu przepływowego. Podłącz kolejny segment rurki przesyłowej do portu wylotowego istniejącego kranu za pomocą tego samego typu adaptera króćca węża. Na koniec zabezpiecz wolne końce obu rurek przesyłowych, które są teraz oznaczone jako przewody odpadowe, w pojemniku na odpady odpowiednie dla substancji chemicznych i zagrożeń biologicznych.
Upewnij się, że kran odcinający blokuje port wlotowy układu przepływowego i przepłucz przewód odpływowy za pomocą DPBS. Następnie przekręć kurek, aby zablokować linię odpływową i powoli umyj komórki dwoma mililitrami DPBS. Powoli przepchnij dwa mililitry 1% utrwalacza przez kanał.
Pozostaw na pięć minut i powtórz z 2% utrwalaczem. Następnie umyj komórki trzykrotnie świeżym DPBS, jak pokazano wcześniej. Przygotować 0,1% roztwór saponiny zgodnie z opisem w manuskrypcie.
Pobrać dodatkowe DPBS do 20-mililitrowej strzykawki do użycia na etapach mycia. Przykryj rurkę folią aluminiową. Dodać nitkowaty odczynnik falloidyny do barwienia aktyny i odczynnik Hoechsta do barwienia jądra do 0,1% roztworu saponiny.
Następnie przenieść roztwór do strzykawki pokrytej folią. Przepłukać linię odpływową niewielką ilością roztworu przepuszczalnego i barwiącego. Następnie wprowadź dwa mililitry roztworu do kanału mikroprzepływowego.
Przykryj kanał folią aluminiową, aby zablokować światło. Po 30 minutach przepłukać roztwór przepuszczalny dwoma mililitrami DPBS dwa razy przez pięć minut każdy, a następnie delikatnie wysuszyć kanał. Za pomocą mikropipety wprowadź minimalną ilość miękko ustawionego środka mocującego zapobiegającego blaknięciu do kanału mikroprzepływowego, upewniając się, że całkowicie pokryje dolną powierzchnię.
Następnie uszczelnij koniec do kanału. Za pomocą mikroskopu jasnego pola szybko sprawdź integralność warstwy komórkowej przed przechowywaniem kanału w pojemniku w celu ochrony przed światłem. Testuj lokalizacje obrazowania, wykonując skany referencyjne i stosy z, aż do spełnienia żądanych parametrów i warunków obrazu.
Używając płyty podstawy tablicy przepływowej jako odniesienia, skonstruuj stosy z w różnych miejscach wzdłuż kanału. Na koniec przeanalizuj dane przekrojowe, dane mapy głębokości i wszelkie inne istotne cechy, aby ocenić właściwości warstwy komórek. Skuteczne zastosowanie tej techniki wykazano w środowisku dynamicznej hodowli mikroprzepływowej poprzez akwizycję obrazu w odległości co najmniej jednego centymetra od wlotu i wylotu.
W reprezentatywnym eksperymencie czasu trwania hodowli zaobserwowano udaną produkcję jednowarstwową, gdy komórki były hodowane przez 24 godziny. Jednak podczas hodowli przez 48 godzin zaobserwowano niepożądane tworzenie się wielowarstw. Dane zebrane z każdej z pięciu lokalizacji obrazowania kanałów mikroprzepływowych ujawniają również związek między wydłużonym czasem trwania hodowli a zwiększonym obszarem przekroju poprzecznego, co sugeruje, że nierównomierne tworzenie się warstw lub przerost następuje w ciągu 48 godzin od hodowli.
Uzyskano mapę głębokości centralnego miejsca w kanale mikroprzepływowym hodowanym przez 24 godziny, która jest przydatna do jakościowej oceny charakterystyki warstw. Trzy najważniejsze aspekty tego protokołu to prawidłowa budowa kanałów, dokładne warunki hodowli i przepływu pożywki oraz ostrożne korzystanie z aparatu do utrwalania i barwienia. Zgodnie z tą procedurą, inne metody mogą być stosowane równolegle w celu walidacji eksperymentalnej żywotności wytworzonych monowarstw komórek, takich jak wykrywanie impedancji elektrycznej komórki-substratu, ECIS lub transepiteliczny opór elektryczny, TEER.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje technikę barwienia opartą na falloidynie do wizualizowania warstw komórek przylegających z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skaningowej laserowej (CLSM). Ułatwia ocenę skupienia i jednorodności warstw komórek zarówno w mikrofluidycznych, jak i statycznych środowiskach hodowli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Mikrofluidyka
Tło
- Eksperymenty z hodowlą komórek są niezbędne dla różnych badań biologicznych.
- Dynamiczne środowiska mikrofluidyczne mogą lepiej naśladować warunki fizjologiczne.
- Ocena monowarstw komórek jest kluczowa dla zrozumienia reakcji komórkowych.
- Ta metoda pomaga w badaniu stanów takich jak ARDS i VILI.
Cel badania
- Obniżenie barier dla badaczy w eksperymentach z hodowlą komórek.
- Umożliwienie jakościowej i ilościowej oceny monowarstw komórek.
- Ułatwienie dalszych eksperymentów zależnych od monowarstwy.
Zastosowane metody
- Barwienie falloidyną do wizualizowania filamentów aktynowych.
- Konfokalna mikroskopia skaningowa laserowa (CLSM) do obrazowania.
- Wykorzystanie pojedynczych kanałów przepływowych do dynamicznej hodowli.
- Przygotowanie szkiełka pokrywowego z poli-d-lizynę do przyczepiania komórek.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja przylegających warstw komórek w różnych warunkach hodowli.
- Ocena skupienia warstw komórek i jednorodności grubości.
- Wgląd w reakcje komórkowe podczas ostrych stanów układu oddechowego.
- Ustanowienie niezawodnej metody badania nabłonka pęcherzykowego in vitro.
Wnioski
- Ta technika zapewnia solidne ramy dla badań hodowli komórek.
- Poprawia zrozumienie zachowania komórek w dynamicznych środowiskach.
- Metoda jest przydatna dla różnych dziedzin badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing uniform epithelial cell monolayers in physiologically relevant microfluidic devices is critical for predictive modeling of lung barrier function and injury mechanisms. This protocol enables quantitative and qualitative assessment of monolayer integrity, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in respiratory disease research. Reliable monolayer evaluation underpins translational continuity from discovery through preclinical model development for conditions such as ARDS and VILI.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous assessment of epithelial barrier formation in microphysiological systems.
- Supports mechanistic de-risking by confirming monolayer uniformity prior to functional assays.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of lung injury pathways in vitro.
Screening & Assay Development
- Provides standardized imaging and quantification of cell layer confluency for assay readiness.
- Ensures reproducibility and comparability across microfluidic and static culture platforms.
- Delivers quantitative outputs for downstream compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro barrier models with disease-relevant lung microenvironments.
- Enables continuity from cell-based discovery to preclinical validation of respiratory therapeutics.
- Supports risk-adjusted advancement by confirming model fidelity before functional testing.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model qualification, providing a foundation for lead identification and mechanistic studies in respiratory research.
- Discovery Biology: Validates epithelial monolayer formation to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Confirms assay readiness through quantitative imaging and layer uniformity metrics.
- Analytics: Generates reproducible structural data for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by ensuring physiological relevance of cell layers.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse lung cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in barrier function studies and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across microfluidic culture experiments.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by ensuring model fidelity before functional or screening assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory disease programs through robust model qualification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly and cell culture techniques.
- Needs access to confocal microscopy and quantitative image analysis tools.
- Demands cross-team standardization of channel construction and staining protocols.
- Adaptable to various epithelial cell types with protocol optimization.
- Dependent on precise control of culture duration and media flow to avoid multilayer formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Microfluidic Channel Fabrication and Pre‐Treatment
1:49
Cell Culture in the Microfluidic Channel
2:35
Cell Fixation
4:11
Cell Staining and Mounting
5:25
Cell Imaging with Confocal Microscopy
5:55
Results: Culture Duration Effects on Monolayer Production
6:52
Conclusion
