Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Protokół ten służy obniżeniu bariery wejścia dla eksperymentów z hodowlami komórkowymi i umożliwia naukowcom ocenę i scharakteryzowanie przylegających monowarstw komórkowych hodowanych w dynamicznych środowiskach mikroprzepływowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona zarówno jakościową, jak i ilościową ocenę charakterystyki monowarstwy komórkowej, która służy jako podstawa do dalszych eksperymentów zależnych od monowarstw. Metoda ta umożliwia rekapitulację nabłonka wyrostka zębodołowego in vitro, umożliwiając zbadanie dynamicznych reakcji podczas zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), a także uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem (VILI).

Aby rozpocząć, uzyskaj jednokanałową tablicę przepływu. Oczyść powierzchnię szkła nakrywkowego w kąpieli ultradźwiękowej. Zanurz szkło nakrywkowe w poli-d-lizynie w temperaturze pokojowej na pięć minut.

Następnie suszyć w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przymocuj dwustronne kleje w przekładkach Mylar. Przyciąć laserowo zgodnie z opisem w manuskrypcie do szkła nakrywkowego i upewnić się, że wycięcia kanałów są dokładnie wyrównane.

Przymocuj prostokątną szklaną szklankę nakrywkową do najniższego paska samoprzylepnego. Użyj oklejonych papierów samoprzylepnych, aby przykryć części kleju, które są nadal odsłonięte. Po zakończeniu montażu należy mocno i równomiernie docisnąć konstrukcję.

Za pomocą strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną przepłukać kanał. Sterylizuj obudowę kanału w sterylizatorze ultrafioletowym przez 30 minut. Stosując sterylną technikę, potraktuj kanał roztworem ludzkiej fibronektyny przygotowanym w PBS i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym przygotować zawiesinę komórek NCI H441 przy użyciu pożywki RPMI 1640 z 10% FBS. Użyj 0,25 mililitra tej zawiesiny komórek, aby wypełnić kanał i część portów. Za pomocą mikroskopii jasnego pola sprawdź, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone w kanałach.

Dodaj zbiornik mediów i kran do kanału. Rozpocznij hodowlę kanału w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Użyj programowalnej pompy strzykawkowej, aby wyciągnąć zużyte media z kanału i świeże media do kanału ze sterylnego zbiornika mediów podłączonego do wlotu kanału.

W dygestorium chemicznym rozcieńczyć 4% roztwór formaldehydu w DPBS, aby uzyskać 1% roztwór i przechowywać w odpowiednio oznakowanej tubie. Przygotuj 2% roztwór formaldehydu w podobny sposób. Przenieś roztwory formaldehydu do odpowiednio oznakowanych pięciomililitrowych strzykawek.

Pobrać 20 mililitrów DPBS do oddzielnej strzykawki o pojemności 20 mililitrów, która będzie używana do etapów mycia. Następnie należy usunąć kanał mikroprzepływowy z aparatu hodowlanego i zabezpieczyć go w okapie oparów chemicznych. Aby zmontować aparat do utrwalania i barwienia, należy przymocować segment rurki przesyłowej do bocznego portu trójdrogowego kurka za pomocą męskiej blokady Luer do adaptera zadzioru węża.

Następnie podłącz kran do portu wlotowego układu przepływowego. Podłącz kolejny segment rurki przesyłowej do portu wylotowego istniejącego kranu za pomocą tego samego typu adaptera króćca węża. Na koniec zabezpiecz wolne końce obu rurek przesyłowych, które są teraz oznaczone jako przewody odpadowe, w pojemniku na odpady odpowiednie dla substancji chemicznych i zagrożeń biologicznych.

Upewnij się, że kran odcinający blokuje port wlotowy układu przepływowego i przepłucz przewód odpływowy za pomocą DPBS. Następnie przekręć kurek, aby zablokować linię odpływową i powoli umyj komórki dwoma mililitrami DPBS. Powoli przepchnij dwa mililitry 1% utrwalacza przez kanał.

Pozostaw na pięć minut i powtórz z 2% utrwalaczem. Następnie umyj komórki trzykrotnie świeżym DPBS, jak pokazano wcześniej. Przygotować 0,1% roztwór saponiny zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Pobrać dodatkowe DPBS do 20-mililitrowej strzykawki do użycia na etapach mycia. Przykryj rurkę folią aluminiową. Dodać nitkowaty odczynnik falloidyny do barwienia aktyny i odczynnik Hoechsta do barwienia jądra do 0,1% roztworu saponiny.

Następnie przenieść roztwór do strzykawki pokrytej folią. Przepłukać linię odpływową niewielką ilością roztworu przepuszczalnego i barwiącego. Następnie wprowadź dwa mililitry roztworu do kanału mikroprzepływowego.

Przykryj kanał folią aluminiową, aby zablokować światło. Po 30 minutach przepłukać roztwór przepuszczalny dwoma mililitrami DPBS dwa razy przez pięć minut każdy, a następnie delikatnie wysuszyć kanał. Za pomocą mikropipety wprowadź minimalną ilość miękko ustawionego środka mocującego zapobiegającego blaknięciu do kanału mikroprzepływowego, upewniając się, że całkowicie pokryje dolną powierzchnię.

Następnie uszczelnij koniec do kanału. Za pomocą mikroskopu jasnego pola szybko sprawdź integralność warstwy komórkowej przed przechowywaniem kanału w pojemniku w celu ochrony przed światłem. Testuj lokalizacje obrazowania, wykonując skany referencyjne i stosy z, aż do spełnienia żądanych parametrów i warunków obrazu.

Używając płyty podstawy tablicy przepływowej jako odniesienia, skonstruuj stosy z w różnych miejscach wzdłuż kanału. Na koniec przeanalizuj dane przekrojowe, dane mapy głębokości i wszelkie inne istotne cechy, aby ocenić właściwości warstwy komórek. Skuteczne zastosowanie tej techniki wykazano w środowisku dynamicznej hodowli mikroprzepływowej poprzez akwizycję obrazu w odległości co najmniej jednego centymetra od wlotu i wylotu.

W reprezentatywnym eksperymencie czasu trwania hodowli zaobserwowano udaną produkcję jednowarstwową, gdy komórki były hodowane przez 24 godziny. Jednak podczas hodowli przez 48 godzin zaobserwowano niepożądane tworzenie się wielowarstw. Dane zebrane z każdej z pięciu lokalizacji obrazowania kanałów mikroprzepływowych ujawniają również związek między wydłużonym czasem trwania hodowli a zwiększonym obszarem przekroju poprzecznego, co sugeruje, że nierównomierne tworzenie się warstw lub przerost następuje w ciągu 48 godzin od hodowli.

Uzyskano mapę głębokości centralnego miejsca w kanale mikroprzepływowym hodowanym przez 24 godziny, która jest przydatna do jakościowej oceny charakterystyki warstw. Trzy najważniejsze aspekty tego protokołu to prawidłowa budowa kanałów, dokładne warunki hodowli i przepływu pożywki oraz ostrożne korzystanie z aparatu do utrwalania i barwienia. Zgodnie z tą procedurą, inne metody mogą być stosowane równolegle w celu walidacji eksperymentalnej żywotności wytworzonych monowarstw komórek, takich jak wykrywanie impedancji elektrycznej komórki-substratu, ECIS lub transepiteliczny opór elektryczny, TEER.