Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym
6 września 2024
Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.
Chcieliśmy zaprojektować prosty, niedrogi sposób hodowli bakterii utleniających metan w laboratorium, który bardziej przypomina środowisko naturalne. Chcieliśmy to zrobić, aby odkryć fenotypy bakteryjne, których brakuje w standardowych warunkach hodowli laboratoryjnej, i ostatecznie powiązać te fenotypy z ich determinantami genetycznymi. Strzykawka gradientowa jest uproszczoną wersją wcześniej opisanych metod hodowli melanotrofu w przeciwgradiencie metanowo-tlenowym.
Ta metoda nie wymaga ciągłych przepływów substratów gazowych, co pozwala na równoległe uruchamianie wielu powtórzeń. Możemy również wykonywać testy biochemiczne bezpośrednio na bakteriach hodowanych w agarozie. Naukowcy mają praktycznie nieograniczony dostęp do sekwencji genomu bakteryjnego, ale nadal trudno jest umieścić wszystkie te informacje w kontekście.
Nasze odkrycia pokazują, że kluczowe znaczenie ma uwzględnienie środowiska, w którym wyewoluowała bakteria, aby lepiej zrozumieć rolę poszczególnych genów. Planujemy wykorzystać techniki takie jak metabolomika porównawcza i proteomika, aby dowiedzieć się więcej o tym, jak melanotrofy reagują na swoje położenie w gradiencie licznika metan-tlen. Planujemy również wyhodować wiele szczepów w tej samej strzykawce gradientowej, aby zobaczyć, jak oddziałują na siebie w kontekście rozdzielczości przestrzennej.
Na początek zdobądź płytkę hodowlaną z koloniami gatunku methylomonas LW13. Zaszczepić kolonie w sześciu mililitrach pożywki z solami mineralnymi azotanów w szklanej probówce, uszczelnić probówkę korkiem do surowicy i aluminiową uszczelką zaciskaną. Dodaj metan za pomocą strzykawki, aby uzyskać końcową atmosferę o zawartości 50% objętości metanu w powietrzu.
Potrząśnij tą płynną kulturą planktonu z prędkością 200 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej, aż stanie się mętna, co zajmuje około jednego dnia. Płynne kultury należy przepuścić w stosunku od 1 do 10 do świeżych pożywek. Kontynuuj hodowlę płynnych kultur melanotrofu do logarytmicznego wzrostu fazowego, osiągając gęstość optyczną przy 600 nanometrach około 0,5.
Aby przygotować strzykawkę, należy usunąć dołączone tłoki i umieścić ją w sterylnym pojemniku. Do każdej strzykawki przymocuj sterylną końcówkę filtra z politetrafluoroetylenu lub PTFE i umieść strzykawkę w standardowym stojaku na probówki końcówką skierowaną w dół. Następnie wymieszaj jeden mililitr komórek z pięcioma mililitrami pożywki z soli mineralnych azotanu i czterema mililitrami stopionej agarozy w sterylnej stożkowej probówce.
Powoli wlej mieszaninę agarozy do strzykawki do oznaczenia ośmiu mililitrów i pozwól jej zastygnąć. Po około 15 minutach zakryć strzykawkę sterylnym korkiem z gumy butylowej o grubości 20 milimetrów. Zabezpieczyć korek taśmą laboratoryjną i oznaczyć strzykawkę.
Następnie napełnij dużą 60-mililitrową strzykawkę 100% metanem i przymocuj końcówkę filtra PTFE podłączoną do sterylnej igły o rozmiarze 23. Przekłuć dużą strzykawką gumowy korek strzykawki z mieszaniną agarozy i wprowadzić drugą sterylną igłę jako wylot gazu. Wcisnąć tłok dużej strzykawki, aby 20 mililitrów 100% metanu przepłukało się przez przestrzeń nad głową.
Wyjąć igłę wylotową, gdy w strzykawce pozostał od jednego do dwóch mililitrów metanu, aby zapobiec cofaniu się tlenu. Inkubować strzykawkę z mieszaniną agarozy i metanu w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Aby wytłoczyć agarozę, zastąp końcówkę filtra PTFE sterylną igłą o rozmiarze 23, a gumowy korek dostarczonym tłokiem strzykawki.
Powoli wciśnij tłok, aby dozować porcje o mililitr do oddzielnych sterylnych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1.5 mililitra. Dziki szczep LW13 tworzył wyraźny poziomy pas na określonej głębokości w strzykawce gradientowej, gdzie zarówno stężenie metanu, jak i tlenu było niskie. LW13 zaszczepiony w strzykawkach gradientowych wykazywał gradient przeciwbieżny metanowo-tlenowy z ubytkiem metanu i zużyciem tlenu odpowiadającym głębokości pasma poziomego.
Mutant delecji OAT LW13 nie miał wyraźnego poziomego tworzenia pasm obserwowanego w szczepie typu dzikiego, co wskazuje na rolę genu w tym fenotypie. Na początek należy uzyskać ekstrudowane segmenty agarozy ze strzykawek gradientowych zaszczepionych typem dzikim lub zmutowanym gatunkiem methylomonas LW13. Dodaj 0,75 mililitra 0,85% chlorku sodu w wodzie do wytłaczanej próbki agarozy i homogenizuj przez wirowanie.
Następnie rozcieńczyć próbkę od 1 do 10 w nowej mikroprobówce wirówkowej z 900 mikrolitrami roztworu soli. Inkubować próbki z trzema mikrolitrami mieszaniny jeden do jednego barwienia SYTO 9 i jodku propidyny w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby określić liczbę komórek na mililitr agarozy, należy poddać sonikę zawiesiny kulek zliczających mikrosfery w łaźni wodnej przez pięć minut.
Następnie dodać 10 mikrolitrów zawiesiny do próbki przed analizą cytometrii przepływowej. Analizuj próbki za pomocą cystometru przepływowego. Porównaj wykresy punktowe rozproszenia bocznego i rozproszenia do przodu między bezkomórkowymi próbkami kontrolnymi a zaszczepionymi próbkami agarozy, aby narysować bramki napięcia zdarzeń bakteryjnych, które wykluczają cząstki agarozy tła.
Aby policzyć jednostki tworzące kolonie w strzykawce gradientowej, dodaj 800 mikrolitrów pożywki z solami mineralnymi azotanu do wytłaczanego segmentu agarozy i wiruj przez 10 sekund, aby pomóc w pieszczotach pi. Przygotuj sterylną 96-dołkową płytkę ze 180 mikrolitrami azotanowych soli mineralnych w każdym dołku. Dodać 20 mikrolitrów rozcieńczonej próbki agarozy do każdego dołka w pierwszej kolumnie i wymieszać.
Za pomocą pipety wielokanałowej rozcieńczyć seryjnie 20 mikrolitrów próbek dziesięciokrotnie, zaczynając od pierwszego rzędu studzienek. Oznacz kwadratową płytę siatkową zawierającą azotany, sole mineralne, ślimak lub wybrane media. Za pomocą pipety wielokanałowej natrzyj pięć mikrolitrów z kolumny płytki 96-dołkowej na płytkę ślimakową.
Cytometria przepływowa, wykorzystująca ekstrudowane próbki agarozy, potwierdziła, że mutant delecji OAT LW13 wykazywał zmniejszony wzrost komórek w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Uzupełnienie mutanta genem OAT przywróciło liczbę komórek i tworzenie prążków do poziomów podobnych do typu dzikiego, co wskazuje na specyficzną rolę genu w tworzeniu prążków.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół tworzenia modelowego ekosystemu, który symuluje przeciwstawny gradient metanu i tlenu występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan. Układ ten umożliwia badanie fizjologii bakterii w sposób rozdzielony przestrzennie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Nauki o środowisku
- Biochemia
Wstęp
- Tlenowe bakterie utleniające metan odgrywają kluczową rolę w cyklu metanu.
- Standardowe warunki laboratoryjne często nie pozwalają na odtworzenie środowisk naturalnych.
- Zrozumienie fenotypów bakteryjnych wymaga kontekstu ich naturalnych siedlisk.
- Poprzednie metody hodowli tych bakterii były złożone i zasobożerne.
Cel badania
- Opracowanie prostej i kosztowo efektywnej metody hodowli bakterii utleniających metan.
- Ujawnienie fenotypów, które nie są obserwowalne w standardowych warunkach laboratoryjnych.
- Powiązanie tych fenotypów z ich determinantami genetycznymi.
Zastosowane metody
- Przygotowanie strzykawki gradientowej w celu utworzenia przeciwgradientu metanu i tlenu.
- Inokulacja gatunku Methylomonas LW13 w mineralnym podłożu solnym z azotanem.
- Analiza cytometryczna w celu oceny wzrostu i żywotności komórek.
- Analizy biochemiczne przeprowadzone bezpośrednio na bakteriach hodowanych w agarozie.
Główne wyniki
- Szczep dziki LW13 utworzył wyraźny poziomy pas w gradiencie, co wskazuje na prawidłowy wzrost.
- Mutant z delecją OAT wykazał ograniczony wzrost i brak formowania się pasa, co podkreśla rolę tego genu.
- Komplementacja mutanta genem OAT przywróciła prawidłowe wzorce wzrostu.
- Wyniki podkreślają znaczenie kontekstu środowiskowego w rozumieniu genetyki bakterii.
Wnioski
- Opracowany protokół umożliwia badanie bakterii utleniających metan w warunkach bardziej zbliżonych do naturalnych.
- Uzyskane informacje mogą posłużyć do prowadzenia badań genetycznych i metabolicznych tych bakterii.
- Model ten można dostosować do badania interakcji między wieloma szczepami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kultywacja metanotrofów z rozdzielczością przestrzenną przy użyciu opartego na agarozie przeciwprądu metanu i tlenu umożliwia zespołom na etapie odkrywania badanie fenotypów mikrobiologicznych, które są maskowane w kulturach homogenicznych. Ten modelowy ekosystem wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez łączenie kontekstu środowiskowego z relacjami genotyp-fenotyp, bezpośrednio dostarczając informacji do walidacji celów i genomiki funkcjonalnej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w portfelach badawczo-rozwojowych biofarmacji skoncentrowanych na metabolizmie mikrobiologicznym, biotechnologii środowiskowej oraz zastosowaniach biologii syntetycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną genów mikrobialnych w warunkach fizjologicznie istotnych gradientów.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie fenotypów niewidocznych w standardowych hodowlach.
- Ułatwia mapowanie genotypu na fenotyp w celu priorytetyzacji mikrobialnych celów terapeutycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalną platformę do ilościowych analiz biochemicznych w matrycy półstałej.
- Umożliwia bezpośredni pomiar wzrostu i żywotności komórek przy użyciu cytometrii przepływowej oraz zliczania jednostek tworzących kolonie.
- Umożliwia zrównoleglone i skalowalne przesiewanie szczepów typu dzikiego oraz mutantów w kontrolowanych gradientach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie fenotypowania drobnoustrojów do istotności środowiskowej w celu odkrycia translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od fazy odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez zachowanie kontekstu przestrzennego i chemicznego.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnym etapie z powodu zależnej od kontekstu funkcji genów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model gradientowy oparty na agarozie znajduje zastosowanie na etapie przejściowym między wczesnym odkrywaniem a identyfikacją wiodących związków, umożliwiając badanie funkcji drobnoustrojów w oparciu o postawione hipotezy oraz wspierając rozwój dalszych testów analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotezy zerowej w odniesieniu do funkcji genów w środowiskach o strukturze przestrzennej.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników do analizy porównawczej szczepów i mutantów.
- Analityka: Integruje cytometrię przepływową i liczenie kolonii w celu rzetelnego pomiaru zmiennych zależnych.
- Badania translacyjne: Zachowuje wierność środowiskową, aby wspierać dopasowanie biomarkerów i istotność modeli przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje modularny, adaptowalny system dla różnorodnych badań mikrobiologicznych i środowiskowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w relacjach genotyp-fenotyp oraz w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w zakresie hodowli i analiz z rozdzielczością przestrzenną w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez ujawnianie funkcji mikrobiologicznych zależnych od kontekstu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków mikrobiologicznych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli mikroorganizmów oraz modelowaniu gradientów przestrzennych.
- Wymaga dostępu do infrastruktury do cytometrii przepływowej, liczenia kolonii oraz analiz biochemicznych.
- Wymaga standaryzacji protokołów analiz i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych systemów mikrobiologicznych, lecz może wymagać optymalizacji dla różnych gatunków lub gradientów.
- Ograniczona do fenotypów obserwowalnych w matrycy agarozowej i określonych warunkach gradientu.
