Name: Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Poznaj izolację ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych z pępowiny o wysokim poziomie BAMBI i MFGE8. Ta metoda pozwala analizować ich transkryptomiczny profil i funkcje w celu poprawy skuteczności terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 82271843).

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1989 roku i zatwierdzone przez Komitet Etyki w Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School (numer zatwierdzenia: 202019701). Ludzkie pępowiny zostały pozyskane od zdrowych matek w Szpitalu Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School po naturalnym porodzie, które wyraziły świadomą zgodę na ich wykorzystanie w tej pracy. Pierwotne UC-MSC zostały wyizolowane z ludzkiej pępowiny, jak wcześniej informowano11.
1. Kultura i identyfikacja UC-MSC przed izolacją
<ol>
	<li>Gdy MSCs osiągną 70-80% konfluencji (P0), przemyj komórki raz PBS i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj 9 ml kompletnej pożywki, aby zneutralizować trypsynę, przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 300 × g przez 5 minut, aby zebrać komórki. Odrzucić supernatant i dodać odpowiednią kompletną pożywkę w celu ponownego zawieszenia komórek. Przenieść komórki z każdej płytki do trzech kolb T75 (P1) i hodować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po przejściu UC-MSCs 2x poprzez trypsynizację, w P3, zbierz komórki, wykonując te same czynności, które opisano w kroku 1.1. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w buforze barwiącym FACS (1x PBS zawierający 2% FBS) i policz je. Dodać bufor barwiący FACS do końcowego stężenia 5-10 × 106 komórek/ml i utrzymywać zawiesinę komórek na lodzie.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl na probówkę tej zawiesiny komórek do różnych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodać kontrole izotypu i przeciwciała FACS przeciwko CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 i HLA-DR (wszystkie w stosunku 1:200) do komórek w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Przemyć komórki 2x buforem barwiącym FACS i odwirować w stężeniu 300 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osady w 200 μl buforu barwiącego FACS do analizy cytometrii przepływowej w celu identyfikacji markerów MSC.</li>
</ol>
2. Izolacja BAMBIo wysokim MFGE8 UC-MSC za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Hodowla UC-MSC do gęstości około 5-10 × 106 komórek podczas izolowania BAMBIo wysokiejMFGE8UC-MSC. Oddziel komórki za pomocą 0,5 mM EDTA przez 5 minut, aż zaczną mieć okrągłą morfologię, dodaj całe podłoże, aby przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odpipetuj zawiesinę komórkową kilka razy w górę iw dół, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową. Użyć 10 μl zawiesiny komórek, aby policzyć komórki i obliczyć całkowitą liczbę pobranych komórek. Odwirować stożkową probówkę z zawiesiną komórek o masie 300 × g przez 5 minut w celu zebrania komórek.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki do końcowego stężenia 5-10 × 106 komórek/ml i utrzymać zawiesinę komórkową na lodzie.</li>
	<li>Podzielić komórki na cztery probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (tylko ślepe komórki; Komórki znakowane BAMBI; Komórki znakowane MFGE8; i zarówno komórki znakowane BAMBI, jak i MFGE8).</li>
	<li>Dodać przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich stężeniach (MFGE8 i BAMBI, oba w stosunku 1:100) do probówek, wymieszać i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Umyj oznaczone komórki raz 1x PBS i odwiruj w 300×g przez 5 minut. Wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki, dodać sprzężone fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe (kozie przeciwciała anty-królicze IgG H&L Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 647, wszystkie w stosunku 1: 1,000) do komórek, wymieszać i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.</li>
	<li>Umyj oznaczone komórki raz 1x PBS, jak opisano w kroku 2.5. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl kompletnej pożywki, przefiltrować przez sitko komórkowe o pojemności 70 μm w celu wyeliminowania grudek i zanieczyszczeń, a następnie przenieść filtrat do probówki o pojemności 15 ml w celu sortowania metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Uruchom probówkę ze ślepą krwią bez dodawania przeciwciała (kontrola ujemna) i dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), aby zabramować skalę populacji ujemnej za pomocą barwienia przeciwciałami.</li>
	<li>Uruchom pojedyncze probówki komórkowe znakowane przeciwciałami (tj. MFGE8 + kozia anty-królicza IgG H&L Alexa Fluor 488 lub BAMBI + kozia anty-królicza IgG H&L Alexa Fluor 647) jako kontrolę bramkowania, aby określić, gdzie zaczyna się dodatniość na wykresie.</li>
	<li>Uruchom eksperymentalną probówkę (probówki) z próbkami, aby posortować i zebrać populację komórek owysokiej zawartościMFGE8 BAMBI.</li>
	<li>Posortowane MSC BAMBIo wysokiejMFGE8 należy umieścić na płytce 24-dołkowej i hodować komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy posortowane MSC BAMBIo wysokiejMFGE8 rosły przez dwa pasaże, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, należy rozdzielić komórki i przeprowadzić analizę po sortowaniu, aby zapewnić czystość posortowanych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w krokach 2.1-2.9. Alternatywnie, zbadaj czystość posortowanych komórek za pomocą konwencjonalnej immunofluorescencji przeciwko ludzkiej ekspresji BAMBI i MFGE8, jeśli liczba pobranych komórek jest zbyt mała.</li>
</ol>
3. Charakterystyka wysokich MSCs BAMBI MFGE8 
<ol>
	<li>Hoduj posortowane MSCsBAMBI o wysokiej MFGE8na 12-dołkowej płytce, zbadaj ich morfologię komórek pod mikroskopem i porównaj je z morfologią niesortowanych MSCs. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, komórki BAMBIo wysokiejzawartości MFGE8 rosną szybciej niż niesortowane UC-MSC.</li>
	<li>Gdy komórki są w około 90% zlewające się na 12-dołkowej płytce, odessać pożywkę do hodowli komórek, przemyć komórki raz 1x PBS i dodać 500 μl odczynnika do ekstrakcji RNA do komórek. Powoli potrząsaj płytką w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę i przenieść ją do probówki wolnej od RNaz i DNaz. Dodać 100 μl chloroformu, zakryć probówkę i energicznie wstrząsać mieszaniną, wirując przez 15 sekund. Następnie pozostaw probówkę w pozycji RT na 3 minuty.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 15 minut w temperaturze 11 000 × g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść około 200 μl górnej warstwy wodnej do nowej probówki. Dodać taką samą objętość izopropanolu i kilkakrotnie dokładnie pipetować w górę iw dół. Następnie pozostaw mieszaninę w temperaturze RT na 10 minut.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut w temperaturze 11 000 × g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 75% etanolu do granulki w probówce i delikatnie odwróć probówkę kilka razy.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 6 000 × g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powtórzyć wirowanie raz przez 10 s przy 6 000 × g, ostrożnie odessać pozostały płyn za pomocą pipety i wysuszyć probówkę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 10 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA i zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby zsyntetyzować pierwszą nić cDNA z maksymalnie 1 μg całkowitego RNA.</li>
	<li>Użyj zestawu qPCR do wykrywania i ilościowego określania ekspresji genów, zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Sekwencje użytych starterów DNA są wymienione w Tabeli 1.</li>
</ol>

Functional Analysis of BAMBIhighMFGE8high UC-MSC Subpopulations

<ol><li>Liechty, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+engraft+and+demonstrate+site-specific+differentiation+after+in+utero+transplantation+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep.</a> Nat Med. 6 (11), 1282-1286 (2000).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advances+in+clinical+applications+of+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 24(2021).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tnf-alpha-mediated+m%286%29a+modification+of+elmo1+triggers+directional+migration+of+mesenchymal+stem+cell+in+ankylosing+spondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Tnf-alpha-mediated m(6)a modification of elmo1 triggers directional migration of mesenchymal stem cell in ankylosing spondylitis.</a> Nat Commun. 12 (1), 5373(2021).</li>
<li>Mcguire, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+interleukin-28+drives+the+selection+of+apoptosis+resistant+bone+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived interleukin-28 drives the selection of apoptosis resistant bone metastatic prostate cancer.</a> Nat Commun. 12 (1), 723(2021).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapy+induces+flt3l+and+cd1c%28%2B%29+dendritic+cells+in+systemic+lupus+erythematosus+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapy induces flt3l and cd1c(+) dendritic cells in systemic lupus erythematosus patients.</a> Nat Commun. 10 (1), 2498(2019).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+active+and+refractory+systemic+lupus+erythematosus%3A+A+multicenter+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in active and refractory systemic lupus erythematosus: A multicenter clinical study.</a> Arthritis Res Ther. 16 (2), R79(2014).</li>
<li>Ortiz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+engraftment+in+lung+is+enhanced+in+response+to+bleomycin+exposure+and+ameliorates+its+fibrotic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8407-8411 (2003).</li>
<li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells%3A+Implications+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+of+human+mesenchymal+stem+cells+exploring+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas of human mesenchymal stem cells exploring cellular heterogeneity.</a> Clin Transl Med. 11 (12), e650(2021).</li>
<li>Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+transcriptomics+decodes+wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+heterogeneity+and+a+subpopulation+with+wound+repair+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial transcriptomics decodes wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells heterogeneity and a subpopulation with wound repair signatures.</a> Adv Sci (Weinh). 10 (4), e2204786(2023).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+heterogeneity+reveals+a+unique+bambi%28high%29+mfge8%28high%29+subpopulation+of+human+uc-mscs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Dissecting heterogeneity reveals a unique bambi(high) mfge8(high) subpopulation of human uc-mscs.</a> Adv Sci (Weinh). 10 (1), e2202510(2022).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplant. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Lai, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+detaching+adherent+cells+and+their+effects+on+the+cell+surface+expression+of+fas+receptor+and+fas+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of fas receptor and fas ligand.</a> Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).</li>
<li>Avinash, K., Malaippan, S., Dooraiswamy, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+characterization+of+stem+cells+from+different+regions+of+oral+cavity+using+markers%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and characterization of stem cells from different regions of oral cavity using markers: A systematic review.</a> Int J Stem Cells. 10 (1), 12-20 (2017).</li>
<li>Galvao, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+inhibition+drives+resolution+of+acute+inflammation+by+enhancing+neutrophil+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Rock inhibition drives resolution of acute inflammation by enhancing neutrophil apoptosis.</a> Cells. 8 (9), 964(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wyizolować i wzbogacić subpopulację BAMBIo wysokiejzawartości MFGE8 od ludzkich UC-MSC. Metoda ta jest istotna dla dalszych badań nad morfologią, wzrostem i funkcją tej podgrupy MSC. Niektóre kroki są niezbędne do pomyślnej izolacji i wysokiej wydajności komórek BAMBIo wysokiej zawartościMFGE8.
Po pierwsze, najbardziej krytycznym aspektem technicznym do rozważenia jest zastosowanie odpowiedniego rozwiązania do dyso...

Ludzkie mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste (MSC) są somatycznymi progenitorami zdolnymi do różnicowania się w osteocyty, adipocyty, chondrocyty i inne typy komórek1. MSCs zostały po raz pierwszy wyizolowane ze szpiku kostnego i są powszechnie pozyskiwane z pępowiny, tkanki tłuszczowej i innych tkanek2. Ponieważ UC-MSC są łatwo dostępne i wykazują niską immunogenność i działanie immunosupresyjne, są szeroko stosowane w badaniach klinicznych w leczeniu różnych chorób3,4,5. Chociaż terapia MSC wykazuje obiecujący potencjał w leczeniu chorób, efekty terapeutyczne są niespójne u różnych osób6. Jednak przyczyna niestabilności terapii MSC jest nadal niejasna.
Fluktuacje molekularne, morfologia, zdolność różnicowania i funkcja terapeutyczna składają się na heterogeniczność MSC. Niektóre badania postulowały również, że MSC stanowią subpopulacje o różnych funkcjach7,8 i badały heterogeniczność MSC za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq)9,10. Wyniki ujawniły, że ludzkie UC-MSC mają odrębne subpopulacje o specyficznych cechach transkryptomicznych, podczas gdy niewiele badań z powodzeniem wyizolowało tak zwane subpopulacje MSC. Wcześniej przeprowadziliśmy sekcję ludzkich UC-MSC na trzy podgrupy zgodnie z ich sygnaturami za pomocą scRNA-seq i analizy bioinformatycznej, w której subpopulacja BAMBIo wysokimMFGE8i UC-MSC została dodatkowo oczyszczona i przetestowana funkcjonalnie11. Jednak ta podgrupa nie złagodziła toczniowego zapalenia nerek. W związku z tym konieczne jest przetestowanie efektów terapeutycznych MSCso wysokimpoziomie MFGE8 BAMBI w innych zaburzeniach, aby zrozumieć ich autentyczne funkcje.
Ten protokół opisuje metody izolowania podgrupy BAMBIo wysokimMFGE8 od ludzkich UC-MSC poprzez aktywowane fluorescencją sortowanie komórek (FACS) za pomocą cytometrii przepływowej oraz charakterystykę podgrupy BAMBIo wysokimMFGE8.

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówki 0,6 ml</td><td>Corning&nbsp;</td>Probówki do mikrowirówek <td>Axygen MCT-060-A</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Beijing Labgic Technology</td><td>MCT-001-150</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm&nbsp;</td><td>Beijing Labgic Technology</td><td>12311</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Beijing Labgic Technology</td><td>11210</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Nanjing Vazyme Material Technology</td><td>TCF00115</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa rurka</td> wirówkowa <td>Beijing Labgic Technology</td><td>11310</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Nanjing Vazyme Material Technology</td><td>TCF00150</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Rury okrągłodenne</td><td>Corning</td><td>FALCON 352003</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>APC anty-ludzki CD79a (Ig&alfa;) Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>333505</td><td>581 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>APC/cyjanina7 przeciwciało anty-ludzkie CD73 (ekto-5'-nukleotydaza)</td><td>BioLegend</td><td>344022</td><td>G46-6 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>APC-Cy7 Mysie IgG1, &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Bioscience</td><td>557873</td><td>MOPC-31C (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało BAMBI</td><td>Bioss</td><td>bs-12418R</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD44</td><td>BioLegend</td><td>103044</td><td>5E10 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, &kappa; Przeciwciało Isotype Ctrl</td><td>BioLegend</td><td>400646</td><td>MOPC-21 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD105 (Endoglin)&nbsp; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1057-42</td><td>HM47 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek</td><td>Szanghaj Wirówka QIUJING</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pekin BAIYANG</td><td>BY-320C</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ Uniwersalny SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q711-02</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>XILONG Scientific</td><td>13700908</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (1:1) zasadowy (1x)</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8,0, Invitrogen AM9260G bez rnaz</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>Etanol&nbsp; &nbsp;</td><td>XILONG Scientific</td><td>12803405</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz Anti-Human CD34</td><td>BD Bioscience</td><td>555821</td><td>IM7 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka CD45</td><td>BD Bioscience</td><td>555482</td><td>AD2 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka HLA-DR</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>555811 SN6 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSAria&handel; III Sorter komórekAria</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>BD Bioscience</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Przeciw Myszom H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab150113</td><td>HI30 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza H& L (AlexaFluor 594)</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>Rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>HiScript II Q RT SuperMix do qPCR (+gDNA wiper)</td><td>Vazyme</td><td>R223-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy odwrócone</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>XILONG Scientific</td><td>12802505</td><td></td></tr><tr><td>MFGE8</td><td>Biorbyt</td><td>orb388429</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FRESCO 21</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG1 kappa Kontrola izotypu APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td>P3.6.2.8.1 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Mysz IgG1 kappa Kontrola izotypu FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-42</td><td>eBMG2b (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Mysz IgG2b kappa Kontrola izotypu FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732-42</td><td>RTK4530 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj)</td><td>E607016-0500</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Mysz anty-ludzka CD90&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555597</td><td>P3.6.2.8.1 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>PE-Cy5 Mysia IgG1 &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Bioscience</td><td>550618</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna 100x</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific</td><td>Q6</td><td></td></tr> Spektrofotometr <tr><td>QIAGEN</td><td>129112</td><td></td>bez<td>RNaz</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop One (840-317400)</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do mikropipet</td><td>Beijing Labgic Technology</td><td></td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75</td><td>Beijing Labgic Technology</td><td>13212A</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems firmy Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti</td><td></td></tr><tr><td>Tri odczynnik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Typsin-EDTA</td><td>Bio-Channel Biotechnology</td><td>BC-CE-005</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomiemfge8

Isolation of Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stromal Cells

Mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste pochodzące z pępowiny (UC-MSC) wykazują niską immunogenność i silne działanie immunomodulujące w leczeniu różnych chorób. Ludzkie UC-MSC to niejednorodna populacja składająca się z trzech głównych subpopulacji o różnych kształtach komórek, tempie proliferacji, zdolnościach różnicowania i funkcjach regulacji immunologicznej. Wcześniej stwierdzono, że BAMBIo wysokimMFGE8 UC-MSC, pierwsza podgrupa pomyślnie wyizolowana z UC-MSC, nie łagodzi toczniowego zapalenia nerek. W związku z tym funkcja i mechanizm leżący u podstaw tej podgrupy w terapii chorób MSC pozostaje nieznany. Konieczne jest wyizolowanie i dalsze zbadanie BAMBIo wysokiejzawartości MFGE8 UC-MSC pod względem ich fenotypu, metabolizmu i funkcji, aby w pełni zrozumieć naturę tej podgrupy MSC. W tym protokole opisujemy szczegółową metodę izolowania subpopulacji owysokiej zawartości MFGE8 BAMBI od ludzkich UC-MSC. Subpopulacja UC-MSC jest znakowana dwoma markerami powierzchniowymi, BAMBI i MFGE8, za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej. Wyizolowane komórki są hodowane i weryfikowane za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Specyficzne geny ulegające ekspresjiw UC-MSCo wysokim poziomieMFGE8 BAMBI są identyfikowane za pomocą RT-qPCR. Protokół ten zapewnia wysoce wydajne i czyste sortowanie komórek i opisuje profile markerów UC-MSCo wysokiej MFGE8BAMBI.

Rysunek 1&#160;przedstawia profile ekspresji markerów powierzchniowych komórek ludzkich UC-MSCs. Hodowane MSC wykazują silną dodatnią ekspresję CD44, CD73, CD90 oraz CD105 i ujemną ekspresję CD14, CD34, CD45, CD79 oraz HLA-DR. MSC o fenotypie BAMBIhighMFGE8high zostały wyizolowane z hodowanych ludzkich UC-MSCs, a ich ekspresja BAMBI i MFGE8 została ponownie przeanalizowana metodą cytometrii przepływowej po ekspansji przez 3-4 pasaże (Rysunek 2</stro...

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Umbilical cord-derived mesenchymal stromal/stem cells (UC-MSCs) present low immunogenicity and potent immunomodulatory effects for treating various ...

Nasz zakres polega na wyizolowaniu określonych podgrup ludzkich UC-MSC i przeanalizowaniu ich podstawowych cech zgodnie z ich jednokomórkowymi czynnikami transkryptomicznymi. Próbujemy odpowiedzieć na pytanie, jakie są odrębne cechy i funkcje dla różnych subpopulacji UC-MSC. Najnowszym osiągnięciem w naszej dziedzinie jest odkrycie heterogeniczności mieszanych populacji MSC, głównie dzięki zastosowaniu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.Zidentyfikowaliśmy trzy subpopulacje w obrębie ludzkich UC-MSC, w tym komórki BAMBI o wysokiej zawartości MFGE8. Ta podgrupa wykazuje odrębny fenotyp, unikalny profil transkryptomiczny, ograniczony potencjał adipogenny i zmniejszoną aktywność immunosupresyjną w toczniowym zapaleniu nerek. Odkrycia te pogłębiają wiedzę na temat UC-MSC i pomagają w doborze optymalnych podgrup do leczenia określonych chorób.Torujemy drogę do zrozumienia rzeczywistych funkcji nie tylko UC-MSC o wysokim poziomie BAMBI MFGE8, ale także pozostałych dwóch podgrup, a zwłaszcza ich roli w leczeniu różnych chorób. Będziemy nadal koncentrować się na rozpoczęciu zastosowań ludzkich podgrup UC-MSC w wielu chorobach o podłożu immunologicznym i badaniu ich mechanizmów molekularnych w leczeniu tych chorób. Aby wyizolować UC-MSC o wysokiej zawartości MFGE8, należy wyhodować UC-MSC do gęstości około 5 do 10 razy 10 do mocy 6 komórek w pełnym DMEM.Dodaj 0,5 milimolowego EDTA na pięć minut, aby zdysocjować komórki. Następnie dodaj cały DMEM i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową.Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz całkowitą liczbę zebranych komórek. Po odliczeniu odwirować wymaganą liczbę komórek przy 300 G przez pięć minut.Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża, aby osiągnąć stężenie od 5 do 10 razy 10 do mocy 6 komórek na mililitr i umieścić probówkę na lodzie. Następnie podziel zebrane komórki na cztery 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczeniu od 1 do 100 do probówek MFGE8 i BAMBI.Dokładnie wymieszaj zawartość i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji dodaj PBS, aby umyć oznakowane komórki. Odwirować probówki o stężeniu 300 G przez pięć minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w jednym mililitrze kompletnego podłoża.Dodać sprzężone fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe w rozcieńczeniu 1 do 1 000 do ponownie zawieszonych komórek. Dokładnie wymieszaj i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej w ciemności przez cztery 15 minut. Po inkubacji dodać PBS i odwirować, aby umyć oznakowane komórki.Ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach kompletnego podłoża i przefiltrować je przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć grudki i zanieczyszczenia. Przenieść filtrat do 15-mililitrowej probówki w celu sortowania metodą cytometrii przepływowej. Uruchomić probówkę ze ślepą krwinką jako kontrolę ujemną bez dodawania przeciwciała.Dostosuj ustawienia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego na cytometrze przepływowym, aby ustalić skalę bramkowania dla niebarwionej populacji. Następnie uruchom MFGE8 i BAMBI znakowane pojedynczym przeciwciałem jako kontrolę bramkowania, aby określić, gdzie zaczyna się dodatniość na wykresie. Uruchom eksperymentalne probówki z próbkami, aby posortować populację komórek o wysokiej zawartości MFEG8 BAMBI i zebrać posortowane komórki.Umieść posortowane MSCs na 24-dołkowej płytce i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy posortowane komórki przerosną przez dwa przejścia, należy przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej, aby potwierdzić czystość posortowanej populacji. Hodowane UC-MSC były silnie dodatnie dla ekspresji CD44, CD73, CD90 i CD105 oraz ujemne dla ekspresji CD14, CD34, CD45, CD79 i HLA DR.MSC o wysokim poziomie BAMBI MFEG8 posortowano z hodowanych ludzkich UC-MSC i potwierdzono, że ich podwyższone poziomy ekspresji BAMBI i MFEG8 utrzymują się przez trzy do czterech pasaży. Częstość występowania MSC o wysokim poziomie BAMBI MFEG8 różniła się w zależności od dawcy i metody dysocjacji.

isolation-human-bambihighmfge8high-umbilical-cord-derived-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Ludzka pępowina (UC) może być uzyskana w okresie okołoporodowym w wyniku porodu przedwczesnego, terminowego i poterminowego. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z WZJG (UC-MSC) od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

To badanie przedstawia unikalną procedurę sekcji w celu zachowania integralności galarety Whartona (WJ), co skutkuje mniej uszkodzonym WJ oraz większą ilością i żywotnością pobranych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Metoda ta wykazuje lepszą wydajność i zdolność proliferacyjną w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ostrej sekcji.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny o wysokiej wydajności i niskich uszkodzeniach

W niniejszym raporcie prezentujemy system izolacji i hodowli komórek donora z gruczołu mlekowego myszy oraz ich ortotopowego przeszczepienia do myszy biorców w celu analizy interakcji zrąb-nabłonek podczas rozwoju guza piersi.

Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Ustalenie pierwotnych systemów hodowli komórek zrębu endometrium na podstawie próbek z histerektomii jest cenną techniką biologiczną i kluczowym krokiem przed realizacją szerokiego wachlarza celów badawczych. W tym miejscu opisujemy dwie metody stosowane do ustanawiania kultur zrębu z chirurgicznie wyciętych tkanek endometrium u ludzi.

Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

Poznaj izolację ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych z pępowiny o wysokim poziomie BAMBI i MFGE8. Ta metoda pozwala analizować ich transkryptomiczny profil i funkcje w celu poprawy skuteczności terapii.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny o^{wysokim poziomie}MFGE8

Przeglądaj więcej filmów