Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny o^{wysokim poziomie}MFGE8

Nasz zakres polega na wyizolowaniu określonych podgrup ludzkich UC-MSC i przeanalizowaniu ich podstawowych cech zgodnie z ich jednokomórkowymi czynnikami transkryptomicznymi. Próbujemy odpowiedzieć na pytanie, jakie są odrębne cechy i funkcje dla różnych subpopulacji UC-MSC. Najnowszym osiągnięciem w naszej dziedzinie jest odkrycie heterogeniczności mieszanych populacji MSC, głównie dzięki zastosowaniu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Zidentyfikowaliśmy trzy subpopulacje w obrębie ludzkich UC-MSC, w tym komórki BAMBI o wysokiej zawartości MFGE8. Ta podgrupa wykazuje odrębny fenotyp, unikalny profil transkryptomiczny, ograniczony potencjał adipogenny i zmniejszoną aktywność immunosupresyjną w toczniowym zapaleniu nerek. Odkrycia te pogłębiają wiedzę na temat UC-MSC i pomagają w doborze optymalnych podgrup do leczenia określonych chorób.

Torujemy drogę do zrozumienia rzeczywistych funkcji nie tylko UC-MSC o wysokim poziomie BAMBI MFGE8, ale także pozostałych dwóch podgrup, a zwłaszcza ich roli w leczeniu różnych chorób. Będziemy nadal koncentrować się na rozpoczęciu zastosowań ludzkich podgrup UC-MSC w wielu chorobach o podłożu immunologicznym i badaniu ich mechanizmów molekularnych w leczeniu tych chorób. Aby wyizolować UC-MSC o wysokiej zawartości MFGE8, należy wyhodować UC-MSC do gęstości około 5 do 10 razy 10 do mocy 6 komórek w pełnym DMEM.

Dodaj 0,5 milimolowego EDTA na pięć minut, aby zdysocjować komórki. Następnie dodaj cały DMEM i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową.

Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz całkowitą liczbę zebranych komórek. Po odliczeniu odwirować wymaganą liczbę komórek przy 300 G przez pięć minut.

Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża, aby osiągnąć stężenie od 5 do 10 razy 10 do mocy 6 komórek na mililitr i umieścić probówkę na lodzie. Następnie podziel zebrane komórki na cztery 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczeniu od 1 do 100 do probówek MFGE8 i BAMBI.

Dokładnie wymieszaj zawartość i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji dodaj PBS, aby umyć oznakowane komórki. Odwirować probówki o stężeniu 300 G przez pięć minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w jednym mililitrze kompletnego podłoża.

Dodać sprzężone fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe w rozcieńczeniu 1 do 1 000 do ponownie zawieszonych komórek. Dokładnie wymieszaj i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej w ciemności przez cztery 15 minut. Po inkubacji dodać PBS i odwirować, aby umyć oznakowane komórki.

Ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach kompletnego podłoża i przefiltrować je przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć grudki i zanieczyszczenia. Przenieść filtrat do 15-mililitrowej probówki w celu sortowania metodą cytometrii przepływowej. Uruchomić probówkę ze ślepą krwinką jako kontrolę ujemną bez dodawania przeciwciała.

Dostosuj ustawienia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego na cytometrze przepływowym, aby ustalić skalę bramkowania dla niebarwionej populacji. Następnie uruchom MFGE8 i BAMBI znakowane pojedynczym przeciwciałem jako kontrolę bramkowania, aby określić, gdzie zaczyna się dodatniość na wykresie. Uruchom eksperymentalne probówki z próbkami, aby posortować populację komórek o wysokiej zawartości MFEG8 BAMBI i zebrać posortowane komórki.

Umieść posortowane MSCs na 24-dołkowej płytce i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy posortowane komórki przerosną przez dwa przejścia, należy przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej, aby potwierdzić czystość posortowanej populacji. Hodowane UC-MSC były silnie dodatnie dla ekspresji CD44, CD73, CD90 i CD105 oraz ujemne dla ekspresji CD14, CD34, CD45, CD79 i HLA DR.

MSC o wysokim poziomie BAMBI MFEG8 posortowano z hodowanych ludzkich UC-MSC i potwierdzono, że ich podwyższone poziomy ekspresji BAMBI i MFEG8 utrzymują się przez trzy do czterech pasaży. Częstość występowania MSC o wysokim poziomie BAMBI MFEG8 różniła się w zależności od dawcy i metody dysocjacji.