Name: Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej pochodzących z zębów stałych przy użyciu dwóch różnych metod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 52 s
Description: Poznaj izolację i charakterystykę ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej z zębów stałych przy użyciu dwóch metod: enzymatycznej i outgrowth. Porównaj ich zdolność różnicowania w odontoblasty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wyrażamy wdzięczność dr Leila Shakeri i dr Aref Dournaei za krytyczne dyskusje oraz panu Mohammad Reza Khadem Sharif za wsparcie techniczne.

1. Przygotowanie roztworu enzymu i medium do proliferacji (PM)
<ol>
 <li>Przygotowanie roztworu kolagenazy typu I: Odważyć kolagenazę typu I (12 mg/ml), rozpuścić w 1 ml PBS i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Następnie przelać do probówki 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
 <li>Przygotowanie roztworu dyspazy: Odważyć dyspazę (16 mg/ml), rozpuścić w 1 ml PBS i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Następnie przelać do probówki 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
 <li>Przygotowanie roztworu enzymatycznego: Dodać 1 ml roztworu kolagenazy typu I (12 mg/ml) oraz 1 ml roztworu dyspazy (16 mg/ml) do 2 ml sterylnego PBS zawierającego 100 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Końcowe stężenie dyspazy i kolagenazy I w całkowitej objętości powinno wynosić odpowiednio 4 mg/ml i 3 mg/ml. Następnie rozdzielić tę objętość do czterech probówek 15 ml, z których każda powinna zawierać 1 ml roztworu enzymatycznego. Każda probówka może zostać wykorzystana do jednego trawienia miazgi.</li>
 <li>Przygotowanie roztworu do płukania: Dodać 100 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny do PBS.</li>
 <li>Przygotowanie pożywki podstawowej: Pożywka Eagle'a z modyfikacją alfa (α-MEM) uzupełniona o 10% FBS oraz 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.</li>
 <li>Przygotowanie pożywki proliferacyjnej (PM): Pożywka Eagle'a z modyfikacją alfa (α-MEM) uzupełniona o 10% FBS, 100 μM L-kwasu askorbiniowego 2-fosforanu, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny oraz 0,25 mg/ml amfoterycyny B.</li>
 <li>Przygotowanie pożywki odontogennej: Pożywka Eagle'a z modyfikacją alfa (α-MEM) uzupełniona o 10% FBS, 100 μM L-kwasu askorbiniowego 2-fosforanu, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 0,01 μM deksametazonu, 5 mM β-fosforanu glicerolu oraz 1,8 mM fosforanu jednopotasowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki miazgi zębnej człowieka do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej
<ol>
 <li>Zdrowe ludzkie trzecie trzonowce pobrano od osób dorosłych (w wieku 21-29 lat) w klinice stomatologicznej Imam Ali po uzyskaniu zgody Institutional Review Board (IRB). </li>
 <li>Zęby umieszczono w medium podstawowym (α-MEM uzupełniony o 10% FBS) i przetransportowano do laboratorium w temperaturze 4 °C. </li>
 <li>W warunkach sterylnych, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza dla materiałów biologicznie niebezpiecznych, przygotowano po jednej szalce Petriego o średnicy 100 mm dla każdego zęba przeznaczonego do obróbki. Powierzchnie zębów oczyszczono 70% etanolem. </li>
 <li>Podczas pracy w jednej z szalek Petriego ząb trzymano kleszczykami stomatologicznymi, a za pomocą skalpela usuwano zanieczyszczenia oraz więzadło ozębne z korzeni. </li>
 <li>Połączenie cementowo-emaliowe powoli przecięto za pomocą sterylnej tarczy stomatologicznej, aby odsłonić jamę miazgi. Należy pamiętać, że proces cięcia musi być przeprowadzany powoli, aby zminimalizować przegrzanie tkanki zęba. </li>
 <li>Tkankę miazgi delikatnie oddzielono od korony i korzenia. </li>
 <li>Tkankę miazgi pocięto na małe fragmenty za pomocą skalpela. </li>
</ol>
3. Izolacja ludzkiej miazgi zęba
<ol>
 <li>Tkanki miazgi poddano albo dysocjacji enzymatycznej, albo bezpośredniemu wyprowadzeniu komórek z eksplantatów tkanki miazgi w celu izolacji hDPSCs. </li>
 <li>Dysocjacja enzymatyczna tkanki miazgi: 
 <ol>
 <li>Małe fragmenty tkanek miazgi przeniesiono do roztworu enzymatycznego na 1 hr w temperaturze 37 °C. Co 30 min mieszano na wirówce typu vortex, aby wspomóc rozpad tkanki.</li>
 <li>Następnie usunięto duże agregaty komórkowe, a zawiesiny pojedynczych komórek uzyskano poprzez przepuszczenie komórek przez sitko komórkowe o rozmiarze 70-μM.</li>
 <li>Zawiesiny pojedynczych komórek wirowano z prędkością 1,200 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Nadfiltr ostrożnie odpipetowano, a osad resuspenderowano w 1 ml medium proliferacyjnego (PM). (Uwaga: FBS w medium proliferacyjnym hamuje dysocjację enzymatyczną.) </li>
 <li>Zawiesiny pojedynczych komórek miazgi zębowej wysiano do kolb hodowlanych o powierzchni 25 cm2 z dodatkiem PM, a następnie inkubowano w 37 °C w 5% CO2. </li>
 <li>Medium hodowlane zmieniano co trzy dni aż do osiągnięcia konfluencji komórek. </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Bezpośrednie wyprowadzenie komórek z eksplantatów tkanki miazgi:
 <ol>
 <li>Tkankę miazgi posiekano na fragmenty o wielkości 1-2-mm, a każdy fragment umieszczono w kolbach hodowlanych o powierzchni 25-cm2 z PM, a następnie inkubowano w 37 °C w 5% CO2. Należy pamiętać, że całkowita objętość PM do wyprowadzenia komórek musi umożliwiać przytwierdzenie fragmentów miazgi dla dalszego wzrostu komórek (2-3 ml na kolbę). </li>
 <li>Medium zmieniano po zaobserwowaniu wyprowadzenia komórek. </li>
 <li>Wyprowadzone komórki po osiągnięciu konfluencji poddano pasażowaniu w stosunku 1:4 (pasaż 1). </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Immunofenotypowanie
<ol>
 <li>250 000 komórek/probówkę obu typów komórek w trzecim pasażu inkubowano z przeciwciałami antyludzkimi sprzężonymi z PE lub FITC oraz ich izotypami przez 30 min w temperaturze 4 °C w ciemności. (Uwaga: stężenie przeciwciał zastosowano zgodnie z protokołem producenta.) </li>
 <li>Po czasie inkubacji do każdej probówki dodano 100 μl PBS lub roztworu rozcieńczającego do FACS, a następnie odwirowano przy 1 200 rpm przez 5 min w ciemności. </li>
 <li>Nadnadocz został usunięty, a osady zawieszono ponownie w 100 μl PBS lub rozcieńczalnika do FACS w ciemności. </li>
 <li>Analizę docelowych markerów powierzchniowych (markerów CD) przeprowadzono za pomocą BD FACSCalibur. </li>
</ol>
5. Indukcja różnicowania DPSCs w komórki zmineralizowane i ilościowy test Alizarin Red S
<ol>
 <li>Komórki macierzyste z miazgi zęba (DPSCs), uzyskane albo poprzez enzymatyczną dysocjację tkanki miazgi (znane jako DPSC-ED), albo poprzez bezpośredni wzrost komórek z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG), poddawano subkulturacji przez 3 pasaże. </li>
 <li>W trzecim pasażu komórki wysiano do płytki 6-dołkowej w zagęszczeniu 5 000 komórek na dołek. </li>
 <li>Przy konfluencji 60% podłoże odontogenne zastąpiono konwencjonalnym podłożem PM. Trzy studzienki pozostały jako kontrola negatywna poprzez dodanie podłoża wzrostowego. </li>
 <li>Wymiana medium co 3 dni do 21. dnia. </li>
 <li>W 21. dniu komórki przemyto PBS, a następnie utrwalono za pomocą 1 ml/studzienkę 10% paraformaldehydu przez 15 min w temperaturze pokojowej. </li>
 <li>Następnie ostrożnie odessano paraformaldehyd, a komórki przemyto 3 razy (po 5–10 min każdego razie) wodą destylowaną H2O2O. (Uwaga: Należy unikać naruszania warstwy monowarstwowej.</li>
 <li>Po przemyciu do każdej dołki dodano 1 ml Alizaryny czerwonej S na 20 min w temperaturze pokojowej. </li>
 <li>Komórki przemyto zjonizowaną wodą H2O2Cztery razy (po 5 min za każdym razem, przy delikatnym kołysaniu), aby usunąć nadmiar czerwieni alizarynowej.</li>
 <li>1 ml/dołek H2Dodano O, aby zapobiec wysychaniu komórek.</li>
 <li>Płytki poddano inspekcji wizualnej i/lub akwizycji obrazu.</li>
 <li>W celu przeprowadzenia analizy ilościowej barwieniem Alizarin Red S, H2Do każdego dołka płytki 6-dołkowej wlano 1 ml 10% kwasu octowego w miejsce roztworu O. &amp; inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej przy wytrząsaniu. </li>
 <li>Następnie monowarstwę komórek w każdej studni zeskrobano. &amp; obie formy kwasu octowego &amp; komórki przeniesiono do osobnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.Uwaga: zawartość każdej studzienki należy przenieść do osobnej probówki t. j. trzy studnie testowe &amp; trzy studzienki kontrolne dla każdego ED &amp; grupy OG)</li>
 <li>Probówki intensywnie mieszano na wirówce vortex przez 30 s. </li>
 <li>Ogrzewać w temperaturze 85 °C przez 10 min. (Uwaga: aby uniknąć odparowania, probówki uszczelniono parafilmem.)</li>
 <li>Po podgrzaniu probówki przeniesiono do lodu na 5 min.UwagaProbówek nie należy otwierać do czasu ich ostygnięcia.</li>
 <li> Zawiesiny odwirowano przy 20 000 x g przez 15 min. W czasie wirowania przygotowano standardy Alizarin Red.</li>
 </ol>
 Standardy Alizarin Red S przygotowano, najpierw rozcieńczając bufor do rozcieńczeń, a następnie wykonując 2-krotne rozcieńczenia seryjne zgodnie z tabelą. 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="7">Wysoki zakres stężenia barwnika </td>
 <td colspan="7">Niskie stężenie barwnika </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 mM</td>
 <td>1 mM</td>
 <td>500 μM</td>
 <td>250 μM</td>
 <td>125 μM</td>
 <td>62,5 μM</td>
 <td>31,3 μM</td>
 <td>15,6 μM</td>
 <td>7,8 μM</td>
 <td>3,9 μM</td>
 <td>1,9 μM</td>
 <td>0,9 μM</td>
 <td>0,4 μM</td>
 <td>Puste</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 <ol start="16">
 <li>Po wirowaniu 1 ml supernatantu z każdej probówki przeniesiono do nowych, oddzielnych probówek mikrocentryfugicznych o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>pH zneutralizowano, dodając ok. 375 μl 10% wodorotlenku amonu do każdej probówki. (Uwaga: zakres pH powinien wynosić 4,1-4,5.)</li>
 <li>150 μl standardów i próbek (łącznie z oddzielnymi próbami badawczymi i kontrolami) naniesiono na płytkę 96-dołkową z nieprzezroczystymi ściankami i przezroczystym dnem.</li>
 <li>Absorbancję odczytano przy 405 nm, a wartości OD z próbek porównano z wykresem standardowym w celu dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+biological+tooth+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based biological tooth repair and regeneration.</a> Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).</li>
<li>Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+cells+produce+neurotrophic+factors%2C+interact+with+trigeminal+neurons+in+vitro%2C+and+rescue+motoneurons+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury.</a> Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).</li>
<li>Gandia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+improve+left+ventricular+function%2C+induce+angiogenesis%2C+and+reduce+infarct+size+in+rats+with+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction.</a> Stem Cells. 26, 638-645 (2008).</li>
<li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+%28DPSCs%29+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).</li>
<li>Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%3A+a+promising+tool+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration.</a> Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).</li>
<li>Kerkis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+transplantation+of+human+immature+dental+pulp+stem+cells+from+baby+teeth+to+golden+retriever+muscular+dystrophy+%28GRMD%29+dogs%3A+Local+or+systemic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic.</a> J. Transl. Med. 6, 35(2008).</li>
<li>Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+development%3A+2.+Regenerating+teeth+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Dent.+Update%22%5BJournal%5D)">Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory.</a> Dent. Update. 34, 20-29 (2007).</li>
<li>Cordeiro, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+tissue+engineering+with+stem+cells+from+exfoliated+deciduous+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endod%22%5BJournal%5D)">Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth.</a> J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).</li>
<li>Pierdomenico, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stem+cells+with+immunosuppressive+activity+can+be+easily+isolated+from+dental+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp.</a> Transplantation. 80, 836-842 (2005).</li>
<li>de Mendonca Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+large+cranial+defects+in+nonimmunosuppressed+experimental+design+with+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells.</a> J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+identification%2C+characterization+and+banking+of+human+DPSCs%3A+current+strategies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives.</a> Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).</li>
<li>Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+characterization%2C+and+banking+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).</li>
<li>Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Growth+and+Characterization+of+Stem+Cells+from+Human+Dental+Pulp+of+Deciduous+Versus+Permanent+Teeth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+%28Tehran%29%22%5BJournal%5D)">In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth.</a> J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).</li>
<li>Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mineralization+markers+in+dental+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endod%22%5BJournal%5D)">Expression of mineralization markers in dental pulp cells.</a> J. Endod. 33, 703-708 (2007).</li>
<li>Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elusive+nature+and+function+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The elusive nature and function of mesenchymal stem cells.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).</li>
<li>Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+dental+tissues+vs.+those+from+other+sources%3A+their+biology+and+role+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine.</a> J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).</li>
<li>Graziano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%27s+surface+geometry+significantly+affects+human+stem+cell+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering.</a> J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).</li>
<li>d'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells%3A+from+biology+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B.+Mol.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%2C+niches%2C+and+notch+signaling+in+tooth+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury.</a> Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).</li>
<li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).</li>
<li>Tomic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+properties+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+dental+pulp+and+dental+follicle+are+susceptible+to+activation+by+toll-like+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists.</a> Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).</li>
<li>Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mineralized+nodule+formation+by+cultures+of+human+dental+pulp-derived+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts.</a> Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).</li>
<li>About, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dentin+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human dentin production in vitro.</a> Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).</li>
<li>Couble, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odontoblast+differentiation+of+human+dental+pulp+cells+in+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures.</a> Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).</li>
<li>Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proliferation+and+differentiation+of+dog+dental+pulp+cells+in+serum-free+culture+medium+by+insulin-like+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor.</a> Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).</li>
<li>Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+human+dental+pulp+cells%3A+various+isolation+methods+and+culturing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments.</a> Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).</li>
<li>Bakopoulou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+impact+of+two+different+isolation+methods+on+the+osteo%2Fodontogenic+differentiation+potential+of+human+dental+stem+cells+derived+from+deciduous+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth.</a> Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).</li>
<li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Mol. Biol. 11, 61(2010).</li>
<li>Suchanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ.+Palacky+Olomouc+Czech+Repub%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells and their characterization.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).</li>
<li>d'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+postnatal+dental+pulp+cells+co-differentiate+into+osteoblasts+and+endotheliocytes%3A+a+pivotal+synergy+leading+to+adult+bone+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation.</a> Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).</li>
<li>Atari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pluripotent+stem+cells+from+human+third+molar+dental+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp.</a> Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje proces izolacji i charakterystyki hDPSCs z miazgi zębowej przy użyciu dwóch metod: dysocjacji enzymatycznej oraz bezpośredniego wyrastania komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi. Ponadto oceniono różnicowanie tych komórek in vitro w odontoblasty za pomocą ilościowego testu Alizarin Red S oraz QPCR.
W istniejących protokołach izolacji tkanki miazgi z ludzkiego zęba stosowano różne instrumenty, takie jak kleszcze (kleszcze kostne)9, igły d...

Komórki macierzyste są komórkami klonogennymi, które posiadają dwie niezwykłe cechy, znane jako wielopotencjalność oraz zdolność do samoodnowy15. spośród wszystkich komórek macierzystych o różnym potencjale replikacyjnym, komórki macierzyste pochodzenia stomatologicznego, jako komórki macierzyste postnatalne, przyciągnęły w ostatnich latach uwagę ze względu na ich dostępność, plastyczność i wysoką zdolność do proliferacji w porównaniu z innymi dorosłymi komórkami macierzystymi16. Charakterystycznie, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste, komórki macierzyste miazgi zęba są przylegającymi komórkami klonogennymi, które wykazują zdolność do różnicowania w wielu kierunkach w linie mezenchymalne i/lub niemezenchymalne, zarówno in vitro, jak i in vivo.1-8,17,18 DPSCs są identyfikowane na podstawie braku ekspresji antygenów hematopoetycznych (np. CD45, CD34, CD14) oraz obecności ekspresji CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 i STRO-1.19,20
Łatwość uzyskania potencjału przy minimalnym bólu i zachorowalności sprawia, że ludzkie DPSCs są cennym źródłem MSCs w porównaniu ze standardowymi źródłami, takimi jak mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego21. Generalnie DPSCs izoluje się za pomocą metody wypłukiwania, t.j. migracji komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG)22-24 i/lub poprzez trawienie enzymatyczne (DPSC-ED)4,6,25. Wcześniejsze badania wykazały, że metoda izolacji i warunki hodowli mogą indukować różne populacje lub linie podczas pasaży in vitro26,27. W przypadku zębów trwałych (pDPSCs), Huang et al wykazali, że pDPSCs poddane trawieniu enzymatycznemu mają wyższy potencjał proliferacyjny w porównaniu do DPSCs uzyskanych metodą wypłukiwania.26 Ponadto, w przypadku zębów mlecznych (dDPSCs), wykazano, że markery STRO-1 i CD34 wykazują silniejszą ekspresję w dDPSC-ED w porównaniu z dDPSC-OG. Dodatkowo, dDPSC-ED wykazały wyższy stopień mineralizacji w określonym medium osteo/odonto.27 W związku z tym, ze względu na wyjątkowy potencjał DPSCs w medycynie regeneracyjnej, wymagane będą dalsze badania w celu lepszego zrozumienia możliwych różnych populacji pochodzących z różnych metod izolacji.
W niniejszej pracy podjęto próbę wprowadzenia łatwego sposobu ekstrakcji miazgi, wykorzystując jednowykorzystywalną diamentową tarczę dentystyczną w celu usprawnienia tego procesu. Ponadto, po wyizolowaniu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z miazgi z zastosowaniem metod ED lub OG, zbadano właściwości ogólne oraz zdolność do różnicowania się obu grup.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>GIBCO</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>GIBCO</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>definiowana płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbinian 2-fosforan</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Glicerynian fosforanu dwusodowy nawodniony, BioUltra</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy osteogenezy</td><td>Millipore</td><td>PS01802031</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypowa mysiej IgG2b-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>50808088029</td><td></td></tr><tr><td>kontrolny izotyp FITC mouse IgG2b</td><td>BD Pharmingen</td><td>559532</td><td></td></tr><tr><td>FITC mysia IgG1 &amp;#954; izotyp</td><td>BD Pharmingen</td><td>11471471</td><td></td></tr><tr><td>FITC/PE przeciwciała mysie przeciw ludzkim antygenom CD34/CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>341071</td><td></td></tr><tr><td>PE przeciwciało anty-ludzkie CD146</td><td>BD Pharmingen</td><td>550315</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało mysie anty-ludzkie CD90/FITC</td><td>Daka</td><td>00034418</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało mysie anty-CD73 ludzkie znakowane PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550257</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-h CD105/Endoglin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>FAB10971P</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało mysie anty-ludzkie CD11b/Mac1 znakowane PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>5553888</td><td></td></tr><tr><td>CD44 PE mysia przeciwciała antyludzkie</td><td>BD Pharmingen</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>roztwór buforu fosforanowego (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>003000</td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;mu;sito do komórek m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;filtr strzykawkowy m</td><td>Millex-GV</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; kolba hodowlana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707481</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;SPRZĘT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD</td><td>342975</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr do mikropłytek multiskan </td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Flowing w wersji 2.3.1</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Rozwijające się zęby mądrości stanowią łatwo dostępne źródło komórek macierzystych w wieku dorosłym, które można pozyskać podczas rutynowych zabiegów ortodontycznych. Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z miazgi zęba (hDPSCs) wykazują wysoki potencjał proliferacyjny oraz zdolność do różnicowania wieloliniowego w porównaniu z typowymi źródłami dorosłych komórek macierzystych1-8; w związku z tym hDPSCs mogą być odpowiednimi kandydatami do autologicznego przeszczepiania w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Oprócz tych zalet, posiadanie cech mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), takich jak efekt immunomodulacyjny, czyni hDPSCs bardziej wartościowymi, nawet w przypadku transplantacji allogenicznej6,9,10. Dlatego podstawowym krokiem w wykorzystaniu tego źródła komórek macierzystych jest wybór najlepszego protokołu izolacji hDPSCs z tkanki miazgi. Aby osiągnąć ten cel, kluczowe jest zbadanie wpływu różnych warunków izolacji na różne zachowania komórkowe, takie jak ich typowe markery powierzchniowe oraz zdolność do różnicowania.
W związku z tym w niniejszej pracy wyizolowano tkankę miazgi z ludzkich zatrzymanych zębów trzecich każdego z pacjentów, a następnie zastosowano oba istniejące protokoły oparte na literaturze do izolacji hDPSCs,11-13 t.j. dysocjację enzymatyczną tkanki miazgi (DPSC-ED) lub przerost z eksplantów tkankowych (DPSC-OG). W tym celu próbowano usprawnić metody izolacji poprzez zastosowanie dentystycznej tarczy diamentowej. Następnie komórki te scharakteryzowano pod kątem markerów związanych ze stromalnymi komórkami macierzystymi (CD73, CD90, CD105 i CD44), markerów hematopoetycznych/śródbłonkowych (CD34, CD45 i CD11b), markerów naczyniowych, takich jak CD146, a także STRO-1. Następnie oba protokoły porównano pod kątem potencjału różnicowania w odontoblasty, wykorzystując zarówno ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (QPCR), jak i barwienie Alizariną Czerwoną. QPCR wykorzystano do oceny ekspresji genów związanych z mineralizacją (fosfataza alkaliczna; ALP, macierzowa zewnątrzkomórkowa fosfoglikoproteina; MEPE i dentynowa sialofosfoproteina; DSPP).14

<ol>
 <li>Przedstawiono tutaj komórki DPSCs uzyskane poprzez dysocjację enzymatyczną (DPSC-ED) w 10., 15. i 18. dniu (Rysunek 1). Kolonie zaczęły się tworzyć niemal od 3 do 5 dni po izolacji.</li>
 <li>Wyrastające komórki DPSCs (DPSC-OG) przedstawiono na Rysunku 2 w 5., 10., 13. i 18. dniu. Komórki fibroblastopodobne zaczęły migrować z tkanki miazgi do kolby, układając się równolegle niemal 5 dni po wysianiu.</li>
 <li>Komórki DPSCs w 3. pasażu z zastosowaniem obu metod przedstawiono na Rysunku 3.</s...

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Rozwijające się zęby mądrości są łatwo dostępnym źródłem komórek macierzystych w wieku dorosłym, które można pozyskać podczas rutynowych zabiegów ortodontycznych. Ludzkie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja, charakterystyka i różnicowanie ludzkich mezenchymalnych macierzystych komórek miazgi zębów stałych z wykorzystaniem dwóch metod. Osiąga się to poprzez pobranie zdrowych, zatrzymanych zębów mądrości i ich początkowe przecięcie na poziomie połączenia cementu z szkliwem. Komórki macierzyste miazgi zębowej (D PSCs) są izolowane dwiema różnymi metodami.W pierwszej metodzie tkanki polipów są trawione enzymatycznie poprzez inkubację w kolagenazie typu jeden z dodatkiem roztworu do przestrzeni dyskowej. Określamy je mianem ed. W przypadku metody izolacji w drugiej procedurze, tkanki polipów są jedynie umieszczane w kolbie, bez żadnego trawienia.W ten sposób dpss zaczynają migrować z tkanki do kolby. Komórki te, nazwane OG, odnoszą się do metody izolacji poprzez przerost (outgrowth). Drugim krokiem procedury jest identyfikacja komórek macierzystych przy użyciu cytometrii przepływowej.Trzecim krokiem procedury jest indukcja różnicowania odontoblastów, a ostatnim etapem jest porównawcza ocena różnicowania odontoblastów w dwóch grupach za pomocą barwienia Alizaryną czerwoną oraz qPCR. Jestem RA Kde z Katedry Komórek Macierzystych i Biologii Roz

isolation-characterization-comparative-differentiation-human-dental

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich komórek macierzystych z miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych za pomocą dwóch różnych metod

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i propagacji ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w celu oceny ekspresji białka prionowego podczas procesu różnicowania neuronów.

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten protokół przedstawia porównanie dwóch różnych protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) w kierunku linii trzustki in vitro: protokół integracyjny i protokół nieintegracyjny. Protokół integracyjny generuje więcej komórek produkujących insulinę (IPC).

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

Obecny protokół przedstawia szybką, efektywną i delikatną metodę izolowania pojedynczych komórek odpowiednich do analizy sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki z ciągle rosnących siekaczy, mysich zębów trzonowych i ludzkich zębów.

Szybka izolacja pojedynczych komórek z zębów myszy i ludzi

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Ustalenie pierwotnych systemów hodowli komórek zrębu endometrium na podstawie próbek z histerektomii jest cenną techniką biologiczną i kluczowym krokiem przed realizacją szerokiego wachlarza celów badawczych. W tym miejscu opisujemy dwie metody stosowane do ustanawiania kultur zrębu z chirurgicznie wyciętych tkanek endometrium u ludzi.

Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

Poznaj izolację i charakterystykę ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej z zębów stałych przy użyciu dwóch metod: enzymatycznej i outgrowth. Porównaj ich zdolność różnicowania w odontoblasty.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej pochodzących z zębów stałych przy użyciu dwóch różnych metod (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Przeglądaj więcej filmów