Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej pochodzących z zębów stałych przy użyciu dwóch różnych metod

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie, scharakteryzowanie i zróżnicowanie ludzkich komórek macierzystych impulsu gojowego z zębów stałych przy użyciu dwóch metod. Osiąga się to poprzez zbieranie zdrowych zatrzymanych zębów mądrości, przecinając je na początku wokół połączenia cementu ze szkliwem. Dentystyczne poli komórki macierzyste D PSC są izolowane dwiema różnymi metodami.

W pierwszej metodzie tkanki polipów są trawione enzymatycznie przez inkubację w roztworze kolagenazy typu pierwszego plus przestrzeń dyskowa. Tutaj nazywamy je ed. Biorąc pod uwagę metodę izolacji w drugiej metodzie, tkanki palpowe są umieszczane w kolbie tylko bez trawienia.

W ten sposób dpss zaczynają migrować z tkanki do kolby. Komórki te o nazwie OG odnoszą się do metody izolacji przerostu. Drugim etapem zabiegu jest identyfikacja komórek macierzystych za pomocą cytometrii opadającej.

Trzecim etapem zabiegu jest indukcja różnicowania odontoblastów, a ostatnim etapem zabiegu jest ocena porównawcza różnicowania odontoblastów między dwiema grupami za pomocą barwienia na czerwono i QBCR. Nazywam się RA Kde i pracuję na Wydziale Komórek Macierzystych i Biologii Rozwoju w Instytucie Riana. Dzisiaj pokażę Wam izolację, charakterystykę i porównawcze różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu dwóch metod.

Witam, nazywam się Dr. Rezaian z Instytutu w Rio. Pracujemy nad projektem związanym z komórkami macierzystymi ludzkiej miazgi zębowej. Komórki te są rodzajem mechanicznych komórek macierzystych, które są łatwe do uzyskania przy minimalnym bólu i zachorowalności.

Mechy komórki macierzyste charakteryzują się zdolnością do tworzenia kolonii i zdolnością do wielokrotnego różnicowania. Cześć, jestem Dr.Ami z Zakładu Komórek Macierzystych. W Instytucie stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do izolowania komórek macierzystych do celów badań naukowych i przyszłych zastosowań.

W medycynie regeneracyjnej pierwszym krokiem do wykorzystania tego źródła komórek macierzystych w przyszłej terapii opartej na komórkach macierzystych jest wybór najlepszego protokołu izolowania komórek macierzystych z tkanki ludzkiej. Aby osiągnąć ten cel, kluczowe jest zbadanie pewnych aspektów zachowania komórek w różnych warunkach izolacji komórek macierzystych. Po pierwsze, zamierzam wyizolować ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej za pomocą enzymatycznej dysocjacji miazgi lub wyrastania komórek macierzystych z implantów tkankowych.

Następnie scharakteryzuj i zróżnicuj je na podmuch oogenny. Więc zacznijmy. Pierwszy sposób, przestrzeń i kolagenaza typu pierwszego rozpuszczają się zarówno w PBS.

Następnie przefiltruj je za pomocą filtra strzykawkowego o grubości 0,2 mikrona. Przeciągnij oba do stożkowej rury. Następnie dodaj pener i PBS, aby uzyskać końcowe stężenie.

Przenieś zdrowe zęby mądrości do laboratorium w zimnym podłożu zasadowym w stanie stalowym. Oczyść powierzchnię zęba za pomocą 70% etanolu przed badaniem. Upewnij się, że usunąłeś wiatr z powierzchni zęba.

Wytnij ząb wokół połączenia szkliwa cementowego za pomocą wysterylizowanego dysku dentystycznego, aby odsłonić komorę miazgi. Należy wziąć pod uwagę, że proces cięcia musi być wykonywany powoli, aby zmniejszyć przegrzanie tkanki zębowej. Następnie delikatnie oddziel tkankę miazgi od korony, czyli tkankę miazgi na jedno- lub dwumilimetrowe kawałki za pomocą ostrza Scarpa.

Przenieś małe kawałki tkanek miazgi do jednego mililitrowego roztworu enzymatycznego na godzinę w wirze o temperaturze 37 stopni Celsjusza co 30 minut, aby pomóc w rozbiciu tkanek miazgi. Następnie usuń duże agregaty, przepuszczając je przez szczep komórek o grubości 70 mikronów. Następnie dodać PBS zawierające wirówki PENER przy 1 200 obr./min przez pięć minut.

Ostrożnie usuń supernat. Następnie zawieszamy płytkę w pożywce proliferacyjnej, przenosimy ją do kolby hodowlanej i dodajemy pożywkę. Następnie inkubować w inkubacji.

Zmieniaj pożywkę co trzy dni, aż do osiągnięcia zbiegu komórek dla metody outwork. Powtórz proces cięcia. Po przecięciu zęba oznacza rozszczepienie tkanek na jednym do dwóch milimetrowych fragmentów.

Następnie umieść je w kulturze. Błysk z proliferacją, średni i inkubowany. Należy wziąć pod uwagę, że całkowita objętość pożywki proliferacyjnej musi być podtrzymywana przez przyczepienie wszystkich kawałków w celu dalszego wzrostu komórek.

Zmień pożywkę po zaobserwowaniu przerostu, a następnie co trzy dni, aż do osiągnięcia zbiegu komórek. W celu immunofenotypowania inkubować oba typy PSC D z przeciwciałami sprzężonymi PE lub FITC przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnie dodaj widoki PBS i centi przy 1 200 obr./min przez pięć minut.

Usunąć supernatant i resus, zawiesić płytkę w PBS i na koniec ocenić markery powierzchniowe za pomocą subkultury cytometru przepływowego, oba typy DPC dla trzech pasaży. Następnie tripsin ice i przenieś je do sześciu czerwonych szalek hodowlanych przy 60% płynności Co, zastąp PM pożywką zębopochodną. Trzy studnie pozostają jako kontrola ujemna przez dodanie cząstek stałych.

Zmieniaj pożywkę co trzy dni w 21 dniu przemyć komórki PBS. Następnie napraw je o jeden mililitr na studzienkę. 10%formalna wysokość żelu przez 15 minut w temperaturze domowej.

Po 15 minutach ostrożnie usuń utrwalacz i trzykrotnie nawiń komórki wodą destylowaną. Następnie zastąp wodę o jeden mililitr na czerwoną alzę w roztworze czerwonej plamy. Po 20 minutach usuwamy nadmiar barwnika i czterokrotnie myjemy komórki wodą dejonizowaną.

Następnie dodaj jeden milimetr na wodę ze studzienki, aby zapobiec wysychaniu komórek. Po barwieniu można zobaczyć, jak trzy szyny w górę zmieniają kolor na czerwony w porównaniu z kontrolkami pod mikroskopem, można zobaczyć absorpcję koloru barwnika wokół komórki w dużym powiększeniu w celu ilościowego określenia czerwonego zabarwienia. Po usunięciu wody dodaj jeden mililitr na studzienkę, 10% kwaśny kwas, a następnie inkubuj przez 30 minut z potrząsaniem.

Następnie delikatnie zeskrob komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek. Następnie przenieś je do oddzielnych probówek. VOR trwa energicznie przez 30 sekund.

Następnie podgrzewaj je do 85 stopni Celsjusza przez 10 minut. Aby uniknąć parowania rurek uszczelniających z rurką transferową ParaView do lodu na pięć minut, zalecano stosowanie ich przy 20 000 G przez 15 minut. W międzyczasie wykonaj standardowe rozcieńczenie seryjne na czerwoną czerwień Alzheimera zgodnie z protokołem regionu.

Po odwirowaniu usuń snat i przenieś go do nowych probówek. Zneutralizuj pH za pomocą 10% hydrocytów amonu. Następnie dodaj wzorce, a także próbki do 96.

Dobrze płytkować, a następnie zmierzyć absorbancję przy 405 nanometrach i przeanalizować dane zgodnie ze standardowym rozcieńczeniem szeregowym. Tutaj możesz zobaczyć DPC, które są izolowane przez dysocjację enzymatyczną w 10., 15. i 18. dniu, a także wyrastające DPC w piątym, dziesiątym, trzynastym i 18. dniu. Oba typy DPS w SASE 3 są prawie tej samej wielkości i morfologii Wyniki immunofenotypowania wskazują na obecność markerów mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak CD 44, CD 73 i CD 19, oraz brak markerów krwiotwórczych i śródbłonkowych, takich jak CD 34, CD 45 i CD 11 B. Co ciekawe, ekspresje CD 1 0 5 i CD 146 są bardziej w wyrośniętych d PSC w porównaniu z D-P-S-C-E-D, Kwantyfikacja enzymatycznego czerwonego barwienia w 21. dniu różnicowania odontoblastów wykazała większe odkładanie się wapnia w D-P-S-C-E-D w porównaniu z komórkami macierzystymi bez zęba.

Wyniki QPCR wskazują również na znacznie wyższą ekspresję MEP i A LP jako markerów mineralizacji w D-P-S-C-D w porównaniu z wychodzącym zębem komórek macierzystych. Tymczasem oba geny są regulowane podczas różnicowania, a także ekspresji DSPP, ponieważ marker zębopochodny wzrastał podczas różnicowania. Nie ma jednak znaczącej różnicy w ekspresji DSVP w zróżnicowanych komórkach między grupami ED i OG.

Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować komórki macierzyste ludzkich części zębów za pomocą enzymatycznej dysocjacji miazgi lub wyrastania komórek macierzystych z tkanki. Więc to wszystko. Życzę powodzenia w próbie zastosowania tej procedury w swoim eksperymencie.

Dziękuję.