Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Badamy glikobiologię interakcji mikroorganizmów gospodarza w przewodzie pokarmowym, ze szczególnym uwzględnieniem roli warstwy śluzu pokrywającej przewód pokarmowy (GAI), a w szczególności mucyn i ich glikanów w zdrowiu i chorobie. Glikany mucynowe są coraz częściej uznawane za ważne czynniki interakcji gospodarz z mikroorganizmem, ponieważ dostarczają składników odżywczych i miejsc wiązania dla bakterii. Zmiana profilu glikozylacji może prowadzić do zaburzeń składu mikrobiotycznego i odwrotnie, do fenotypów powszechnie obserwowanych w stanach chorobowych.

Jednak muciny są notorycznie trudne do badania, ponieważ są silnie glikozylowane. Innowacje w technikach pobierania próbek i analizie bioinformatycznej mogą posunąć pole naprzód, a także nowe metody przetwarzania próbek, zwiększając przepustowość i skrócając czas od pobrania próbki do uzyskania rezultatów. Inne techniki analityczne pozwalają na bardziej szczegółową charakterystykę struktury glikanów, ale wymagają długiego czasu analizowania i analizy.

Technika opisana tutaj z użyciem spektrometrii mas MALDI-TOF ma przewagę szybkości, co czyni ją wysokoprzepustową i odpowiednią do przesiewania oraz profilowania. Na początek wymieszaj oczyszczone śluzy z 250 mikrolitrami buforu beta-eliminacyjnego w szklanej fiolce o pojemności czterech mililitrów. Szczelnie zamknąć fiolkę za pomocą koreczki wyłożonej politetrafluoroetylenem i inkubować reakcję w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 16 godzin.

Na lodzie dodaj jeden mililitr 5% roztworu kwasu octowego do mieszanki reakcyjnej kropelami. Aby odsolić próbkę, zatkaj szklaną pipetę niewielką ilością wełny szklanej. Dodaj 1,5 mililitra zawiesiny żywicy do szklanej pipety od góry, następnie pozwól jej się osadzać i odprowadzić.

Teraz przemyj żywicę dwoma mililitrami kwasu octowego 5% i usuń przepływ. Następnie dodaj próbkę mucyny do kolumny odsolującej i zbieraj przepływ w probówce pięciomilimetrowej. Przepłucz kolumnę dwa razy jednym mililitrem 5% kwasu octowego, aby zebrać przepływ.

Następnie za pomocą odśrodkowego parownika usuwa się kwas octowy i koncentruje próbkę w temperaturze pięciu milibarów i 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Rozpuść próbkę w 0,5 mililitra kwasu octowego metanolowego i wysuszyć pod strumieniem azotu. Za pomocą szklanej strzykawki dodaj cztery mililitry DMSO do fiolki zawierającej mieszaninę wodorotlenku sodu i metanolu.

Po wirowaniu wiruj roztwór w 2 000 G przez dwie minuty. Ostrożnie przelej supernatant i usuń sole bez zakłócania żelu. Po upewnieniu się, że nie powstają już żaglowe sole, ponownie zawiesij żel w czterech mililitrach bezwodnego DMSO, aby przygotować zawiesinę bazy permetylacyjnej.

Następnie do wysuszonej próbki muciny dodaj bezwodny DMSO i zasadę permetylacyjną, a zaraz potem jodometan. Inkubuj reakcję permetylacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z intensywnym potrząsaniem. Następnie dodaj 0,5 mililitra wody, aby zakończyć reakcję.

Gdy próbka stanie się mętna, przepłucz ją azotem, aż stanie się przezroczysta. Załaduj próbkę na hydrofilową płytę lipofilową z 96 dołkami do ekstrakcji równowagi lipofilowej. Zastosowanie dodatniego ciśnienia, aby przepchnąć próbki przez fazę stałą z przepływem około jednego mililitra na minutę.

Po odrzuceniu przepływu przepłucz studnie dwa razy jednym mililitrem wody. Dwukrotnie wydłuż glikany z płyty jednym mililitrem metanolu. Naciskaj tylko do momentu, gdy metanol zacznie wypływać z płyty, a następnie pozwól przepływowi grawitacji utrzymać wymaganą szybkość.

Próbkę wysusz za pomocą odśrodkowego parownika i rozpuści w 10 mikrolitrach TA50. Po wymieszaniu jednego mikrolitra próbki z matrycą, załaduj ją na stalową tarczę MALDI i pozwól wyschnąć. Do analizy danych załaduj eksportowany plik ASCII z zakresu mas w GlycoWorkbench.

Po wykonaniu korekcji bazowej oblicz szczytowe centroidy i w oknie wyskakującym wybierz odpowiedni zakres mas, minimalny stosunek sygnału do szumu oraz minimalną szczytową intensywność spektrometrii mas. Następnie użyj narzędzia Glyco-Peakfinder, aby zidentyfikować skład struktur odpowiadający liście pików. Wybierz perMe jako derywityzację, redEnd jako koniec redukujący i ustaw minimalną oraz maksymalną liczbę oczekiwanych reszt.

Dla mucyn wybierz Heksozę, N-acetylo-heksozaminę, deoksy-heksozę oraz N-kwas acetyloneuraminowy. Dla glikanów siarczanowych stosuj opcję Other residue o masie 87,9. Dla danych MALDI-TOF ustaw maksymalną liczbę jonów sodu i ładunków na jeden każdy, a dokładność na 0,5 Daltonów.

Zaznacz wszystkie poprawne adnotacje Control i kliknij na każdą z nich. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wybrane adnotacje i wybierz Dodaj do listy pików z adnotacjami. Aby wygenerować raport porównujący wiele adnotowanych widm, przejdź do Narzędzi, następnie do Raportowania i stwórz raport porównujący różne profile.

Wydrukuj raport w formacie PDF, aby go zapisać. Do analizy fragmentacyjnych widm załaduj widma na GlycoWorkbench i generuj listę pików, jak pokazano wcześniej. Narysuj domniemane struktury glikanowe, które odpowiadają anotowanym składom glikanowym.

Aby wygenerować fragmenty dla każdej struktury, kliknij prawym przyciskiem, aby wybrać Skopiuj fragmenty na płótno i wybierz Obliczaj fragmenty w narzędziu Fragmenty. Aby uzyskać dalszą analizę fragmentacji, kliknij na interesujący szczyt w podglądzie widma. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Znajdź wszystkie struktury odpowiadające szczytom, aby sprawdzić wskaźnik opłat głównych wybranego szczytu w bazach danych online.

Wybierz domniemane struktury interesujące i kliknij prawym przyciskiem, aby skopiować je do okna canvas z odpowiednią opcją. Aby obliczyć możliwe fragmenty z każdej struktury glikanu, wybierz strukturę na płótnie. Następnie, w sekcji narzędzia i fragmenty, wybierz fragmenty obliczeniowe dla bieżącej struktury.

Jeśli obliczono fragmenty dla więcej niż jednej struktury glikanowej, przejdź do widoku tabeli Fragmenty w zakładce Podsumowanie, aby zobaczyć tabelę porównawczą. Wybierz fragmenty odpowiadające liście pików dla każdej potencjalnej struktury glikanowej. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Kopiuj fragmenty do płótna z menu rozwijanego.

Na koniec, w zakładce Narzędzia, przejdź do Profilera, a następnie do Annotate peaks ze wszystkimi strukturami. Następnie wybierz Narzędzia, Raportowanie i Utwórz raport adnotacji. Odsolonie przez wymianę jonową pozwoliło na lepsze odzyskiwanie większych glikanów, przy czym te większe struktury stanowiły 31% całkowitej liczby glikanów, w porównaniu do 21% przy ekstrakcji PGC.

Spośród zidentyfikowanych struktur glikanowych, jeden glikan został zidentyfikowany tylko poprzez próbkę odsoloną metodą wymiany jonowej. Ponadto odsolenie przez wymianę jonową i usuwanie boranów doprowadziło do powstania widm o wyższych stosunkach sygnał-szum w porównaniu do tych powstałych po odsolaniu w fazie stałej za pomocą PGC. Czas reakcji permetylacji wynoszący 30 i 90 minut pozwolił zidentyfikować 33 piki glikanu, podczas gdy reakcja trwająca pięć minut zidentyfikowała tylko 31 pików.