Name: Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę analizy O-glikanów z mucyn za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF. Technika ta umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe profilowanie glikanów w badaniach nad interakcjami gospodarz-mikroorganizm w przewodzie pokarmowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor(i) z wdzięcznością dziękują za wsparcie Rady Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC); badania te zostały sfinansowane przez Strategiczny Program Mikrobiomu i Zdrowie BBSRC Instytutu BBSRC BB/X011054/1 oraz jego projekt składowy BBS/E/F/000PR13632 (Temat 3, Wyjaśnienie, jak żywność roślinna wpływa na reakcje gospodarzy).

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 , aby zobaczyć schematyczne przedstawienie przepływu pracy.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67751/67751fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego przepływu pracy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67751/67751fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
1. Uwalnianie glikanu
<ol>
	<li>Przygotowanie bufora eliminacyjnego β UWAGA: Należy przygotować go świeżo przed każdym użyciem.<ol>
		<li>Zważ granulat wodorotlenku sodu (NaOH) i rozpuści go w odpowiedniej ilościH2 Ow probówce o pojemności 50 mL, aby uzyskać roztwór 0,1 M.</li>
		<li>W probówce o pojemności 5 ml rozpuścić 189 mg borowodniku sodu (NaBH4) w 5 mL roztworu alkalicznego przygotowanego powyżej w kroku 1.1.1. UWAGA: NaOH jest, a NaBH4 , toksyczny, łatwopny i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Oba chemikalia powinny być obsługiwane pod spalinami przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Nie rozpuszczaj NaBH4 bezpośrednio wH2O, ponieważ rozkłada się i uwalnia wodór, który może się samozapalić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie reakcji eliminacyjnej β<ol>
		<li>W szklanej fiolce o pojemności 4 mL rozpuścić do 100 μg oczyszczonej błony śluzowej w 250 μL H2O. UWAGA: Niektóre śluzy mogą nie rozpuszczać się w pełni i zamiast tego tworzyć zawiesinę bardzo małych cząstek.</li>
		<li>Dodaj 250 μL buforu eliminacyjnego β i szczelnie zamknij fiolkę nakrętką wyłożoną PTFE. Inkubuj reakcję w 45 °C przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymanie reakcji<ol>
		<li>W szklanej butelce o pojemności 100 mL dodaj 5 ml kwasu octowego lodowcowego do 95 ml H2O (stężenie 5% (v/v)). UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze pokojowej i ponownie używać. UWAGA: Kwas octowy jest łatwopalny i i powinien być używany w szafce z oparami wraz z odpowiednim sprzętem ochronnym.</li>
		<li>Na lodzie dodaj 1 ml 5% roztworu kwasu octowego do każdej reakcji (krok 1.2.3) kroplami. W tym momencie należy spodziewać się emerwekcji wynikającej z uwolnienia wodoru z nadmiaru NaBH4. Jeśli musowanie nie ustało po dodaniu 1 mL kwasu octowego 5%, powtórz ten krok. UWAGA: Jeśli po dodaniu 5% kwasu octowego nie występuje musowanie, reakcja eliminacji β może być niepełna lub nieudana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie próbek<ol>
		<li>W szklanej butelce o pojemności 100 ml przygotuj gęstą zawiesinę żywicy kationowej w formie H+ , 200-400 mesh w kwasie octowym 5% (v/v).</li>
		<li>Zatkaj szklaną pipetę niewielką ilością wełny szklanej. Dodaj 1,5 mL zawiesiny żywicy na szklaną pipetę od góry i pozwól jej się osadzać oraz odpłynąć. To stworzy kolumnę odsalania.</li>
		<li>Umyj żywicę 2 ml kwasu octowego o stężeniu 5%. Usuń przepływ.</li>
		<li>Dodaj próbkę mucyny do kolumny odsalania. Zbierz przepływ w probówce 5 mL.</li>
		<li>Płucz fiolki 1 ml kwasu octowego 5% i załaduj je do kolumny odsalania. Zbierz przepływ w tej samej rurce.</li>
		<li>Przemyj kolumnę 2 razy 1 mL kwasu octowego o stężeniu 5%. Zbierz przepływ w tej samej rurce.</li>
		<li>Użyj odśrodkowego parownika do usunięcia kwasu octowego i skoncentrowania próbek (5 mbar, 30 °C, 2 godziny).</li>
		<li>Zamroź próbki w temperaturze -80 °C i wysusz je przez noc w liofilizacji. UWAGA: Alternatywnie, odśrodkowe odparowanie może być suche, ale utrudnia ponowne rozpuszczanie próbek.</li>
		<li>W szklanej butelce o pojemności 100 ml dodaj 5 ml kwasu octowego do 95 ml metanolu (stężenie 5% (v/v)). UWAGA: Metanol jest łatwopalny i toksyczny. Powinna być używana w szafie na spaliny z niezbędnym sprzętem ochronnym.</li>
		<li>Rozpuszcz próbki w 0,5 mL kwasu octowego metanolowego i susz je pod strumieniem azotu. Powtarzaj ten krok 3-5 razy. Przechowuj wysuszone próbki w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Permetylacja glikanów<ol>
		<li>W szklanej fiolce o pojemności 8 mL dokładnie wymieszaj 50% roztwór NaOH (0,2 mL) z 0,4 mL metanolu i dokładnie przeprowadź wiry. Powstanie biały osad, który szybko się rozpuści.</li>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki dodaj 4 mL bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dokładnie przeprowadź wiry.</li>
		<li>Wiruj roztwór przez 2 minuty przy 2000 × g. Tworzy to żel na dnie tubki, fazę ciekłą w środku, a sole gromadzą się na górze.</li>
		<li>Ostrożnie przelewaj supernatant i sole, nie zakłócając żelu.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 1.5.2-1.5.4 5 razy, aż nie powstaną już sole. Jeśli sole przyklejają się do ścian rurki, delikatnie zakręć rurką, aby sole się zawiesiły, nie naruszając żelu na dnie, lub usuń je za pomocą szklanej pipety Pasteura.</li>
		<li>Gdy nie powstają już żagle, ponownie zawiesić żel w 4 mL bezwodnego DMSO. Ta zawiesina stanowi bazę permetylacji. UWAGA: Ta ilość zasady permetylacyjnej wystarcza na ~25 próbek. Ilości można odpowiednio dostosowywać.</li>
		<li>Do wysuszonych próbek dodaj 100 μL bezwodnego DMSO oraz 150 μL zasady permetylacji. Używając szklanej pipety, jak najszybciej dodaj 80 μL jodometanu, aby uniknąć absorpcji wilgoci ze środowiska. UWAGA: Jodometan jest toksyczny i stanowi zagrożenie dla zdrowia oraz środowiska. Powinna być używana w szafie na spaliny z niezbędnym sprzętem ochronnym.</li>
		<li>Inkubuj reakcje permetylacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z intensywnym potrząsaniem.</li>
		<li>Dodaj 0,5 mLH2O, aby zakończyć reakcję. Próbki stają się mętne. UWAGA: Jeśli próbki nie stają się mętne, możliwe, że reakcja permetylacji była niekompletna.</li>
		<li>Przepłukaj próbki azotem, aż staną się przezroczyste.</li>
		<li>Próbki ładują się na płytkę ekstrakcyjną z 96 dołami (60 mg) lub na wkładki HLB z hydrofilowo-lipofilową (HLB). Zastosowanie dodatniego ciśnienia, aby przepchnąć próbki przez fazę stałą z przepływem ~1 mL/min. Jeśli używasz wkładów HLB, użyj gumowego sutka lub kolektora próżniowego do wywierania nacisku na próbki. Usuń przepływ.</li>
		<li>Płucz studnie 2 x 1 mL H2O. Wprowadź dodatnie ciśnienie i usuń przepływ.</li>
		<li>Eluluj glikany z płyty HLB za pomocą 1 mL metanolu. Nacisk stosuj tylko do momentu, gdy metanol zacznie wypływać z płyty. Wtedy przepływ grawitacyjny wystarcza, by uzyskać wymaganą szybkość. Zbierz przepływ.</li>
		<li>Powtórz krok elucii jeszcze raz.</li>
		<li>Susz próbki za pomocą odśrodkowego parownika</li>
		<li>W szklanej fiolce o pojemności 4 mL przygotuj bufor TA50, mieszając 1 mL acetonitrylu, 998 μLH2Ooraz 2 μL kwasu trifluoroctowego. UWAGA: Acetonitryl jest łatwopalny, a kwas trifluorooctowy. Oba powinny być używane w spalinach, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.</li>
		<li>W rurce mikrowirówki przygotuj roztwór matrycy, rozpuszczając 10 mg super-DHB [9:1 (w/w) mieszanina 2,5-dihydroksy benzoesowego i 2-hydroksy-5-metoksybenzoowego] w 1 mL T50.</li>
		<li>Rozpuszcz wysuszone próbki w 10 μL TA50.</li>
		<li>Wymieszaj 1 μL próbki z 1 μL roztworu matrycowego, nałóż na stalową tarczę MALDI i pozwól wyschnąć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza próbek MALDI TOF
<ol>
	<li>Konfiguracja do pozyskiwania danych rodziców jonów<ol>
		<li>Wystrzel 1000 strzałów z lasera z 50% intensywności. UWAGA: Mogą się one różnić w zależności od globalnych ustawień instrumentów i można je regulować w razie potrzeby.</li>
		<li>W zakładce Laser Carrier ustaw ustawienie losowego przejścia na complete sample.</li>
		<li>W zakładce Detekcja ustaw zakres mas na 500 - 3 000; Zwiększ ten zakres, jeśli obserwuje się silne szczyty w zakresie 2 500-3 000 m/z. Ustaw wzmocnienie detektora na 20x. UWAGA: Wzmocnienie może się zmieniać w zależności od globalnych ustawień instrumentu i można go dostosować w razie potrzeb.</li>
		<li>W zakładce Spektrometr ustaw polaryzację na dodatnią , a tłumienie macierzy na Odchylenie, 300 Da.</li>
		<li>Kliknij Start | Po zakończeniu akwizycji danych zapisz jako zapis danych w odpowiednim katalogu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwarcie widm macierzystych w celu uzyskania widm fragmentacyjnych<ol>
		<li>Po kliknięciu prawym przyciskiem myszy na spektrum wybierz listę Znajdź masę.</li>
		<li>Z wygenerowanej listy wybierz odpowiednie jony do fragmentacji i kliknij "Dodaj do listy MS/MS" po kliknięciu prawym przyciskiem myszy na wybrane szczyty.</li>
		<li>Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy na listę mas i wybierz listę MS/MS.</li>
		<li>Kliknij Wyślij do flexControl.</li>
		<li>W flexControl załaduj metodę LIFT i przejdź do zakładki LIFT .</li>
		<li>Wybierz każdy załadowany szczyt pojedynczo i uzyskaj zarówno jony rodzica, jak i fragmentu, przełączając się między trybem Rodzica i Fragmentów. Dostosowuj intensywność lasera i liczbę strzałów w zależności od potrzeb. Kliknij Zapisz, aby zapisać dane po fragmentacji każdego jonu rodzica.</li>
		<li>Eksportuj widma w formacie '.ascII'. UWAGA: Można to później zaimportować do Glycoworkbench do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych za pomocą glikoworkbench<ol>
		<li>W Glycoworkbench załaduj eksportowany plik .ascII ze spektrum mas i wykonaj korekcję bazową oraz filtrowanie szumów za pomocą odpowiednich przycisków na dole okna, przed obliczeniem szczytowych centroidów. W oknie wyskakującym wybierz odpowiedni zakres mas, minimalny stosunek sygnału do szumu oraz minimalną intensywność szczytową MS.</li>
		<li>Po obliczeniu punktów ciężkości szczytów użyj narzędzia Glyco-Peakfinder, aby znaleźć skład struktur odpowiadający liście szczytów. Wybierz perMe jako derywację, redEnd jako Redukującą Koniec, a minimalną i maksymalną liczbę oczekiwanych reszt.<ol>
			<li>Dla mucin wybierz Heksozę, N-Acetyl-Heksozaminę, Deoksy-Heksozę oraz N-Acetylo-Neuraminowy Kwas Neutraminowy. Dla glikanów siarczanowych stosuj drugą opcję resztową o masie 87,9. Dla danych MALDI-TOF ustawione są jony Max # Na i ładunki Max # ustawione na 1, a dokładność na 0,5 Da. UWAGA: Dokładność może wymagać dalszego zwiększenia w zależności od kalibracji spektrometru mas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz wszystkie poprawne adnotacje, przytrzymując Control i klikając każdą adnotację; Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na adnotację i wybierz Dodaj do listy pików z adnotacjami.</li>
		<li>Aby wygenerować raport porównujący wiele anotowanych widm, w zakładce narzędzi, w sekcji raportowanie, wybierz Utwórz raport porównujący różne profile. Wydrukuj raport w formacie PDF, aby go zapisać.</li>
		<li>Po zidentyfikowaniu pików glikanowych, oblicz względną obfitość każdej pojedynczej struktury jako procent całkowitej powierzchni pod krzywą wszystkich pików glikanowych.</li>
		<li>Do analizy widm fragmentacji załaduj widma na Glycoworkbench i generuj listę pików zgodnie z krokiem 2.3.1.</li>
		<li>Narysuj domniemane struktury glikanowe, które odpowiadają anotowanym składom glikanowym. Generuj fragmenty dla każdej narysowanej struktury, wybierając odpowiednią opcję fragmentów obliczeniowych w narzędziu Fragmenty . Następnie zaznacz wszystkie fragmenty, kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij Skopiuj fragmenty na płótno.</li>
		<li>Aby dodatkowo wesprzeć analizę fragmentacji, wybierz interesujący szczyt, klikając na niego w podglądzie widma. Następnie, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając "Znajdź wszystkie struktury pasujące do szczytów", przeanalizuj m/z wybranego szczytu w internetowych bazach danych dotyczących domniemanych struktur glikanowych.</li>
		<li>Wybierz potencjalne struktury interesujące nas i skopiuj je do okna canvas programu, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając odpowiednią opcję.</li>
		<li>Aby obliczyć możliwe fragmenty, które można wygenerować z każdej struktury glikanowej, wybierz interesującą na płótnie, a następnie w zakładce Narzędzia wybierz fragmenty i Obliczaj fragmenty dla bieżącej struktury.</li>
		<li>Jeśli obliczono fragmenty dla więcej niż jednej struktury glikanowej, zobacz tabelę porównawczą w zakładce podsumowania , w widoku tabeli Fragmenty .</li>
		<li>Wybierz fragmenty odpowiadające liście szczytów dla każdej potencjalnej struktury glikanu i wybierz Kopiuj fragmenty na płótno z menu rozwijanego kliknięcia prawym przyciskiem.</li>
		<li>W zakładce Narzędzia , w sekcji profiler, wybierz annotate peaks with all structures , a następnie kliknij Tools | Raportowanie | Stwórz raport z adnotacji. Wydrukuj raport w formacie PDF, aby go zapisać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bergstrom, K. S. B., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans+and+their+roles+in+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans and their roles in intestinal homeostasis.</a> Glycobiology. 23 (9), 1026-1037 (2013).</li>
<li>Leal, J., Smyth, H. D. C., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+of+mucus+and+their+impact+on+transmucosal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties of mucus and their impact on transmucosal drug delivery.</a> Int J Pharm. 532 (1), 555-572 (2017).</li>
<li>Ambort, D., Johansson, M. E. V., Gustafsson, J. K., Ermund, A., Hansson, G. C. Perspectives on mucus properties and formation--lessons from the biochemical world. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmbort%2C+D+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22">Cold Spring Harb Perspect Med</a>. 2 (11), a014159(2012).</li>
<li>Cone, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+of+mucus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Barrier properties of mucus.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61 (2), 75-85 (2009).</li>
<li>Kim, Y. S., Ho, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+goblet+cells+and+mucins+in+health+and+disease%3A+recent+insights+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gastroenterol+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress.</a> Curr Gastroenterol Rep. 12 (5), 319-330 (2010).</li>
<li>Bell, A., Severi, E., Owen, C. D., Latousakis, D., Juge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+structural+basis+of+sialic+acid+utilization+by+gut+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical and structural basis of sialic acid utilization by gut microbes.</a> J Biol Chem. 299 (3), 102989(2023).</li>
<li>Shuoker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialidases+and+fucosidases+of+Akkermansia+muciniphila+are+crucial+for+growth+on+mucin+and+nutrient+sharing+with+mucus-associated+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Sialidases and fucosidases of Akkermansia muciniphila are crucial for growth on mucin and nutrient sharing with mucus-associated gut bacteria.</a> Nat Commun. 14 (1), 1833(2023).</li>
<li>Tailford, L. E., Crost, E. H., Kavanaugh, D., Juge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin+glycan+foraging+in+the+human+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Mucin glycan foraging in the human gut microbiome.</a> Front Genet. 6, 81(2015).</li>
<li>Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mucin-type+O-glycans+in+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of mucin-type O-glycans in cell adhesion.</a> Biochim Biophys Acta. 1573 (3), 394-405 (2002).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans%3A+Barrier%2C+microbiota%2C+and+immune+anchors+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans: Barrier, microbiota, and immune anchors in inflammatory bowel disease.</a> J Inflamm Res. 14, 5939-5953 (2021).</li>
<li>Sheng, Y. H., Hasnain, S. Z., Florin, T. H. J., McGuckin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+inflammatory+bowel+diseases+and+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Mucins in inflammatory bowel diseases and colorectal cancer.</a> J Gastroenterol Hepatol. 27 (1), 28-38 (2012).</li>
<li>Juge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+mucosa-associated+gut+microbiota+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Relationship between mucosa-associated gut microbiota and human diseases.</a> Biochem Soc Trans. 50 (5), 1225-1236 (2022).</li>
<li>Wilkinson, H., Saldova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+the+characterization+of+O-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Current methods for the characterization of O-glycans.</a> J Proteome Res. 19 (10), 3890-3905 (2020).</li>
<li>Goso, Y., Kurihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS%2FMS+analysis+of+permethylated+O-glycan+alditols+released+from+mucins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS/MS analysis of permethylated O-glycan alditols released from mucins.</a> Methods Mol Biol. 2763, 201-208 (2024).</li>
<li>Kameyama, A., Thet Tin, W. W., Toyoda, M., Sakaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+method+of+liberating+O-linked+glycans+from+glycoproteins+using+hydroxylamine+and+an+organic+superbase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+and+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A practical method of liberating O-linked glycans from glycoproteins using hydroxylamine and an organic superbase.</a> Biochem and Biophys Res Commun. 513 (1), 186-192 (2019).</li>
<li>Vos, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+release+of+O-glycans+under+neutral+conditions+for+analysis+of+glycoconjugates+having+base-sensitive+substituents%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidative release of O-glycans under neutral conditions for analysis of glycoconjugates having base-sensitive substituents.</a> Anal Chem. 95 (23), 8825-8833 (2023).</li>
<li>Furuki, K., Toyo'oka, T., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+glycosylamine+labelling+of+O-glycans+using+non-reductive+%CE%B2-elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive glycosylamine labelling of O-glycans using non-reductive β-elimination.</a> Anal Bioanal Chem. 409 (9), 2269-2283 (2017).</li>
<li>Miura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoblotting-assisted+O-glycomics%3A+ammonium+carbamate+allows+for+highly+efficient+o-glycan+release+from+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analy+Chemi%22%5BJournal%5D)">Glycoblotting-assisted O-glycomics: ammonium carbamate allows for highly efficient o-glycan release from glycoproteins.</a> Analy Chemi. 82 (24), 10021-10029 (2010).</li>
<li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+suppression+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chemi%22%5BJournal%5D)">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clin Chemi. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr.+B%2C+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J Chromatogr. B, Analyt Technol Biomed Life Sci. 879 (17-18), 1196-1225 (2011).</li>
<li>Jang-Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+profiling+of+cells+and+tissues+by+mass+spectrometry%3A+fingerprinting+and+sequencing+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Glycomic profiling of cells and tissues by mass spectrometry: fingerprinting and sequencing methodologies.</a> Glycobiology. 415, 59-86 (2006).</li>
<li>Zhou, S., Hu, Y., DeSantos-Garcia, J. L., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+permethylated+N-glycans+through+multiple-reaction+monitoring+%28MRM%29+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantitation of permethylated N-glycans through multiple-reaction monitoring (MRM) LC-MS/MS.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 26 (4), 596-603 (2015).</li>
<li>Hu, Y., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spin+column-free+approach+to+sodium+hydroxide-based+glycan+permethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A spin column-free approach to sodium hydroxide-based glycan permethylation.</a> Analyst. 142 (15), 2748-2759 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> J Proteome Res. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Do badania glikanów badacze stosują różnorodne metody, od lektyn do identyfikacji konkretnych epitopów po bardziej zaawansowaną chromatografię cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS) oraz jądrową rezonans magnetyczny (NMR) do uzyskania szczegółowej charakterystyki struktur glikanowych. Główne zalety MALDI-TOF MS w porównaniu z alternatywnymi podejściami to czułość oraz wysoka przepustowość metody13. Jednakże, ponieważ nie ma możliwości rozdzielania związków izobarycznych, różne struktury glikanu o tej samej wartości m/z tworzą mieszankę fragmentów pod MS/MS, którą trudno jest rozłożyć13. Jeśli potrzebne jest określenie dokładnej struktury glikanów muciny, metodą wyboru powinien być LC-MS.
Przedstawiamy protokół analizy glikanów muciny przeprowadzony przez MALDI-TOF MS, który obejmuje wszystkie kluczowe etapy procesu, od uwalniania glikanów, odsolania i permethylacji, po zbieranie i analizę danych. Ważne jest, aby pamiętać, że każdy z tych kroków można realizować różnymi metodami, a każdy z nich wiąże się z nimi zaletą i ograniczeniami.
W tym protokole zastosowaliśmy redukcyjną eliminację β do uwolnienia glikanów. Reakcja zachodzi w warunkach podstawowych. Jeśli próbki muciny są już w zawiesie i nie zostały wcześniej oczyszczone, pH należy sprawdzić za pomocą papieru wskaźnikowego pH; jeśli jest kwaśny, należy go podnieść do pH ~8-9. Ograniczeniem tego podejścia jest to, że podstawowe warunki wymagane do uwalniania glikanów prowadzą również do hydrolizy, a tym samym do utraty grup O-acetylowych, często występujących na kwasach sjalowych, w reakcji zwanej saponifikacją.
Chociaż w literaturze opisano inne metody uwalniania glikanów 15,16,17,18, z których niektóre mogą zachować zmienne grupy O-acetylowe, reduktywna eliminacja β pozostaje złotym standardem w tej dziedzinie. To podejście wymaga wysokiego stężenia soli. Sole i inne zanieczyszczenia supresyjne jonowe muszą być następnie usuwane przed analizą MALDI-TOF19, ponieważ mogą wpływać na efektywność jonizacji i ilościową identyfikację glikanów. Tutaj chromatografia wymiany kationowej, a następnie usuwanie boranu przez odparowanie metanolu, okazała się najskuteczniejszą metodą odsolania uwolnionych glikanów z muciny. W tym przypadku glikany nie oddziałują z żywicą, lecz przepływają przez nią, podczas gdy jony sodu są uwięzione na żywicy. Jednak przygotowanie kolumn wymiany jonowej jest pracochłonne i sprawia, że takie podejście jest nieefektywne przy eksperymentach na dużą skalę z licznymi próbkami. W takich przypadkach może być preferowane odsolonie PGC, ponieważ żywica ta jest również dostępna w formie płyty 96-dołkowej. Jednak, jak przedstawiono powyżej, odsolanie przez ekstrakcję PGC może prowadzić do nieefektywnej eluzji, szczególnie większych glikanów, i należy to uwzględnić przy interpretacji wyników.
Chociaż natywne glikany mogą być również analizowane przez MALDI-TOF, zwykle stosuje się permetylację, ponieważ reakcja ta znacząco zwiększa czułość detekcji, gdyż natywne glikany mają niską efektywność jonizacji20. Ponadto permetylacja ułatwia wykrywanie negatywnie naładowanych glikanów, takich jak glikany siarczanowe lub syalizowane, w trybie dodatnim i zachowuje labilne epitopy glikanu, takie jak kwasy syalowe czy fukoza20. Najczęściej permetylacja trwa 5-10 minut14,21, a niektóre raporty pozwalają na kontynuację reakcji do 40 minuti 22. Tutaj wykazaliśmy, że w testowanych warunkach syylizowane glikany nie były skutecznie wykrywane po 5 minutach permetylacji i wymagana była dłuższa inkubacja.
Oprócz czasu reakcji, kolejnym czynnikiem wpływającym na efektywność permetylacji jest zawartość wody w reakcji. Obecność wody może prowadzić do niedostatecznej lub częściowej metylacji glikanów, gdzie nie wszystkie grupy hydroksylowe zostały przekształcone w grupy metylowe23. Można to łatwo określić, ponieważ po niedości metylacji można zaobserwować grupy szczytów różniące się o 14 Da (różnica mas między grupami hydroksylowymi a metylowymi) w widmach mas. Ten problem można rozwiązać, powtarzając reakcję permetylacji i ponownie analizując dane.
Czynnikiem ograniczającym w analizie glikanów jest interpretacja widm. Pomimo ostatnich postępów, proces ten wciąż jest w dużej mierze ręczny i wymaga dobrej wiedzy oraz zrozumienia szlaków biosyntezy glikanu, aby dokładnie anotować widma. Narzędzia takie jak Glycoworkbench24 mogą pomagać, dostarczając możliwe adnotacje, struktury glikanów i składy, ale ze względu na niejednorodność mieszanin glikanowych, badacze wciąż muszą zdecydować, która opcja jest właściwa. W powyższym przykładzie z użyciem PGM, Glycoworkbench przedstawił dwa potencjalne składy glikanów dla szczytu przy mz 2 025,7620 i na podstawie profilu fragmentacji stwierdziliśmy, że obecna jest struktura fukozylowa, a nie syylowana. Jednak jeśli widmo fragmentacji nie było dostępne (co często zdarza się w przypadku glikanów o niskiej obfitości), badacze mogą oprzeć adnotację na wiedzy, że glikany o składzie Hex3HexNAc1Neu5Ac3 występują na gangliozydach, a nie na mucynach, dlatego ta opcja nie powinna być rozważana w kontekście PGM. Dlatego zidentyfikowane struktury lub składy glikanów powinny być porównywane z wcześniejszymi publikacjami i zgodne z zasadami biosyntezy O-glikanu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi cenne źródło, zwłaszcza dla badaczy początkujących w dziedzinie glikobiologii i zainteresowanych badaniem interakcji zachodzących na granicy błony śluzowej.

Muciny to duże glikoproteiny, które stanowią większość składników strukturalnych śluzu. Są produkowane przez wyspecjalizowane komórki nabłonkowe zwane komórkami pucharu i przechodzą intensywną glikozylację O, zanim zostaną wydzielone na powierzchni błony śluzowej. Glikozylacja mucyn zachodzi w aparacie Golgiego, gdzie rodzina wyspecjalizowanych glikozylotransferaz, transferaz polipeptyd-N-acetylgalaktozaminy (ppGalNAc-T), inicjuje proces, przyłączając resztę GalNAc do seryny (Ser) lub treoniny (Thr)1. Następnie arsenał glikozyltransferaz rozszerza struktury glikanowe, dodając galaktozę (Gal), N-acetyloglukozaminę (GlcNAc), GalNAc, kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac) oraz reszty fukozy (Fuc), podczas gdy inne enzymy modyfikujące węglowodany mogą wykonywać reakcje takie jak sulfatacja glikanów1. Glikany zdobiące szkielet białka mucynowego występują głównie w skupiskach w regionach białkowych bogatych w reszty Ser i Thr, ponieważ grupy hydroksylowe na łańcuchu bocznym tych reszt pełnią funkcję miejsc O-glikozylacji. Ta gęsta glikozylacja nadaje mukinom wygląd "szczoteczki do butelek" i odpowiada za ich właściwości fizyczne, takie jak zdolność do zatrzymywania dużych ilości wody, zdolność do formowania żelu oraz wysoką lepkowatość 2,3. Dzięki tym właściwościom śluzy zapewniają nawilżenie, chronią nabłonek przed odwodnieniem i uszkodzeniami fizycznymi oraz tworzą fizyczną barierę między nabłonkiem a jego mikrośrodowiskiem 4,5. Glikany mucynowe mogą również służyć jako miejsca wiązania oraz źródło węgla dla bakterii komensalnych lub patogennych 6,7,8. Organizacja i skład śluzu odgrywają kluczową rolę w ochronie nabłonka, utrzymując drobnoustroje w pobliżu, ale z dala od powierzchni nabłonka. Glikany mucynowe również uczestniczą w komunikacji między komórkami i adhezji9.
Glikany muciny odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy błony śluzowej, a nieprawidłowe profile glikozylacji muciny wiążą się z upośledzoną funkcją bariery, zmienionym składem mikrobioty, zwiększoną liczbą przerzutów do nowotworów, zapalnymi chorobami jelit (IBD) oraz innymi chorobami 10,11,12. Dlatego badania glikozylacji muciny są ważne dla zrozumienia roli śluzu i mucin w zdrowiu człowieka i mogą prowadzić do opracowania nowych metod leczenia lub zarządzania chorobami.
Techniki oparte na spektrometrii mas należą do najpopularniejszych metod badania glikanów mucynowych. MALDI-TOF MS to miękka technika jonizacji umożliwiająca analizę dużych, nielotnych biocząsteczek, takich jak glikany i glikoproteiny13. Takie podejście oferuje wysoką czułość i szeroki zakres mas, umożliwiając wykrywanie i identyfikację mieszanin glikanowych o niskiej obfitości i różnorodności. Ponadto wzorce fragmentacji uzyskane z eksperymentów z tandemową spektrometrią mas (MS/MS) mogą dostarczyć cennych informacji strukturalnych o składzie glikanu i sekwencji13.
Zazwyczaj analiza glikanów związanych z O z mucin przeprowadzana przez MALDI-TOF MS polega na wieloetapowym procesie, w którym O-glikany są najpierw chemicznie uwalniane z szkieletu białka metodami takimi jak redukcyjne eliminowanie β, następnie odsolane w celu usunięcia soli z uwalniania chemicznego i derytatyzowane w celu zwiększenia jonizacji i wykrywania. Oczyszczone, pochodzące glikany są następnie współkrystalizowane z odpowiednią macierzą MALDI na docelowej płycie MALDI, a następnie pobierane są widma masowe, które dostarczają informacji o masach nienaruszonych jonów glikanowych. Następnie glikany są fragmentowane w eksperymentach MS/MS, aby uzyskać informacje o ich strukturze14. Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania, odsolania i permetylowania glikanów oraz ich analizy przez MALDI-TOF MS.

<table><tbody><tr><td>Szklane pipety pasteura o średnicy 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15202699</td><td>Materiały konsumpacyjne Odniesienie w tekście (jeśli dotyczy): szklana pipeta</td></tr><tr><td>Probówki 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122305</td><td>Materiały spawalnicze</td></tr><tr><td>Płytka ekstrakcyjna HLB z 96 dołami</td><td>Fisher Scientific</td><td>16553290</td><td>Materiały spawalnicze</td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Acetonitrylu</td><td>Fisher Scientific</td><td>15624520</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Bezwodny DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5.89569</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Metanol bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5.89596</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Autoflex spektrometr mas</td><td>Bruker</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>DOWEX 50w x8 żywica, forma H+, siatka 200-400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44519</td><td>Odczynnik Odniesienie w tekście (jeśli dotyczy): żywica wymiany kationowej</td></tr><tr><td>Suchy blok grzejnik</td><td>Dotacja</td><td>QBD2</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Parownik/koncentrator do podgrzewaczy blokowych</td><td>Cole-Palmer</td><td>WZ-36610-99</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>flexAnalysis</td><td>Bruker</td><td></td><td>Oprogramowanie, własnościowe&nbsp;</td></tr><tr><td>flexControl</td><td>Bruker</td><td></td><td>Oprogramowanie, własnościowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Genevac EZ-2</td><td>Biofarmacja</td><td>EZ-2</td><td>Sprzęt Odniesienie w tekście (jeśli dotyczy): parownik odśrodkowy</td></tr><tr><td>szklane fiolki z pasującymi kapslami PTFE (4 mL)</td><td>Wheaton</td><td>DWKW224582-144EA</td><td>Materiały spawalnicze</td></tr><tr><td>szklane fiolki z pasującymi kapslami PTFE (8 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587413</td><td>Materiały spawalnicze</td></tr><tr><td>Wełna szklana</td><td>Supelco</td><td>1.04086</td><td>Materiały spawalnicze</td></tr><tr><td>Gliko-warsztat</td><td>NIE</td><td></td><td>Oprogramowanie; do pobrania z https://glycoworkbench.software.informer.com/</td></tr><tr><td>Wkłady HLB SPE</td><td>Supelco</td><td>57493-U</td><td>Jednorazowe, jako alternatywa dla płyty ekstrakcyjnej HLB z 96 dołkami</td></tr><tr><td>jodometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Tarcza tarczowa MALDI</td><td>Bruker</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Lioseria ModulyoD</td><td>Thermo Fisher</td><td>ModulyoD-230</td><td>Sprzęt Odniesienie w tekście (jeśli dotyczy): liofilizacja</td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Granulki NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Roztwór NaOH 50%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Procesor dodatniego ciśnienia-96</td><td>Wody</td><td>186006961</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>super DHB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50862</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Odczynnik</td></tr></tbody></table>

profilowanie permetylowanych mulynowych o-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana przez macierz spektrometria mas czasu przelotu (MALDI-TOF MS) to potężne narzędzie do profilowania glikanów mucyny, oferujące wysoką czułość i przepustowość. Przedstawiamy szczegółowy protokół analizy glikanów sprzężonych z O z mucyn za pomocą MALDI-TOF MS, obejmujący uwalnianie glikanów, odsolanie, permetylację oraz pozyskiwanie i analizę danych. Badanie to pokazuje, że odsolanie w oparciu o chromatografię jonową-wymiany prowadzi do lepszego odzysku większych glikanów oraz lepszej jakości wyprodukowanych widm w porównaniu z ekstrakcją w fazie stałej przy użyciu porowatego grafityzowanego węgla (PGC). Dodatkowo prace te sugerują, że do efektywnej modyfikacji struktur syylalowanych może być potrzebny dłuższy czas reakcji permetylacji niż obecnie stosowany. Pokazujemy również znaczenie i konieczność danych fragmentacyjnych oraz wcześniejszej wiedzy o szlakach biosyntezy O-glikanów do dokładnej identyfikacji składu i struktury glikanów oraz omawiamy wrodzone korzyści i ograniczenia, jakie MALDI-TOF niesie w analizie O-glikanów mucynowych.

W poniższych wynikach zastosowano śluz żołądka wieprzowego (PGM) do optymalizacji etapów odsalania i permetylacji. Aby porównać dwie powszechnie stosowane metody odsalania, po uwolnieniu glikanów próbki były odsolone albo przez wymianę kationową (jak opisano w powyższym protokole) oraz współodparowywanie boranów z metanolem, albo przez ekstrakcję w fazie stałej za pomocą porowatych kartridży grafityzowanych (PGC). Wymaga to wstępnego przygotowania wkładu 80% acetonitrylem i 100%H2O, kroku mycia z użyciem 0,1% (v/v) kwasu trifluorooctowego (TFA) oraz elokacji glikanów 2 mL 25% acetonitrylu w 0,1% TFA, 2 mL 50% acetonitrylu w 0,1% TFA oraz 2 mL 80% acetonitrylu w 0,1% TFA.
Uzyskane widma po permetylacji analizowano w zakresie m/z 500 do m/z 2 500. W próbce odsolonej i usuwanej boranami zidentyfikowano łącznie 33 struktury glikanowe, natomiast w próbce odsolonej ekstrakcją PGC (Rysunek 2A) zidentyfikowano 32 struktury. W próbce odsolonej PGC (oznaczonej gwiazdką na Rysunku 2A) nie zidentyfikowano żadnej struktury glikanu. Ta analiza porównawcza wykazała, że odzyskiwanie większych glikanów nie było tak efektywne po ekstrakcji PGC w porównaniu do wymiany jonowej. Potwierdza to także względna obfitość większych glikanów, które stanowią 21% całkowitej liczby glikanów po ekstrakcji PGC, w porównaniu do 31% dla wymiany jonowej. Ponadto odsolenie przez wymianę jonów i usuwanie boranów prowadziło do powstania widm o wyższych stosunkach sygnału do szumu w porównaniu z tymi powstającymi po odsolaniu przez ekstrakcję fazą stałą za pomocą PGC (Rysunek 2B).
Aby zoptymalizować czas reakcji permetylacji, aliquoty tej samej reakcji permetylacji były chłodzone przez dodanie H2Ow różnych punktach czasowych (np. 5 min, 30 min lub 90 min). Wyniki wykazały, że można zidentyfikować 33 piki glikanu w zakresie m/z 500 do m/z 2 500, w próbkach permetylowanych przez 30 lub 90 minut, przy czym uzyskane widma są podobne. Dla porównania, przy permetylacji przez 5 minut można było zidentyfikować tylko 31 pików glikanu (Rysunek 3). Co ciekawe, dwie struktury, które nie zostały zidentyfikowane w tym krótszym czasie reakcji (oznaczonej gwiazdką na Rysunku 3), to dwie sylylatowane struktury, co sugeruje, że modyfikacja kwasów syalowych nie jest efektywna w ciągu 5 minut, w testowanych warunkach.
Fragmentacja była stosowana dla każdego szczytu glikanu PGM, aby potwierdzić skład glikanu i określić strukturę glikanu. Przedstawiono tutaj dwa przykłady (Rysunek 4). Na Rysunku 4A przedstawiono widmo fragmentacji szczytu przy 983 m/z. Skład glikanu przypisuje się jako HexNAc2Hex2. Istnieją dwie potencjalne struktury dla tego składu glikanowego: albo Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (glikan 1) lub Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (glikan 2). Fragmentacja tego związku wywołała widmo masowe z pikami, które można przypisać różnym fragmentom glikanu. Szczyt przy m/z 529 i szczyt przy m/z 708 są charakterystyczne dla odpowiednio struktur 1 i 2, i możemy stwierdzić, że zarówno glikany 1, jak i 2 występują w mieszance glikanów PGM.
Na Rysunku 4B przedstawiono widmo fragmentacji szczytu m/z 2 026. Glycoworkbench obliczył dwa potencjalne składy glikanów dla tego szczytu: Hex3HexNAc1Neu5Ac3 oraz Hex3HexNAc4dHex2. Skład syalizowany ma niższą dokładność (odpowiednio ~160 ppm i 178 ppm), co sugeruje, że pierwszy z nich musi być właściwym wyborem. Jednak profil fragmentacji wskazuje na obecność Fuc, a nie Neu5Ac; dlatego druga kompozycja jest właściwa. Tutaj przedstawiono cztery domniemane struktury glikanowe, a widmo zostało oznaczone obliczonymi fragmentami z każdej z nich domniemanych struktur glikanowych. W widmie adnotowanym widzimy, że występują piki charakterystyczne tylko dla glikanów 4 i 6, podczas gdy nie zidentyfikowano pików charakterystycznych dla glikanów 3 i 5. Na podstawie tych danych możemy stwierdzić, że obecne są glikany 4 i 6.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67751/67751fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Porównanie pików glikanów według odsalania i ekstrakcji w fazie stałej. (A) Porównanie profilu glikanu PGM po odsolaniu za pomocą chromatografii wymiany kationowej i usuwania boranów lub ekstrakcji w fazie stałej PGC. (B) Porównanie obu metod odsolania w uzyskanym stosunku sygnału do szumu dla każdego zidentyfikowanego piku glikanowego. Gwiazdka wskazuje glikan, który został zidentyfikowany tylko w próbkach odsolonych przez wymianę kationową i usunięcie boranów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67751/67751fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67751/67751fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Porównanie profilu glikanu PGM po permetylacji przez 5, 30 lub 90 minut. Gwiazdki wskazują syylizowane glikany, które zostały zidentyfikowane dopiero po 30 lub 90 minutach permetylacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67751/67751fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67751/67751fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Przykłady widm fragmentacji glikanów PGM. (A) Fragmentacja piku glikanu przy m/z 983. (B) Fragmentacja szczytu glikanu w m/z 2026. Ramki wskazują potencjalne struktury glikanowe. Liczby nad fragmentami wskazują, z jakiej struktury glikanowej można je wyprowadzić. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67751/67751fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a powerful tool for the profiling of mucin glycans that ...

Badamy glikobiologię interakcji mikroorganizmów gospodarza w przewodzie pokarmowym, ze szczególnym uwzględnieniem roli warstwy śluzu pokrywającej przewód pokarmowy (GAI), a w szczególności mucyn i ich glikanów w zdrowiu i chorobie. Glikany mucynowe są coraz częściej uznawane za ważne czynniki interakcji gospodarz z mikroorganizmem, ponieważ dostarczają składników odżywczych i miejsc wiązania dla bakterii. Zmiana profilu glikozylacji może prowadzić do zaburzeń składu mikrobiotycznego i odwrotnie, do fenotypów powszechnie obserwowanych w stanach chorobowych.Jednak muciny są notorycznie trudne do badania, ponieważ są silnie glikozylowane. Innowacje w technikach pobierania próbek i analizie bioinformatycznej mogą posunąć pole naprzód, a także nowe metody przetwarzania próbek, zwiększając przepustowość i skrócając czas od pobrania próbki do uzyskania rezultatów. Inne techniki analityczne pozwalają na bardziej szczegółową charakterystykę struktury glikanów, ale wymagają długiego czasu analizowania i analizy.Technika opisana tutaj z użyciem spektrometrii mas MALDI-TOF ma przewagę szybkości, co czyni ją wysokoprzepustową i odpowiednią do przesiewania oraz profilowania. Na początek wymieszaj oczyszczone śluzy z 250 mikrolitrami buforu beta-eliminacyjnego w szklanej fiolce o pojemności czterech mililitrów. Szczelnie zamknąć fiolkę za pomocą koreczki wyłożonej politetrafluoroetylenem i inkubować reakcję w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 16 godzin.Na lodzie dodaj jeden mililitr 5% roztworu kwasu octowego do mieszanki reakcyjnej kropelami. Aby odsolić próbkę, zatkaj szklaną pipetę niewielką ilością wełny szklanej. Dodaj 1,5 mililitra zawiesiny żywicy do szklanej pipety od góry, następnie pozwól jej się osadzać i odprowadzić.Teraz przemyj żywicę dwoma mililitrami kwasu octowego 5% i usuń przepływ. Następnie dodaj próbkę mucyny do kolumny odsolującej i zbieraj przepływ w probówce pięciomilimetrowej. Przepłucz kolumnę dwa razy jednym mililitrem 5% kwasu octowego, aby zebrać przepływ.Następnie za pomocą odśrodkowego parownika usuwa się kwas octowy i koncentruje próbkę w temperaturze pięciu milibarów i 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Rozpuść próbkę w 0,5 mililitra kwasu octowego metanolowego i wysuszyć pod strumieniem azotu. Za pomocą szklanej strzykawki dodaj cztery mililitry DMSO do fiolki zawierającej mieszaninę wodorotlenku sodu i metanolu.Po wirowaniu wiruj roztwór w 2 000 G przez dwie minuty. Ostrożnie przelej supernatant i usuń sole bez zakłócania żelu. Po upewnieniu się, że nie powstają już żaglowe sole, ponownie zawiesij żel w czterech mililitrach bezwodnego DMSO, aby przygotować zawiesinę bazy permetylacyjnej.Następnie do wysuszonej próbki muciny dodaj bezwodny DMSO i zasadę permetylacyjną, a zaraz potem jodometan. Inkubuj reakcję permetylacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z intensywnym potrząsaniem. Następnie dodaj 0,5 mililitra wody, aby zakończyć reakcję.Gdy próbka stanie się mętna, przepłucz ją azotem, aż stanie się przezroczysta. Załaduj próbkę na hydrofilową płytę lipofilową z 96 dołkami do ekstrakcji równowagi lipofilowej. Zastosowanie dodatniego ciśnienia, aby przepchnąć próbki przez fazę stałą z przepływem około jednego mililitra na minutę.Po odrzuceniu przepływu przepłucz studnie dwa razy jednym mililitrem wody. Dwukrotnie wydłuż glikany z płyty jednym mililitrem metanolu. Naciskaj tylko do momentu, gdy metanol zacznie wypływać z płyty, a następnie pozwól przepływowi grawitacji utrzymać wymaganą szybkość.Próbkę wysusz za pomocą odśrodkowego parownika i rozpuści w 10 mikrolitrach TA50. Po wymieszaniu jednego mikrolitra próbki z matrycą, załaduj ją na stalową tarczę MALDI i pozwól wyschnąć. Do analizy danych załaduj eksportowany plik ASCII z zakresu mas w GlycoWorkbench.Po wykonaniu korekcji bazowej oblicz szczytowe centroidy i w oknie wyskakującym wybierz odpowiedni zakres mas, minimalny stosunek sygnału do szumu oraz minimalną szczytową intensywność spektrometrii mas. Następnie użyj narzędzia Glyco-Peakfinder, aby zidentyfikować skład struktur odpowiadający liście pików. Wybierz perMe jako derywityzację, redEnd jako koniec redukujący i ustaw minimalną oraz maksymalną liczbę oczekiwanych reszt.Dla mucyn wybierz Heksozę, N-acetylo-heksozaminę, deoksy-heksozę oraz N-kwas acetyloneuraminowy. Dla glikanów siarczanowych stosuj opcję Other residue o masie 87,9. Dla danych MALDI-TOF ustaw maksymalną liczbę jonów sodu i ładunków na jeden każdy, a dokładność na 0,5 Daltonów.Zaznacz wszystkie poprawne adnotacje Control i kliknij na każdą z nich. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wybrane adnotacje i wybierz Dodaj do listy pików z adnotacjami. Aby wygenerować raport porównujący wiele adnotowanych widm, przejdź do Narzędzi, następnie do Raportowania i stwórz raport porównujący różne profile.Wydrukuj raport w formacie PDF, aby go zapisać. Do analizy fragmentacyjnych widm załaduj widma na GlycoWorkbench i generuj listę pików, jak pokazano wcześniej. Narysuj domniemane struktury glikanowe, które odpowiadają anotowanym składom glikanowym.Aby wygenerować fragmenty dla każdej struktury, kliknij prawym przyciskiem, aby wybrać Skopiuj fragmenty na płótno i wybierz Obliczaj fragmenty w narzędziu Fragmenty. Aby uzyskać dalszą analizę fragmentacji, kliknij na interesujący szczyt w podglądzie widma. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Znajdź wszystkie struktury odpowiadające szczytom, aby sprawdzić wskaźnik opłat głównych wybranego szczytu w bazach danych online.Wybierz domniemane struktury interesujące i kliknij prawym przyciskiem, aby skopiować je do okna canvas z odpowiednią opcją. Aby obliczyć możliwe fragmenty z każdej struktury glikanu, wybierz strukturę na płótnie. Następnie, w sekcji narzędzia i fragmenty, wybierz fragmenty obliczeniowe dla bieżącej struktury.Jeśli obliczono fragmenty dla więcej niż jednej struktury glikanowej, przejdź do widoku tabeli Fragmenty w zakładce Podsumowanie, aby zobaczyć tabelę porównawczą. Wybierz fragmenty odpowiadające liście pików dla każdej potencjalnej struktury glikanowej. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Kopiuj fragmenty do płótna z menu rozwijanego.Na koniec, w zakładce Narzędzia, przejdź do Profilera, a następnie do Annotate peaks ze wszystkimi strukturami. Następnie wybierz Narzędzia, Raportowanie i Utwórz raport adnotacji. Odsolonie przez wymianę jonową pozwoliło na lepsze odzyskiwanie większych glikanów, przy czym te większe struktury stanowiły 31% całkowitej liczby glikanów, w porównaniu do 21% przy ekstrakcji PGC.Spośród zidentyfikowanych struktur glikanowych, jeden glikan został zidentyfikowany tylko poprzez próbkę odsoloną metodą wymiany jonowej. Ponadto odsolenie przez wymianę jonową i usuwanie boranów doprowadziło do powstania widm o wyższych stosunkach sygnał-szum w porównaniu do tych powstałych po odsolaniu w fazie stałej za pomocą PGC. Czas reakcji permetylacji wynoszący 30 i 90 minut pozwolił zidentyfikować 33 piki glikanu, podczas gdy reakcja trwająca pięć minut zidentyfikowała tylko 31 pików.

profiling-permethylated-mucin-o-glycans-using-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Opisano protokół charakterystyki polimerów syntetycznych wspomaganej matrycowo desorpcji laserowej, czasu jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS), w tym optymalizacji przygotowania próbek, akwizycji widma i analizy danych.

Charakterystyka polimerów syntetycznych za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Poznaj metodę analizy O-glikanów z mucyn za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF. Technika ta umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe profilowanie glikanów w badaniach nad interakcjami gospodarz-mikroorganizm w przewodzie pokarmowym.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Przeglądaj więcej filmów