Name: Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę MAPP do wysokoprzepustowej analizy glikanów zachowującą strukturę 3D. Technika umożliwia detekcję epitoopów polisacharydów ścian komórkowych roślin przy użyciu przeciwciał monoklonalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować ArrayJet za fachowe porady dotyczące robotyki mikromacierzowej. SS i JS pragną podziękować za wsparcie ze strony Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai, University.

Główne etapy eksperymentalne metody MAPP są podsumowane w Rysunek 1.
1. Przygotowanie próbek
UWAGA: Tutaj metoda jest stosowana do tkanek roślinnych w celach ilustracyjnych. Wybrano Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon i kilka tajskich odmian mango (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok i Nga). Rośliny zostały wybrane ze względu na ich znaczenie handlowe. Ich przetwarzanie do spożycia przez ludzi generuje obecnie niewykorzystane odpady rolno-przemysłowe, które mogą stanowić źródło produktów o wartości dodanej, w tym czystych glikanów. W związku z tym MAPP został zastosowany do scharakteryzowania składu glikanów w biomasie odpadów roślinnych do celów bioprospekcji.
<ol>
	<li>Podziel materiał roślinny na różne tkanki (np. korzeń, łodygę i liście).</li>
	<li>Suszyć tkanki roślinne w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 40 °C przez 12-24 godziny (zmniejszyć/zwiększyć czas zgodnie z próbką). Alternatywnie, zatrzaskowo zamroź próbki w ciekłym azocie, a następnie liofilizuj przez ~4 dni.</li>
	<li>Homogenizować próbki do postaci drobnego proszku za pomocą tłuczka i moździerza lub mechanicznego lizera tkanek (patrz tabela materiałów) z łożyskiem kulkowym w każdej probówce. 
	UWAGA: W przypadku świeżej tkanki roślinnej zaleca się suszenie lub liofilizację przed homogenizacją. Ogólnie rzecz biorąc, homogenizacja za pomocą tłuczka i moździerza jest wystarczająca dla większości suchych próbek. W przypadku szczególnie odpornych próbek, takich jak zboża, rośliny strączkowe i przetworzone produkty spożywcze, takie jak makaron, szybkie zamrażanie w ciekłym azocie może zwiększyć szybkość i wydajność homogenizacji próbki. Odkryliśmy, że homogenizacja mechaniczna jest kompatybilna z prawie wszystkimi typami próbek, jest znacznie szybsza i mniej pracochłonna oraz skutecznie minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego próbki w wyniku wielokrotnego użycia tego samego sprzętu (tj. tłuczka i moździerza).</li>
</ol>
2. Przygotowanie pozostałości nierozpuszczalnej w alkoholu (POWIETRZE)
<ol>
	<li>Dodać 1,5 ml 70% (v/v) etanolu do 50-100 mg wysuszonego na powietrzu i homogenizowanego materiału próbki.</li>
	<li>Dokładnie zmieszać, aby wymieszać, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić powstały supernatant za pomocą pipety i zachować osad.</li>
	<li>Do pozostałej osadki dodać 1,5 ml metanolu i chloroformu (1:1 [v/v]). Odwirować, odwirować i odrzucić supernatant, zgodnie z krokiem 2.2.</li>
	<li>Do pozostałej osadki dodaj 1,5 ml 100% acetonu. Odwirować, odwirować i odrzucić supernatant, zgodnie z krokiem 2.2.</li>
	<li>Powstały osad należy umieścić na noc w dygestorium, aby umożliwić odparowanie pozostałego acetonu lub w wirówce próżniowej do wyschnięcia. 
	UWAGA: Materiał AIR może być przechowywany w temperaturze otoczenia do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja glikanów
UWAGA: Jeśli to możliwe, wykonaj wszystkie etapy ekstrakcji w lizerze tkankowym z łożyskiem kulkowym w każdej probówce, aby ułatwić ponowne wywieszenie. Jeśli lizer tkankowy jest niedostępny, ekstrakcje można przeprowadzić zamiast tego z ciągłym mieszaniem lub wstrząsaniem. Jeśli nie jest to możliwe, może być konieczne wydłużenie czasu ekstrakcji.
<ol>
	<li>Do 10 mg materiału AIR dodać 30 μl/mg 50 mM kwasu cykloheksanodiaminotetraoctowego (CDTA; patrz tabela materiałów), pH 7,5.</li>
	<li>Wstrząsać z częstotliwością 27 Hz przez 2 minuty, a następnie z częstotliwością 10 Hz przez 2 godziny.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zachować otrzymany supernatant, dodać go do sterylnej probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej.</li>
	<li>Do pozostałego osadu dodać 30 μL/mg 4 M NaOH + 0,1 % (w/v) NaBH4, 
	UWAGA: NaBH4 jest toksyczny w przypadku połknięcia. Stosować środki ochrony osobistej (PPE). Uchwyt pod wyciągiem. Unikaj tworzenia się kurzu. Unikaj wdychania pyłu. Nie dopuścić do kontaktu produktu z wodą.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.2 do 3.3. Przemyć pozostałą osadkę dwa lub trzy razydH2O, aby usunąć resztki NaOH.</li>
	<li>Dodać 30 μl/mg celulazy (najlepiej endo-1,4-β-glukanazę GH5, w odpowiednim buforze enzymatycznym - zgodnie z zaleceniami producenta; patrz Tabela Materiałów) do osadu i inkubować w optymalnej dla enzymu temperaturze przez 16 godzin.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant, przenieść do czystych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej. Po ekstrakcji próbki należy wydrukować tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Ponownie odwirować wszystkie przechowywane ekstrakty w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Próbki muszą być wolne od cząstek stałych i zanieczyszczeń. W razie potrzeby przepuść przez filtr wirowy 0,2 μm przed drukowaniem mikromacierzy. Szczególnie lepkie próbki są niekompatybilne z analizą mikromacierzy, ponieważ kapilary mikromacierzy i głowica drukująca mogą łatwo ulec zatkaniu. Zgodnie z ogólną zasadą, użytkownicy powinni być w stanie pipetować wszystkie próbki przeznaczone do drukowania za pomocą standardowej pipety o małej objętości.</li>
</ol>
4. Przygotowanie standardów
<ol>
	<li>Przygotować 1 mg/ml roztwory o określonych wzorcach glikanów (Tabela 1) w sterylnym dH2O. W przypadku stosowania pachymana jako wzorca, zamiast tego rozpuścić w 4 M NaOH i zneutralizować lodowatym kwasem octowym po rozpuszczeniu.</li>
	<li>Przygotowane wzorce należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie.</li>
	<li>Odwirować wszystkie wzorce przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C, aby rozdrobnić wszelkie zanieczyszczenia. Otrzymany supernatant jest używany do późniejszego drukowania.</li>
</ol>
5. Drukowanie mikromacierzy
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenie 1:20 (v/v) czarnego tuszu indyjskiego/tuszu rysunkowego w buforze systemu glicerolowego (GSB; połączyć 47% glicerolu, 52,9%dH2O, 0,06% Triton X-100 i 0,04% biocydu [0,15%-0,17% azotanu miedzi i 1,4%-2,0% azotanu magnezu w wodzie] i wysterylizować filtr) (patrz tabela materiałów) i odwirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 x g (temperatura pokojowa). 
UWAGA: Roztwór atramentu jest niezbędny do utworzenia górnej i dolnej krawędzi wokół drukowanych próbek, tak aby wydrukowane mikromatryce można było wizualnie wykryć na membranie. Jednak roztwór atramentu może zawierać osad. Wszystkie roztwory do drukowania muszą być wolne od cząstek stałych, dlatego należy unikać naruszania osadu podczas pipetowania. Wyrzuć i przygotuj świeże, gdy nie jest to już możliwe. Roztworu nie można łatwo przefiltrować w celu usunięcia cząstek stałych.</li>
	<li>Dodać 40 μl roztworu atramentu i GSB do pierwszej sekcji pierwszej płytki 384-dołkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Dodać 25 μl GSB do wszystkich studzienek do rozcieńczenia 1 (D1). Dodać 40 μl GSB do wszystkich studzienek rozcieńczonych 2, 3 i 4 (D2-D4).</li>
	<li>Rozcieńczyć wyekstrahowane próbki glikanów i zdefiniowane substraty glikanowe w stosunku 1:1 (v/v) za pomocą GSB, dodając 25 μl wyekstrahowanej próbki glikanu do studzienek D1 w kolejności.</li>
	<li>Każdą próbkę należy rozcieńczyć seryjnie czterokrotnie, pobierając 10 μl próbki z dołka D1 i dodając do dołka D2. Delikatnie zassać pipetą, aby wymieszać.</li>
	<li>Powtórzyć proces, pobierając 10 μl próbki z dołka D2 i dodając ją do dołka D3.</li>
	<li>Powtórz dla dołka D4. Po wymieszaniu wyrzucić 10 μl z dołka D4, tak aby każdy studzienka zawierał końcową objętość 40 μl.</li>
	<li>Dodać 40 μl roztworu atramentu i GSB do ostatniego bloku końcowej płytki.</li>
	<li>Przykryj płytki samoprzylepną pokrywą i odwiruj przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g (temperatura pokojowa). Upewnij się, że po odwirowaniu nie pozostały żadne pęcherzyki i powtórz w razie potrzeby.</li>
	<li>Za pomocą bezdotykowego robota drukującego mikromacierz piezoelektryczne wydrukuj próbki na membranie nitrocelulozowej (patrz Tabela materiałów), wykonując poniższe czynności. 
	UWAGA: Poniżej znajdują się działania zalecane w celu uzyskania optymalnej jakości druku; Jednak konkretne wymagane parametry będą ostatecznie zależeć od zastosowanego instrumentu. Zalecamy, aby użytkownicy skontaktowali się z producentem urządzenia w celu omówienia odpowiednich dostosowań i ustawień drukowania wymaganych dla ich urządzenia.
	<ol>
		<li>Przed drukowaniem opróżnij zbiornik buforowy odpadów i w razie potrzeby napełnij czysty zbiornik buforowy czystym GSB. Włącz przyrząd i pozwól mu ustabilizować się przez >10 minut, jeśli ma zintegrowany system kontroli wilgotności i temperatury. Włącz mikromacierz i zainicjuj system. 
		UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie testu w celu określenia ciśnienia wewnętrznego przyrządu. Jeśli ciśnienie jest zbyt niskie, może być konieczne wykonanie przedmuchiwania pod wysokim ciśnieniem. Ponownie skontaktuj się z producentem przyrządu, aby omówić konkretne działanie konkretnego instrumentu.</li>
		<li>Kilkakrotnie wyczyść głowicę drukującą i kapilary za pomocą GSB, aby usunąć zanieczyszczenia i potencjalne zanieczyszczenia. Wykonaj próbny przebieg wydruku, ładując samą płytę GSB lub ustawiając urządzenie tak, aby drukowało bezpośrednio z czystego zbiornika buforowego, omijając aspirację próbki z załadowanej płyty. 
		UWAGA: Nie ma konieczności wykonywania wydruku próbnego przy użyciu membrany nitrocelulozowej; Czyste szkiełka mikroskopowe są wystarczające i mają tę zaletę, że wielkość, kształt i jakość plamki można wizualnie ocenić przed wydrukowaniem próbki.</li>
		<li>Podczas drukowania wyekstrahowanych próbek glikanów należy zaprogramować system tak, aby przepłukiwał czystą próbką GSB między każdą próbką. 
		UWAGA: Zazwyczaj objętość próbki na wydrukowaną plamkę wynosi od 100 pL do 10 nL, a wielkość plamki waha się od 20 μm do 100 μm, w zależności od wybranej objętości próbki. Wydrukowanie 100 mikromacierzy z jednej płytki 384-dołkowej z jednego źródła zajmuje około 40 minut, łącznie z płukaniem systemu. Powstałe mikromacierze będą miały wielkość około 1cm2. Dodatkowe płytki zwiększą długość tablicy o około 1 cm na płytę. Schemat drukowanej mikromacierzy jest pokazany w Rysunek 3. Po wydrukowaniu mikromacierze są natychmiast gotowe do użycia i mogą być przechowywane przez kilka lat. Jeśli z jakiegokolwiek powodu konieczne jest powtórzenie zadania drukowania ze względu na potencjalne odparowanie próbek podczas drukowania, zaleca się załadowanie nowej płytki próbnej i wyrzucenie oryginalnej płyty.</li>
		<li>Raz w tygodniu dokładnie wyczyść głowicę drukującą i kapilary. W tym celu należy załadować do 384-dołkowej płytki zawierającej rozcieńczenie stężonego NaOH w stosunku 1:20 do GSB i wykonać druk trwający od 40 minut do 1 godziny na szkiełkach mikroskopowych. Przed kontynuowaniem użytkownicy powinni upewnić się, że ten roztwór czyszczący jest kompatybilny z ich instrumentem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz unikalny plik siatki (plik .gal) utworzony dla drukowanej mikromacierzy gotowy do dalszej analizy.</li>
</ol>
6. Sondowanie mikromacierzy
<ol>
	<li>Wyciąć pojedyncze, identyczne wydrukowane mikromatryce z membrany nitrocelulozowej i umieścić je w naczyniu o odpowiedniej wielkości do sondowania (np. 12- lub 24-dołkowej płytce do mikromiareczkowania) (patrz Tabela materiałów). Tablica powinna leżeć płasko na podstawie naczynia. Na sondę wymagana jest jedna mikromacierz, która reprezentuje jedną replikę techniczną.</li>
	<li>Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie, inkubować mikromacierze przez 1 godzinę w buforze blokującym MP-TBST (1x sól fizjologiczna buforowana Tris, pH 7,5, + 0,1% [v/v] TWEEN 20 [TBST] i uzupełniona 5% [w/v] odtłuszczonym mlekiem w proszku; patrz Tabela Materiałów) na obrotowo-kołyszącej się wytrząsarce. Upewnij się, że wolumin jest wystarczający do zanurzenia całej tablicy.</li>
	<li>Po inkubacji należy usunąć MP-TBST i zastąpić go nową objętością MP-TBST.</li>
	<li>Inkubować macierze z przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) lub CBM znakowanymi His lub innymi GRMP (np. lektynami), rozcieńczonymi w stosunku 1:10-1:1,000 (zgodnie ze specyfikacją producenta; patrz tabela materiałów) w MP-TBST przez 2 godziny na obrotowej/kołyszącej się wytrząsarce.</li>
	<li>Po inkubacji wyjmij roztwór sondy molekularnej i przykryj matryce czystym TBST, upewniając się, że matryce są całkowicie zanurzone. Aby usunąć resztki roztworu sondy, natychmiast wyjmij TBST i zastąp go nową objętością. Umieść matryce na obrotowym/kołyszącym się wytrząsarce na 5 minut. Po 5 minutach wyjmij TBST, zastąp go nową objętością i umieść na obrotowym/kołyszącym się wytrząsarce na 5 minut. 
	UWAGA: Proces ten należy powtórzyć trzy razy, nie wliczając początkowego dodawania i natychmiastowego usuwania TBST.</li>
	<li>Inkubować matryce z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fosfatazą alkaliczną (anty-mysim, anty-szczurzymi, anty-króliczym, anty-His, odpowiednio; patrz Tabela Materiałów) rozcieńczonymi w stosunku 1:1,000 w MP-TBST przez 2 godziny na kołyszącej/obracającej się wytrząsarce. 
	UWAGA: Odpowiednie są również przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową, stosowane w połączeniu z substratem tetrametylobenzydyny (TMB)/nadtlenku wodoru w celu uzyskania koloru.</li>
	<li>Po inkubacji powtórzyć procedurę mycia, jak w kroku 6.5, w celu usunięcia niespecyficznie związanych przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Pokryj matryce roztworem do wywoływania barwy tetrazolu (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP) nitro-niebieskiego (NBT) (patrz tabela materiałów) w celu chromogennego wykrywania wiązania przeciwciał. Pozostaw do momentu, aż w miejscach wiązania antygenu rozwiną się fioletowe plamki osadu (zwykle 5-30 minut, jednak tablice powinny być ściśle monitorowane, aby uniknąć przesycenia, ponieważ reakcja może zachodzić szybko). 
	UWAGA: BCIP jest szkodliwy w kontakcie ze skórą i może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Używaj środków ochrony indywidualnej. Unikaj tworzenia się kurzu. Unikaj wdychania pyłu.</li>
	<li>Aby zakończyć reakcję, zanurz matryce w czystej wodzie z kranu i dokładnie umyj.</li>
	<li>Umieść tablice między bibułą na noc w temperaturze otoczenia do wyschnięcia.</li>
	<li>Odrzuć tablice z oczywistymi defektami i powtórz protokół sondowania w takich przypadkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>
7. Analiza i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Zeskanuj opracowane tablice w rozdzielczości 2 400 punktów na cal (dpi) za pomocą skanera biurkowego. Konwertuj obrazy na pliki TIFF, a następnie na negatywy.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do analizy mikromacierzy (patrz Tabela materiałów), nałóż unikalny plik siatki .gal na każdy obraz mikromacierzy, aby obliczyć intensywność koloru plamki wytworzonej w każdym miejscu wiązania antygenu i odjąć lokalne tło.</li>
	<li>Wyeksportuj dane siatki jako plik .txt. Można je następnie ręcznie zaimportować do arkusza Excela w celu analizy.</li>
	<li>Wygeneruj średnią wartość intensywności sygnału punktowego dla każdej próbki, uśredniając intensywność sygnału plamki najpierw dla każdego rozcieńczenia próbki, a następnie dla wszystkich uwzględnionych kontrprób biologicznych.</li>
	<li>Przypisz wartość 100 do najwyższej średniej intensywności sygnału punktowego i odpowiednio znormalizuj pozostałe dane. 
	UWAGA: Znormalizowane średnie intensywności sygnału punktowego można następnie przedstawić jako mapę cieplną względnej obfitości epitopów glikanów za pomocą funkcji formatowania warunkowego w Excel33 lub za pomocą funkcji geom_tile w R ggplot2 package40,41.</li>
</ol>

Elucidating Glycan Structure and Occurrence Using Microarray Polymer Profiling

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisana tutaj technika MAPP jest obecnie dobrze znaną metodą analizy glikanów. Podstawowe zasady zostały po raz pierwszy opisane w 2007 roku11 , ale technika ta była stale rozwijana w celu wykorzystania najnowszych innowacji w technologii mikromacierzy, rozwoju sond molekularnych i postępów w naszym zrozumieniu biochemii glikanów. Ogólnie rzecz biorąc, glikany, zwłaszcza polisacharydy, są trudniejsze do analizy niż białka i nukleotydy ze względu na ich złożoność strukturalną i niejednorodność45, a także fakt, że nie można ich łatwo zsekwencjonować ani zsyntetyzować1. W wielu przypadkach żadna pojedyncza technika nie jest w stanie jednoznacznie rozszyfrować złożoności glikanów; w związku z tym MAPP jest często używany z innymi metodami. Jest to jeden z powodów, dla których przygotowanie AIR jest zwykle wybierane jako punkt wyjścia dla MAPP, ponieważ AIR jest kompatybilne z większością innych metod analizy glikanów34, co ułatwia późniejsze porównywanie zbiorów danych.
Ze względu na homogenizację próbki przed przygotowaniem AIR, niektóre informacje przestrzenne są niezmiennie tracone. Ponieważ jednak polisacharydy są sekwencyjnie uwalniane z próbek, obecność epitopów w otrzymanych frakcjach dostarcza informacji o architekturze molekularnej i składzie tej próbki17. W związku z tym wybór odpowiedniego reżimu ekstrakcji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia metody. O przydatności metody ekstrakcji decyduje wiele parametrów: struktura komórkowa, czas, temperatura, pH, ciśnienie, siła jonowa rozpuszczalnika i stopień rozdrobnienia próbki cząstek stałych49. Zaleca się stosowanie szeregu coraz bardziej agresywnych rozpuszczalników w celu maksymalizacji prawdopodobieństwa pomyślnej ekstrakcji glikanów składowych i zbudowania reprezentatywnego obrazu składu próbki. W przypadku większości próbek CDTA, NaOH i celulaza są wystarczające do usunięcia polisacharydów z magazynowania i ścian komórkowych pochodzenia roślinnego 33,50,51,52. W przypadku niektórych próbek tkanek wykazano, że hybrydowy reżim ekstrakcji, który obejmuje również CaCl2, HCl i Na2CO3 3 jest skuteczny53, podczas gdy próbki mikroglonów morskich mogą wymagać dodania kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)10.
Mikromacierze powinny obejmować szereg czystych, określonych wzorców glikanów, które mają być stosowane jako kontrole dodatnie5. Uwzględnione normy powinny być modyfikowane w zależności od charakteru próbki. Po wydrukowaniu należy wybrać odpowiednie GRMP. Generowanie hybrydoma mAb do struktur polisacharydowych jest wyzwaniem54; Przeciwciała wiążące glikany są trudne do wyhodowania i mogą mieć niskie powinowactwo55. Na szczęście informacje o sekwencji genów dla CBM można uzyskać ze względną łatwością dla ekspresji rekombinowanej4 i inżynierii ich specyficzności wiązania56,57. Chociaż opracowano imponujący katalog GRMP, z których większość jest obecnie dostępna ze źródeł komercyjnych, w stosunku do różnorodności struktur glikanowych występujących w przyrodzie, tylko niewielka część z nich została wyprodukowana i pomyślnie scharakteryzowana58. Może to ograniczyć zdolność do wykrywania i rozróżniania niektórych struktur. Zaleca się przeprowadzenie wstępnego eksperymentu pomiarowego przy użyciu jednej lub dwóch sond reprezentatywnych dla każdej przewidywanej struktury glikanu, dla której specyficzność wiązania jest dobrze scharakteryzowana. W kolejnych eksperymentach sondujących lista sond może zostać rozszerzona, aby objąć szerszy zakres glikanów i zagłębić się w drobne struktury.
Chociaż jest to prozaiczne, zapewnienie, że mikromacierze są dokładnie myte po każdym etapie inkubacji, ma fundamentalne znaczenie dla powodzenia procedury sondowania. Nieskuteczne usuwanie niespecyficznie związanych sond prawdopodobnie zaciemni wynik, powodując wysoki sygnał tła po wywołaniu koloru. W takim przypadku konieczne jest powtórzenie procedury sondowania, zaczynając od nowej mikromacierzy. Ponadto tablice należy dotykać oszczędnie i tylko poprzez przytrzymywanie krawędzi kleszczami; Membrana nitrocelulozowa jest krucha i łatwo ulega uszkodzeniu. Roztwór do wywoływania kolorów zbiera się w pęknięciach i zagięciach, powodując przesycenie, co utrudnia analizę tablicy.
MAPP jest szybki, elastyczny i wygodny. Metoda ta jest kompatybilna z glikanami zwierzęcymi, mikrobiologicznymi lub roślinnymi pochodzącymi z dowolnego systemu biologicznego lub przemysłowego, o ile można je wyekstrahować i unieruchomić na nitrocelulozie i do których posiada się odpowiednie sondy molekularne. Wygenerowane dane dostarczają szczegółowych, częściowo ilościowych informacji na temat składu, których nie można łatwo uzyskać za pomocą innych metod analizy glikanów.

Glikany są wszechobecne we wszystkich dziedzinach życia i wykazują niezrównaną różnorodność pod względem struktury i funkcji w porównaniu do innych makromolekuł1. Jednak ze względu na ich złożoność, zmienność biosyntezy i wiązań glikozydowych oraz niedostatek odpowiednich metod do preparowania struktur glikanów, nasze zrozumienie tej różnorodności struktur i funkcji jest stosunkowo ograniczone2.
Wiele technik analizy glikanów jest destrukcyjnych i wymaga rozkładu glikanów na ich składowe monosacharydy, co może zaciemniać istotne konteksty trójwymiarowe i biologiczne3. I odwrotnie, przeciwciała monoklonalne (mAb), moduły wiążące węglowodany (CBM), lektyny, aglutyniny wirusowe i adhezyny mikrobiologiczne, znane łącznie jako sondy molekularne rozpoznające glikany (GRMPs)4, rozpoznają i wiążą się z określonymi epitopami i mogą być używane jako narzędzia do wykrywania i rozróżniania glikanów w złożonych matrycach wieloglikanowych5,6.
Tutaj prezentujemy profilowanie polimerów mikromatrycowych (MAPP), szybką, wszechstronną i nieniszczącą metodę analizy glikanów, która ma zastosowanie do szerokiego spektrum próbek biologicznych. Metoda ma na celu zapewnienie solidnej i wysokowydajnej technologii do analizy glikanów z różnych systemów biologicznych i przemysłowych/komercyjnych. MAPP łączy w sobie specyficzność rozpoznawania sond molekularnych skierowanych na glikan z powtarzalną, wysokowydajną technologią badań przesiewowych mikromacierzy, aby umożliwić równoległe profilowanie tysięcy interakcji molekularnych. Wynikiem tego podejścia jest diagnostyczny wgląd w skład i względną obfitość glikanów w próbce lub tkance będącej przedmiotem zainteresowania.
MAPP może być używany jako niezależna, samodzielna metoda, lub w połączeniu z innymi technikami biochemicznymi, takimi jak mikroskopia immunofluorescencyjna7,8,9 i analiza monosacharydów lub sprzężeń10,11. Technika ta może być również wykorzystana do mapowania specyficzności epitopowej nowych GRMP przy użyciu tablic wydrukowanych z czystymi i strukturalnie dobrze zdefiniowanymi standardami oligosacharydów12. Główną przewagą MAPP nad innymi metodami, takimi jak test immunoenzymatyczny (ELISA), jest jego kompatybilność z małymi objętościami próbek13,14. Co więcej, MAPP oferuje znacznie wyższą przepustowość analizy15 i zapewnia efektywną formę konserwacji próbek, ponieważ wydrukowane próbki są suche i stabilne po unieruchomieniu na nitrocelulozie16.
Wiązanie GRMP jest generalnie zależne od obecności wielu sąsiadujących ze sobą reszt cukru, które wspólnie tworzą miejsce wiązania (epitop), które jest unikalne dla określonej klasy polisacharydów (ksylanu, mannanu, ksyloglukanu, itp.)17. W przeciwieństwie do tego, poszczególne reszty cukru (ksyloza, mannoza, glukoza), które są określane ilościowo za pomocą większości technik biochemicznych, na przykład składu monosacharydów lub analizy metylacji, mogą być składnikami wielu klas polisacharydów, a zatem trudne do przypisania18.
MAPP został opracowany w odpowiedzi na lukę technologiczną, a mianowicie możliwość szybkiej analizy wielu glikanów z różnych źródeł przy użyciu małych ilości materiału. MAPP czerpie korzyści z obszernego repertuaru GRMP, które zostały opracowane i scharakteryzowane w ciągu ostatnich trzech dekad12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Rozwój MAPP był procesem iteracyjnym, w którym technika była stale udoskonalana i optymalizowana. Obecnie istnieje obszerna literatura opisująca zastosowanie MAPP w różnych systemach naturalnych i przemysłowych, w których glikany odgrywają główną rolę 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. W tym miejscu opisujemy aktualny stan wiedzy w zakresie MAPP.

<table><tbody><tr><td>1,3:1,4-&beta;-D-glukan, porost (mech islandzki)</td><td>Megazyme</td><td>P-LICHN</td><td></td></tr><tr><td>1,4-&beta;-D-Mannan</td><td>Megazyme</td><td>P-MANCB</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka do mikromiareczkowania</td><td>Greiner Bio-One</td><td>M1686</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan (BCIP)</td><td>Melford</td><td>B74100-1.0</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-055-003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna AffiniPure Rabbit Anti-His Tag</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>300-055-240</td><td></td></tr><tr><td>Arabinoksylan (pszenica)</td><td>Megazyme</td><td>P-WAXYL</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer Oprogramowanie</td><td>Media Cybernetyka</td><td>Wersja 6.3</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus sp. Celulaza 5A (BCel5A)</td><td>NZYTech</td><td>CZ0564</td><td></td></tr><tr><td>BAM przeciwciała</td><td>SeaProbes</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>tusz do rysowania (tusz indyjski)</td><td>Winsor & Newton</td><td>GWD030</td><td></td></tr><tr><td>Moduły wiążące węglowodany</td><td>NZYTech</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała CCRC</td><td>CarboSource</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma</td><td>319945</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>PHR1552</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>1.11727</td><td></td></tr><tr><td>Galaktan (ziemniak)</td><td>Megazyme</td><td>P-GALPOT</td><td></td></tr><tr><td>Galaktomannan (chleb świętojański)</td><td>Megazyme</td><td>P-GALML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glicerolu</td><td>Sigma</td><td>49781-5L</td><td></td></tr><tr><td>Guma tragakant (rośliny strączkowe)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1128</td><td></td></tr><tr><td>INCh przeciwciała INRA</td><td></td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała LM i JIM</td><td>PlantProbes</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Marathon Argus Microarray Drukarka</td><td>ArrayJet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała monoklonalne</td><td>Biosupplies Australia</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma</td><td>452882</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Nitro-niebieski tetrazolium (NBT)</td><td>Melford</td><td>N66000-1.0</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>Pektyna (stopień estryfikacji metylu 46%)</td><td>Danisco</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ProClin 200</td><td>Sigma</td><td>48171-U</td><td></td></tr><tr><td>Rhamnogalacturonan (włókno pektynowe sojowe)</td><td>Megazyme</td><td>P-RHAGN</td><td></td></tr><tr><td>Mikser obrotowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-050</td><td></td></tr><tr><td>Shaker obrotowo-kołyszący</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin filter</td><td>Costar Spin-X</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xylan (drewno bukowe)</td><td>Megazyme</td><td>P-XYLNBE</td> Xyloglukan (tamaryndowiec<td></td></tr><tr><td>)</td><td>Megazyme</td><td>P-XYGLN</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glucan (owies)</td><td>Megazyme</td><td>P-BGOM</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie polimerów w mikromacierzy (mapp) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Profilowanie polimerów mikromatrycowych (MAPP) to solidne i powtarzalne podejście do systematycznego określania składu i względnej obfitości glikanów i glikokoniugatów w różnych próbkach biologicznych, w tym w tkankach roślinnych i glonowych, materiałach spożywczych oraz próbkach ludzkich, zwierzęcych i mikrobiologicznych. Technologia mikromacierzy stanowi podstawę skuteczności tej metody, zapewniając zminiaturyzowaną, wysokowydajną platformę przesiewową, umożliwiającą jednoczesne scharakteryzowanie tysięcy interakcji między glikanami a wysoce specyficznymi sondami molekularnymi skierowanymi na glikany, przy użyciu tylko niewielkich ilości analitów. Składniki glikanów są frakcjonowane chemicznie i enzymatycznie, a następnie sekwencyjnie ekstrahowane z próbki i bezpośrednio unieruchamiane na membranach nitrocelulozowych. Skład glikanów jest określany przez przyłączenie specyficznych sond molekularnych rozpoznających glikany do wymuszonych i wydrukowanych cząsteczek. MAPP jest uzupełnieniem konwencjonalnych technik analizy glikanów, takich jak analiza monosacharydów i sprzężeń oraz spektrometria mas. Jednak sondy molekularne rozpoznające glikany zapewniają wgląd w konfiguracje strukturalne glikanów, co może pomóc w wyjaśnieniu interakcji biologicznych i ról funkcjonalnych.

Metodę MAPP zastosowano w celu określenia składu glikanów odpadów z biomasy rolniczej, obejmujących skórki z mango kilku odmian z północnej Tajlandii, miąższ owoców Coffea arabica oraz odpady z przetwarzania ziaren kawy, a także tkanki korzeni, łodyg i liści tajskiego czarnego czosnku, Allium sativum var. ophioscorodon. Kilka polisacharydów pochodzenia roślinnego jest wykorzystywanych w przemyśle spożywczym jako składniki funkcjonalne42,43. Zatem celem niniejszego eksperymentu było ustalenie, czy te obfite i obecnie niewykorzystane materiały odpadowe z przemysłu rolno-spożywczego mogą stanowić źródło czystych polisacharydów o dodanej wartości.
Materiał AIR jest rutynowo stosowany do przygotowywania próbek przeznaczonych do analizy glikanów44. Stosowanie AIR wiąże się z kilkoma zaletami; traktowanie rozpuszczalnikami skutecznie usuwa endogenne CAZymes, metabolity, małe sacharydy, lipidy oraz pigmenty, co pozwala na uzyskanie próbek wzbogaconych w polisacharydy i białka strukturalne34. Ponadto otrzymywanie AIR jest szybkim i skutecznym sposobem na zwiększenie trwałości próbek, ponieważ jest on termostabilny i może być przechowywany przez kilka lat.
Trzy mieszane frakcje glikanów składowych zostały sekwencyjnie wyekstrahowane z materiału roślinnego AIR przy użyciu CDTA, NaOH i celulazy. CDTA chelatuje jony Ca2+, co umożliwia usunięcie usieciolonych jonami Ca2+ odesteryfikowanych pektyn ze ścian komórkowych roślin45. Warunki zasadowe pozwalają na uwolnienie przede wszystkim hemiceluloz, takich jak mannan, ksylan i β-glukan, na skutek przerwania wiązań wodorowych oraz saponifikacji wiązań estrowych odpowiednio między mikrofibryllami celulozy a hemicelulozą oraz między ligniną a hemicelulozą46. Rekombinowana endo-1,4-β-glukanaza z Bacillus spp. została wykorzystana do degradacji obszarów amorficznych strukturalnych mikrofibryll celulozy, co pozwoliło na uwolnienie pozostałych glikanów związanych z celulozą w obrębie ścian komórkowych47. Chociaż metoda ta skutecznie rozdziela glikany na te trzy szerokie grupy, należy zauważyć, że próbki nie są czyste; ze względu na samą naturę metody ekstrakcji, hemiceluloza, jeśli występuje w próbce, zostanie nieuchronnie wyekstrahowana, a następnie wykryta w różnym stopniu w frakcjach CDTA i celulazy. Podobnie, w ekstrakcji NaOH zostanie wykryta pewna ilość pektyny, jeśli jest ona obecna w próbce.
Do unieruchomienia wyekstrahowanych frakcji glikanów na nitrocelulozie poprzez wiązanie niekowalencyjne11 wykorzystano bezkontaktowego, piezoelektrycznego robota do drukowania mikrotablic, tworząc 300 identycznych mikrotablic. W wydrukowanych mikrotablicach uwzględniono również określone standardy glikanów (Tabela 1) jako kontrole pozytywne (Rysunek 5). Profil wiązania MAPP uzyskany dla wybranych standardów glikanów odpowiada wcześniej raportowanym swoistościom epitopów. Na przykład LM21 wykazywał silne wiązanie z wieloma polisacharydami mannanowymi (galaktomannanem i glukomannanem), podczas gdy LM22 wykazywał jedynie słabe wiązanie z galaktomannanem25. Podobnie, LM19 wiązał preferencyjnie odestryfikowany homogalakturonan48, a LM15 wiązał ksyloglukan z nasion tamaryndowca23.
Względna zawartość 16 epitopów, diagnostycznych dla niecelulozowych polisacharydów ścian komórkowych roślin, została określona poprzez wiązanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko glikanom (Tabela 2) z naniesionymi ekstraktami (Rysunek 6). Większość wyekstrahowanych glikanów wykryto w alkalicznej frakcji NaOH. Silne sygnały wiązania odnotowano dla przeciwciał mAb LM10 i LM11, reprezentujących ksylan/arabinoksylan, w skórkach wszystkich badanych odmian mango. W próbkach czosnku LM10 i LM11 wiązały się preferencyjnie z ekstraktem z tkanki korzenia (Garlic R) i wykazywały jedynie słabe wiązanie z ekstraktem z tkanki liścia (Garlic L). LM19, reprezentujące częściowo zmetylowany lub niezmetylowany homogalakturonan, wiązało się silnie z ekstraktami z niektórych odmian mango (Aokrong i Talabnak), natomiast wiązało się słabo lub wcale w innych odmianach (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok i Nga). Ponadto LM19 wiązało się tylko z frakcjami miąższu kawowca i nie wiązało się z odpadami z przetwarzania ziaren kawy, które wcześniej uważano za składające się z częściowo oczyszczonej pektyny kawowej (dane nieopublikowane).
<img alt="Schemat procesu homogenizacji; ekstrakcja glikanów za pomocą CDTA, NaOH, celulazy; analiza mikroarray." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Główne etapy eksperymentalne w metodzie MAPP. (A) Próbki są homogenizowane w celu otrzymania drobnych proszków. (B) Zhomogenizowane próbki są przetwarzane w celu wyizolowania zawartych w nich AIR. (C) Składnikowe glikany są sekwencyjnie ekstrahowane przy użyciu dostosowanego schematu ekstrakcji. (D) Wyekstrahowane frakcje glikanów, tusz i GSB są przenoszone do płytek 384-dołkowych, zgodnie z układem płytki, w celu naniesienia na nitrocelulozę. (E) Naniesione mikroarray są sondowane wybranymi GRMP. (F) Wiązanie GRMP z naniesionymi frakcjami glikanów jest kwantyfikowane i analizowane przed przedstawieniem danych w formie mapy ciepła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres wzoru dzierganego; kolorowa siatka z symbolami, rzędy A-P, kolumny 1-24; sekwencje oczek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład układu płytki 384-dołkowej dla załadunku próbek, tuszu i GSB z czterema rozcieńczeniami na każdą próbkę/standard wyekstrahowanego glikanu. Różne kolory oznaczają próbki pochodzące z różnych odczynników do ekstrakcji, natomiast różne odcienie reprezentują rozcieńczenia seryjne. Pierwsza cyfra w kodzie oznacza numer próbki, a ostatnia cyfra oznacza numer rozcieńczenia (D1 oznacza rozcieńczenie pierwsze, D2 rozcieńczenie drugie itd.). Na przykład dołek oznaczony jako „12D3” reprezentuje próbkę glikanu nr 12, rozcieńczenie trzecie. Płytki dołkowe należy podzielić na osiem identycznych sekcji obejmujących sześć kolumn i osiem rzędów. Pierwsza sekcja pierwszej płytki powinna zawierać wyłącznie tusz i bufor i odpowiadać przykładowemu układowi płytki. Następnie próbki wyekstrahowanych glikanów można załadowywać do kolejnych sekcji płytki zgodnie z jej układem. Różne odczynniki do ekstrakcji nie powinny być załadowywane do tej samej sekcji płytki. Jeśli liczba próbek jest niewystarczająca do wypełnienia całej sekcji, należy wypełnić wszystkie pozostałe dołki w tej sekcji buforem; nie należy pozostawiać pustych dołków. W przypadku konieczności użycia wielu płytek, następna sekcja po załadowaniu wszystkich próbek powinna zawierać trzy naprzemienne kolumny tuszu i GSB – w zależności od liczby drukowanych próbek nie musi to być sekcja ósma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat siatki macierzy; sekwencja numeryczna; edukacyjna reprezentacja danych; metoda analizy tabeli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schematyczna reprezentacja projektu wydrukowanej macierzy mikroarray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; pionowy układ pasków; analiza fragmentacji DNA; schemat doświadczalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne mikromacierze. (A) Brak wiązania. (B) Sygnał wiązania jest przesłonięty przez wysoki sygnał tła. (C) Uogólnione niebiesko-fioletowe barwienie wynikające z przesycenia NBT/BCIP. (D) Wadliwa hybrydyzacja z powodu wysokiego stężenia substratu. (E) Wadliwy nadruk z powodu nieczystej głowicy drukującej. (F) Silne wiązanie w kilku próbkach. (G) Silne wiązanie w wielu próbkach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapa ciepła wiązania polisacharydów; schemat; sondy vs. węglowodany; skala kolorystyczna intensywności wiązania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wiązanie przeciwciał monoklonalnych do określonych standardów glikanowych, włączone w celu walidacji procesu drukowania i sondowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapa ciepła wiązania polisacharydów ścian komórkowych roślin za pomocą immunoznakowania; ekstrakcja CDTA, NaOH, celulazą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: MAPP glikanów ekstrahowanych z odpadów biomasy rolniczej. Próbki obejmują odpady z miąższu kawy (miąższ kawy i pektyna kawowa), skórki z mango kilku tajskich odmian (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; NG, Nga) oraz liście czosnku czarnego (Garlic L), łodygę (Garlic S), cebulę (Garlic BG) i korzenie (Garlic R), przy użyciu CDTA, NaOH i celulazy (Bacillus spp. celulaza 5A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Zdefiniowane komercyjne wzorce polisacharydowe użyte w analizie MAPP jako kontrole pozytywne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko glikanom, wybrane do analizy mikrotablic glikanów ekstrahowanych z roślin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

Nasze badania koncentrują się na występowaniu, funkcjach i strukturze złożonych glikanów w różnych systemach domowych, przemysłowych i komercyjnych. Dalsze udoskonalenia technologii bezkontaktowych mikromacierzy i nasza zdolność do szybkiego dostępu do informacji o sekwencjach modułów wiążących węglowodany zwiększają naszą zdolność zarówno do drukowania, jak i badania mikromacierzy glikanów. Glikany są trudne do zbadania ze względu na ich niejednorodność strukturalną, złożoność i zmienność biosyntezy.Wiele metod analizy glikanów wymaga rozkładu glikanów na wchodzące w ich skład cukrów prostych. MAPP oferuje wszechstronną platformę do analizy glikanów, która zachowuje wiele ważnych informacji strukturalnych 3D. Na początek użyj mechanicznego lizera tkankowego, aby wstrząsnąć wcześniej przygotowaną mieszaniną AIR-CDTA z częstotliwością 27 Hz przez 2 minuty, a następnie 10 Hz przez 2 godziny.Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki. Na koniec dodaj mieszaninę wodorotlenku sodu i borowodorku sodu do pozostałego osadu.Po wstrząśnięciu i odwirowaniu osadu, pozostałą osadkę przemyć 2-3 razy wodą destylowaną. Dodaj 30 mikrolitrów na miligram celulazy do granulki. Następnie inkubuj probówki w bloku grzewczym w optymalnej temperaturze enzymu przez 16 godzin.Odwirować próbki i przechowywać supernatant na wytrząsarce obrotowej. Ponownie odwirować wszystkie przechowywane ekstrakty w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozpocząć od przygotowania rozcieńczenia w stosunku 1:20 czarnego atramentu indyjskiego i buforu systemu glicerynowego, a następnie odwirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 G w temperaturze pokojowej.Dodać 40 mikrolitrów roztworu atramentu i buforu systemu glicerolu do pierwszej sekcji płytki 384-dołkowej. Teraz dodaj 25 mikrolitrów buforu systemu glicerolu do wszystkich dołków rozcieńczenia 1 i 40 mikrolitrów do wszystkich dołków rozcieńczenia 2, 3 i 4. Dodać 25 mikrolitrów wyekstrahowanej próbki glikanu do dołków rozcieńczenia 1, aby rozcieńczyć próbki w stosunku 1:1.Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę cztery razy, przenosząc 10 mikrolitrów z dołka rozcieńczenia 1 do rozcieńczenia 2, a następnie delikatnie wymieszać za pomocą pipety. Powtórzyć proces, przenosząc 10 mikrolitrów próbki z dołka rozcieńczenia 2 do dołka rozcieńczenia 3. Po powtórzeniu procesu rozcieńczania 4 dołków, wyrzuć z niego 10 mikrolitrów, tak aby wszystkie studzienki miały końcową objętość 40 mikrolitrów.Dodaj 40 mikrolitrów roztworu atramentu i buforu systemu glicerolu do końcowej płytki. Następnie przykryj płytkę samoprzylepną osłoną przed odwirowaniem przez 10 minut w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. Aby wydrukować próbki na membranie nitrocelulozowej, należy rozpocząć od wielokrotnego przeczyszczenia głowicy drukującej i kapilar buforem systemu glicerynowego.Rozpocznij wydruk próbny, ładując płytę z samym buforem. Aby skonfigurować urządzenie do drukowania bezpośrednio z czystego zbiornika buforowego, kliknij Plik, a następnie Nowy, a następnie wybierz Drukuj Run. Wybierz typ mikropłytki i odpowiednio zmień ustawienia szkiełka.Następnie zmień ustawienia Mini-array przed edycją ustawień właściwości Spot. Kliknij zakładkę Przegląd, aby wyświetlić tabliczkę. Na koniec na karcie Opcje wybierz opcję Używanie bufora i Oblicz czas drukowania przed przydzieleniem lokalizacji plików, aby zapisać plik.Po zapisaniu lokalizacji naciśnij przycisk Rozpocznij drukowanie, aby kontynuować uruchamianie. Podczas drukowania wyekstrahowanych próbek glikanów należy zaprogramować system jak poprzednio. W zakładce Options (Opcje) kliknij na Using source microplates (Korzystanie z mikropłytek źródłowych).Na koniec zapisz unikalny plik siatki wygenerowany dla drukowanej mikromacierzy do dalszej analizy. Zdefiniowane wzorce glikanów zostały również włączone do wydrukowanych mikromacierzy jako kontrole pozytywne. Uzyskany dla wybranych wzorców glikanów profil wiązania MAPP odpowiada wcześniej zgłoszonej specyficzności epitopowej.Zacznij od wycięcia identycznych wydrukowanych mikromacierzy z membrany nitrocelulozowej i umieszczenia ich w odpowiednim naczyniu do sondowania. Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie, dodaj bufor blokujący MP-TBST do mikromacierzy i inkubuj przez 1 godzinę na obrotowym wytrząsarce. Po inkubacji zastąpić bufor świeżym MP-TBST.Inkubować macierze z przeciwciałami monoklonalnymi i MP-TBST przez 2 godziny na obrotowym wytrząsarce. Po inkubacji usuń roztwór sondy molekularnej. Zanurz matryce całkowicie w czystym TBST.Natychmiast wymień bufor na nowy objęt, aby usunąć pozostały roztwór sondy. Umieść tablice na obrotowej wytrząsarce na 5 minut. Zastąp TBST nowym woluminem buforowym i umieść tablice na wytrząsarce na kolejne 5 minut.Następnie inkubować macierze z przeciwciałami sprzężonymi z fosfatazą alkaliczną przez 2 godziny na obrotowym wytrząsarce. Po zakończeniu inkubacji i umyciu mikromacierzy przykryj je nitro blue tetrazolium i roztworem do wywoływania koloru BCIP, aby chromogennie wykryć wiązanie przeciwciała. Zakończ reakcję, zanurzając matrycę w czystej wodzie z kranu.Następnie umieść tablice do wyschnięcia między bibułą przez noc w temperaturze otoczenia. Względną obfitość 16 epitopów diagnostycznych polisacharydów ściany komórkowej roślin wykryto poprzez przyłączenie przeciwciał monoklonalnych skierowanych do glikanów do drukowanych ekstraktów. Większość wyekstrahowanych glikanów wykryto w alkalicznej frakcji wodorotlenku sodu.Dla LM10 i LM11 zarejestrowano silne sygnały wiązania, reprezentujące ksylan i arabinoksylan w skórkach wszystkich badanych odmian mango. LM10 i LM11 wykazywały preferencyjne wiązanie z ekstraktem z tkanki korzenia czosnku i słabe wiązanie z ekstraktem z tkanki liścia LM19, reprezentujące częściowo estryfikowany metylem lub nieestryfikowany homogalakturonan, silnie związany z niektórymi ekstraktami odmian mango i tylko z frakcjami miazgi kawy.

microarray-polymer-profiling-mapp-for-high-throughput-glycan-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Opisano prostą i szybką metodę określania potencjału sacharyfikacji dla dużej liczby próbek biomasy roślinnej. Zautomatyzowana platforma do tej analizy obejmuje przygotowanie biomasy roślinnej do analizy w płytkach 96-dołkowych, a następnie przeprowadzenie obróbki wstępnej, hydrolizy oraz kwantyfikacji uwolnionych cukrów.

Wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Poznaj metodę MAPP do wysokoprzepustowej analizy glikanów zachowującą strukturę 3D. Technika umożliwia detekcję epitoopów polisacharydów ścian komórkowych roślin przy użyciu przeciwciał monoklonalnych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Przeglądaj więcej filmów