Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Nasze badania koncentrują się na występowaniu, funkcjach i strukturze złożonych glikanów w różnych systemach domowych, przemysłowych i komercyjnych. Dalsze udoskonalenia technologii bezkontaktowych mikromacierzy i nasza zdolność do szybkiego dostępu do informacji o sekwencjach modułów wiążących węglowodany zwiększają naszą zdolność zarówno do drukowania, jak i badania mikromacierzy glikanów. Glikany są trudne do zbadania ze względu na ich niejednorodność strukturalną, złożoność i zmienność biosyntezy.

Wiele metod analizy glikanów wymaga rozkładu glikanów na wchodzące w ich skład cukrów prostych. MAPP oferuje wszechstronną platformę do analizy glikanów, która zachowuje wiele ważnych informacji strukturalnych 3D. Na początek użyj mechanicznego lizera tkankowego, aby wstrząsnąć wcześniej przygotowaną mieszaniną AIR-CDTA z częstotliwością 27 Hz przez 2 minuty, a następnie 10 Hz przez 2 godziny.

Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki. Na koniec dodaj mieszaninę wodorotlenku sodu i borowodorku sodu do pozostałego osadu.

Po wstrząśnięciu i odwirowaniu osadu, pozostałą osadkę przemyć 2-3 razy wodą destylowaną. Dodaj 30 mikrolitrów na miligram celulazy do granulki. Następnie inkubuj probówki w bloku grzewczym w optymalnej temperaturze enzymu przez 16 godzin.

Odwirować próbki i przechowywać supernatant na wytrząsarce obrotowej. Ponownie odwirować wszystkie przechowywane ekstrakty w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozpocząć od przygotowania rozcieńczenia w stosunku 1:20 czarnego atramentu indyjskiego i buforu systemu glicerynowego, a następnie odwirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 G w temperaturze pokojowej.

Dodać 40 mikrolitrów roztworu atramentu i buforu systemu glicerolu do pierwszej sekcji płytki 384-dołkowej. Teraz dodaj 25 mikrolitrów buforu systemu glicerolu do wszystkich dołków rozcieńczenia 1 i 40 mikrolitrów do wszystkich dołków rozcieńczenia 2, 3 i 4. Dodać 25 mikrolitrów wyekstrahowanej próbki glikanu do dołków rozcieńczenia 1, aby rozcieńczyć próbki w stosunku 1:1.

Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę cztery razy, przenosząc 10 mikrolitrów z dołka rozcieńczenia 1 do rozcieńczenia 2, a następnie delikatnie wymieszać za pomocą pipety. Powtórzyć proces, przenosząc 10 mikrolitrów próbki z dołka rozcieńczenia 2 do dołka rozcieńczenia 3. Po powtórzeniu procesu rozcieńczania 4 dołków, wyrzuć z niego 10 mikrolitrów, tak aby wszystkie studzienki miały końcową objętość 40 mikrolitrów.

Dodaj 40 mikrolitrów roztworu atramentu i buforu systemu glicerolu do końcowej płytki. Następnie przykryj płytkę samoprzylepną osłoną przed odwirowaniem przez 10 minut w temperaturze 3 000 G w temperaturze pokojowej. Aby wydrukować próbki na membranie nitrocelulozowej, należy rozpocząć od wielokrotnego przeczyszczenia głowicy drukującej i kapilar buforem systemu glicerynowego.

Rozpocznij wydruk próbny, ładując płytę z samym buforem. Aby skonfigurować urządzenie do drukowania bezpośrednio z czystego zbiornika buforowego, kliknij Plik, a następnie Nowy, a następnie wybierz Drukuj Run. Wybierz typ mikropłytki i odpowiednio zmień ustawienia szkiełka.

Następnie zmień ustawienia Mini-array przed edycją ustawień właściwości Spot. Kliknij zakładkę Przegląd, aby wyświetlić tabliczkę. Na koniec na karcie Opcje wybierz opcję Używanie bufora i Oblicz czas drukowania przed przydzieleniem lokalizacji plików, aby zapisać plik.

Po zapisaniu lokalizacji naciśnij przycisk Rozpocznij drukowanie, aby kontynuować uruchamianie. Podczas drukowania wyekstrahowanych próbek glikanów należy zaprogramować system jak poprzednio. W zakładce Options (Opcje) kliknij na Using source microplates (Korzystanie z mikropłytek źródłowych).

Na koniec zapisz unikalny plik siatki wygenerowany dla drukowanej mikromacierzy do dalszej analizy. Zdefiniowane wzorce glikanów zostały również włączone do wydrukowanych mikromacierzy jako kontrole pozytywne. Uzyskany dla wybranych wzorców glikanów profil wiązania MAPP odpowiada wcześniej zgłoszonej specyficzności epitopowej.

Zacznij od wycięcia identycznych wydrukowanych mikromacierzy z membrany nitrocelulozowej i umieszczenia ich w odpowiednim naczyniu do sondowania. Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie, dodaj bufor blokujący MP-TBST do mikromacierzy i inkubuj przez 1 godzinę na obrotowym wytrząsarce. Po inkubacji zastąpić bufor świeżym MP-TBST.

Inkubować macierze z przeciwciałami monoklonalnymi i MP-TBST przez 2 godziny na obrotowym wytrząsarce. Po inkubacji usuń roztwór sondy molekularnej. Zanurz matryce całkowicie w czystym TBST.

Natychmiast wymień bufor na nowy objęt, aby usunąć pozostały roztwór sondy. Umieść tablice na obrotowej wytrząsarce na 5 minut. Zastąp TBST nowym woluminem buforowym i umieść tablice na wytrząsarce na kolejne 5 minut.

Następnie inkubować macierze z przeciwciałami sprzężonymi z fosfatazą alkaliczną przez 2 godziny na obrotowym wytrząsarce. Po zakończeniu inkubacji i umyciu mikromacierzy przykryj je nitro blue tetrazolium i roztworem do wywoływania koloru BCIP, aby chromogennie wykryć wiązanie przeciwciała. Zakończ reakcję, zanurzając matrycę w czystej wodzie z kranu.

Następnie umieść tablice do wyschnięcia między bibułą przez noc w temperaturze otoczenia. Względną obfitość 16 epitopów diagnostycznych polisacharydów ściany komórkowej roślin wykryto poprzez przyłączenie przeciwciał monoklonalnych skierowanych do glikanów do drukowanych ekstraktów. Większość wyekstrahowanych glikanów wykryto w alkalicznej frakcji wodorotlenku sodu.

Dla LM10 i LM11 zarejestrowano silne sygnały wiązania, reprezentujące ksylan i arabinoksylan w skórkach wszystkich badanych odmian mango. LM10 i LM11 wykazywały preferencyjne wiązanie z ekstraktem z tkanki korzenia czosnku i słabe wiązanie z ekstraktem z tkanki liścia LM19, reprezentujące częściowo estryfikowany metylem lub nieestryfikowany homogalakturonan, silnie związany z niektórymi ekstraktami odmian mango i tylko z frakcjami miazgi kawy.