Dwuwymiarowa wizualizacja mikrokrążenia mózgu szczura w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii lokalizacji ultradźwiękowej

Zakres naszych badań koncentruje się na opracowaniu protokołu mikroskopii lokalizacji ultrasonograficznej w celu uzyskania super rozdzielczościowego obrazowania mikrokrążenia mózgu szczura. Naszym celem jest sprostanie wyzwaniom związanym z równoważeniem specjalnej rozdzielczości i głębokości penetracji w obrazowaniu małych naczyń krwionośnych, dostarczając szczegółowych informacji na temat struktury naczyń krwionośnych i dynamiki przepływu krwi w stanach zdrowych i chorobowych.

Nasz protokół ma tę zaletę, że osiąga wysoką rozdzielczość przestrzenną 12,5 mikrometra, przy zachowaniu głębokości penetracji do 12 milimetrów, przewyższając konwencjonalne metody, takie jak rezonans magnetyczny, tomografia komputerowa i podwójne ultradźwięki. W przeciwieństwie do technik optycznych, umożliwia obrazowanie głębokich obszarów mózgu, rekonstrukcję struktur mikronaczyniowych i jednoczesną wizualizację dynamiki przepływu krwi.

Nasze wyniki torują drogę do badania zmian mikronaczyniowych w zaburzeniach neurologicznych, takich jak guz glejakowy i choroba Alzheimera. Możliwość wizualizacji dynamiki przepływu krwi i architektury mikrokrążenia w wysokiej rozdzielczości otwiera nowe możliwości badania progresji choroby, skuteczności leczenia oraz związku między zmianami mięśniowymi a funkcją mózgu.

[Narrator] Aby rozpocząć, połóż znieczulonego szczura na stole operacyjnym. Zabezpiecz górne siekacze szczura w wycięciu siekacza, umieszczając dolną szczękę poniżej pręta. Umieść listwy uszne w kostnym wgłębieniu, nieco do przodu i powyżej kanału słuchowego, upewniając się, że powierzchnia czaszki pozostaje pozioma. Wywieraj niewielki nacisk na różne części głowy, aby ocenić stabilność. Dostosuj wysokość platformy obrazowania i dostosuj kąt głowy szczura za pomocą wycięcia w siekaczu, aby zapewnić niezakłócone oddychanie. Nałóż maść erytromycyny lub 30% roztwór gliceryny na oczy szczura, aby chronić je przed światłem chirurgicznym i utrzymać wilgoć. Za pomocą ręcznej maszynki do strzyżenia elektrycznego ogol głowę szczura w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów, pokrywając obszar między uszami i od oczu do szyi. Teraz wykonaj nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego czaszki szczura, zaczynając tylko od kości potylicznej i rozciągając się około czterech centymetrów do przodu. Użyj hemostatów, aby cofnąć skórę po obu stronach. Opcjonalnie wytnij skórę nad czaszką, aby uzyskać lepszy dostęp. Użyj małych nożyczek, aby usunąć okostną z czaszki, całkowicie odsłaniając twardą warstwę kości. Wykonaj kraniotomię za pomocą ręcznego mini wiertarki czaszkowej, wyposażonego w 2,5-milimetrowe wiertło sferyczne. Delikatnie postukaj, aby przeciągnąć kość, wiercąc przez dwie do trzech sekund na raz, zaczynając centralnie i postępując na zewnątrz. Wstrzykiwać około jednego mililitra 0,9% roztworu chlorku sodu co dwie minuty do obszaru wiercenia, aby schłodzić i spłukać zanieczyszczenia. Przełącz się na drobniejsze wiertło o długości jednego milimetra, gdy biała tkanka kostna nie będzie już wyglądać na spójnie połączoną. Kontynuuj wiercenie, aż centralne główne naczynia krwionośne będą wyraźnie widoczne jako ciemnobrązowe, z otaczającą tkanką wyglądającą na różową, a mikronaczynia jako lekko czerwonawe. Aby przygotować środek kontrastowy, rozpuść gaz SF6 i liofilizowany środek kontrastowy w proszku w pięciu mililitrach 0,9% chlorku sodu. Energicznie wstrząśnij mieszaniną, aby utworzyć mikropęcherzyk lub zawiesinę MB o końcowym stężeniu SF6 wynoszącym osiem mikrolitrów na mililitr. Pobrać 0,8 mililitra zawiesiny MB do jednomililitrowej strzykawki podłączonej do pompy do mikroiniekcji. Wprowadzić igłę o rozmiarze 26 z cewnikiem do żyły ogonowej szczura i wstrzyknąć. Przed obrazowaniem zamontuj sondę o centralnej częstotliwości 15,625 megaherca na ramieniu manipulatora instrumentu stereotaktycznego mózgu wyposażonego w zacisk. Umieść sondę ultradźwiękową bezpośrednio nad odsłoniętym mózgiem szczura i nałóż żel sprzęgający na odsłoniętą powierzchnię mózgu, aby zapewnić optymalną transmisję sygnału. Otwórz główny interfejs oprogramowania, który integruje atlas mózgu owijania z programami do sterowania ruchem silnikowym. Ustaw punkt BGMA jako początek i użyj wyświetlacza oprogramowania w czasie rzeczywistym, aby monitorować trajektorię sondy i odpowiadającą jej lokalizację wycinka mózgu szczura. Wybierz docelową płaszczyznę obrazowania, taką jak BGMA minus jeden milimetr. Uruchom oprogramowanie MATLAB 2021a i wprowadź skrypt akwizycji danych w MATLAB 2021a. W katalogu głównym wpisz "activate" w oknie wiersza poleceń, aby aktywować środowisko wykonawcze. Następnie ustaw głębokość początkową i końcową zbierania danych odpowiednio na pięć i 120 długości fal, aby skutecznie uchwycić obszar zainteresowania. Ustaw kąty skrętu transmisji fal płaskich od minus pięciu stopni do pięciu stopni w krokach co 2,5 stopnia, aby poprawić rozdzielczość i kontrast obrazu. Mikroskopia lokalizacji ultradźwiękowej ujawniła wyraźną wizualizację mikronaczyń na głębokości do 12 milimetrów. Analiza pełnej szerokości do połowy maksimum wykazała, że najmniejsza wykrywalna średnica naczynia wynosi 13 mikrometrów. Korelacja pierścienia Fouriera potwierdziła rozdzielczość przestrzenną obrazowania mikronaczyniowego na poziomie 12,5 mikrometra. Kierunki przepływu krwi w przekroju poprzecznym mózgu szczura wykazywały przepływ w dół w małych tętnicach korowych i przepływ w górę w małych żyłach, reprezentowany odpowiednio przez kolor niebieski i czerwony. Mapa prędkości wykazała wyższe natężenia przepływu w większych zbiornikach, przy czym większość prędkości koncentrowała się w zakresie od 10 do 25 milimetrów na sekundę. Obrazowanie szczurzego modelu glejaka wykazało nieprawidłowe rozszerzenie naczyń krwionośnych, nieregularności strukturalne w pobliżu guza, zmienione wzorce przepływu krwi w obszarze guza oraz niejednorodny przepływ naczyniowy w obrębie guza i wokół niego.