No início do século 20, um bacteriologista britânico chamado Frederick Griffith estava trabalhando com a bactéria causadora de pneumonia Streptococcus pneumoniae. Ele realizou um experimento simples usando duas cepas diferentes. Uma cepa é conhecida como cepa S por causa de uma cápsula protetora que faz com que as colônias ou aglomerados que ela forma pareçam lisas e também a torna virulenta ou prejudicial. A segunda foi a cepa R, uma versão da bactéria sem a cápsula protetora, dando às colônias uma aparência áspera e tornando-a não virulenta.
Primeiro, Griffith pegou algumas das bactérias da cepa S e as aqueceu, produzindo uma versão morta pelo calor da cepa S. Em seguida, ele reuniu alguns ratos e os dividiu em quatro grupos. Ele injetou no primeiro grupo a cepa S virulenta e o segundo com a cepa R não virulenta. Ele dosou o terceiro grupo com a cepa S morta pelo calor e, finalmente, combinou a cepa S morta pelo calor e a cepa R juntas, e injetou essa mistura no quarto grupo. Como esperado, os camundongos do primeiro grupo morreram e os do segundo e terceiro grupo sobreviveram. Mas, para surpresa de Griffith, os ratos do último grupo também morreram.
Quando ele publicou seu estudo em 1928, ele chamou esse misterioso processo de transformação, pois especulou a presença de um princípio transformador subjacente, que permitiu que a cepa anteriormente não virulenta se tornasse mortal. Mais tarde, em 1943, Avert, MacLeod e McCarty relataram que esse princípio transformador era provavelmente o ácido desoxirribonucléico, ou DNA, que agora sabemos ser o material de hereditariedade. Essencialmente, o que aconteceu no experimento de Griffith foi que, quando as bactérias foram combinadas, algum DNA vazou da cepa S morta pelo calor e para as células da cepa R, transformando essas bactérias não virulentas e passando as informações para fazer a cápsula protetora, transformando a cepa R em virulenta, agora capaz de matar os animais do quarto grupo.
Avançando para hoje, os cientistas desenvolveram uma maneira muito mais simples de estudar a transformação bacteriana, usando a bactéria E. coli e pequenos loops circulares de DNA chamados plasmídeos. Normalmente, o plasmídeo usado em experimentos de transformação inclui um gene para uma função especial, como resistência a antibióticos. E. coli são um excelente assunto para transformação porque podem exibir uma propriedade chamada competência, a capacidade de absorver DNA do ambiente. Essencialmente, isso significa que, sob certas condições ambientais, como um produto químico ou um choque elétrico ou térmico, a parede celular da E. coli pode se tornar temporariamente permeável e permitir a absorção de DNA do ambiente. Uma vez que o plasmídeo está dentro da E. coli, ele pode ficar no citoplasma de sua nova célula hospedeira e ser replicado e expresso ao longo de gerações ao lado do genoma, ou pode se incorporar totalmente ao genoma do hospedeiro. Se a bactéria perder o plasmídeo a qualquer momento, a célula também perderá sua resistência aos antibióticos e, portanto, os cientistas cultivam as bactérias em um meio contendo o antibiótico para garantir que os únicos sobreviventes sejam aqueles que contêm o plasmídeo de interesse.
Neste laboratório, você aprenderá como transformar células de E. coli com um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos, enquanto pratica técnicas microbiológicas estéreis.
Fundo
No início doséculo 20, a pneumonia era responsável por uma grande parte das mortes por doenças infecciosas1. A fim de desenvolver uma vacina eficaz contra a pneumonia, Frederick Griffith começou a estudar duas cepas diferentes do Streptococcus pneumoniae: uma cepa não virulenta com aparência áspera (cepa R) e uma cepa virulenta com aparência lisa (cepa S) devido a uma cápsula externa de polissacarídeo2. Essa camada externa da bactéria da cepa S permitiu que elas resistissem ao sistema imunológico do hospedeiro, levando a uma doença com risco de vida. Quando Griffith injetou separadamente em camundongos bactérias mortas pelo calor de qualquer cepa, os camundongos sobreviveram. No entanto, quando ele injetou camundongos com uma combinação da cepa S morta pelo calor com a cepa R viva, os camundongos morreram2. Quando ele analisou as amostras obtidas de camundongos mortos injetados com a combinação, ele observou a presença de bactérias vivas da cepa S. Em 1928, Griffith observou que um processo de "transformação" deve ter ocorrido para transformar as bactérias não virulentas na cepa virulenta. Como a primeira descoberta conhecida da transformação bacteriana, sua descoberta abriu caminho para o desenvolvimento de uma ferramenta essencial na engenharia genética - a transformação3.
Transformação é a mudança genética em uma célula devido à ingestão de DNA do ambiente. No experimento de Griffith, o DNA que codifica o revestimento protetor de polissacarídeo das bactérias da cepa S não se decompôs com o choque térmico e foi introduzido na cepa R, permitindo que esta contornasse o sistema imunológico do camundongo. Embora esse processo ocorra constantemente na natureza entre organismos e até espécies diferentes, os cientistas transformam bactérias em ambientes de laboratório para fins de pesquisa4.
Transformação bacteriana usando plasmídeos
As bactérias são os organismos ideais para transformação, pois podem facilmente absorver material genético exógeno em seu genoma e amplificá-lo rapidamente3,5. Eles têm um cromossomo circular e vários pequenos pedaços circulares de DNA de fita dupla chamados plasmídeos dentro do citoplasma. Esses plasmídeos podem se replicar independentemente do DNA cromossômico e geralmente fornecem certos benefícios funcionais, como resistência a antibióticos6,7. Em seu ambiente natural, as bactérias sofrem "transformação bacteriana" ao absorver plasmídeos de outras bactérias em um processo chamado conjugação8. Além disso, quando se multiplicam, cada um de seus descendentes recebe uma cópia do novo plasmídeo.
Os plasmídeos usados para fins experimentais são chamados de vetores de plasmídeos. Em um ambiente de laboratório, os cientistas podem criar artificialmente "plasmídeos recombinantes" com aproximadamente 5.000 a 10.000 pares de bases de comprimento, inserindo fragmentos de DNA em um vetor de plasmídeo. Esses plasmídeos recombinantes geralmente têm certos componentes: uma origem de replicação (ORI), um gene de resistência a antibióticos, um local de clonagem múltipla, um promotor, um marcador de seleção e o gene de interesse. A origem da replicação é onde a replicação começa. O gene de resistência a antibióticos permite que as bactérias que absorvem o plasmídeo sobrevivam em placas na presença de um determinado antibiótico. Embora os plasmídeos sejam pedaços relativamente pequenos de DNA, os cientistas precisam tratar as células hospedeiras para permitir a penetração do plasmídeo através da membrana celular. Portanto, a eficiência da transformação está diretamente relacionada à porosidade da membrana hospedeira. Uma abordagem comum é dar choque térmico nas bactérias que foram tratadas com uma solução de cloreto de cálcio9. As bactérias que não incorporam o plasmídeo não se transformam e, portanto, não têm resistência para sobreviver na placa e serem visíveis. Os múltiplos locais de clonagem auxiliam na inserção do DNA, contendo locais para enzimas de restrição cortarem o plasmídeo onde o gene de interesse pode ser inserido e ligado. O promotor impulsiona a transcrição do gene de interesse. É marcado por um marcador, geralmente uma proteína fluorescente, como uma proteína fluorescente verde (GFP), ou pode ser um gene adicional de resistência a antibióticos. O gene de resistência a antibióticos e os outros marcadores de seleção nos ajudam a determinar se as bactérias coletadas contêm o plasmídeo de interesse.
Aplicativos
Métodos de transformação eficazes permitiram aos cientistas isolar e traçar o perfil de genes e produtos gênicos e levaram a muitos avanços nas ciências da vida e na medicina, como o desenvolvimento de medicamentos eficazes, geração de culturas geneticamente modificadas e ferramentas avançadas de diagnóstico10. Além disso, com os avanços tecnológicos, surgiram novos métodos de transformação. Por exemplo, a clonagem de gateway permite a inserção de vários fragmentos de DNA em diferentes vetores, bem como a transferência de sequências de DNA entre plasmídeos11. Além disso, as repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)-Cas9 são uma técnica de edição de genes que modifica diretamente os nucleotídeos no genoma e não requer o uso de plasmídeos12. Após a transformação, os pesquisadores geralmente isolam e traçam o perfil do gene de interesse e seus produtos. Posteriormente, todo o processo de clonagem genética abriu um novo campo de manipulação genética. Graças à clonagem genética, os pesquisadores podem manipular bactérias para produzir grandes quantidades de proteínas humanas específicas, como a insulina, paratratar pacientes com diabetes. A clonagem também tem desempenhado uma grande importância na agricultura moderna. Os organismos geneticamente modificados (OGM) são resultado direto da clonagem genética e da transformação bacteriana10. Por exemplo, os cientistas estão trabalhando para gerar culturas geneticamente modificadas com genes fixadores de nitrogênio incorporados em seu genoma para aumentar a produção de alimentos e reduzir o uso de fertilizantes, diminuindo assim o impacto econômico e ambiental dos fertilizantes. Em suma, a transformação bacteriana é o primeiro passo da biotecnologia moderna e a base de futuras descobertas de pesquisa.
Referências
- GL, Armstrong, LA, Conn e RW, Pinner. Tendências na mortalidade por doenças infecciosas nos Estados Unidos durante o século 20. Jama. 1999, Vol. 281, 1 (61-66).
- F, Griffith. O significado dos tipos pneumocócicos. J Hyg (Londres). . 1928, 2 (113-59).
- Lorenz, MG e Wackernagel, F. Transferência de genes bacterianos por transformação genética natural no meio ambiente. Microbiol Rev. . Setembro de 1994, Vol. 58, 3: (563-602).
- S, Domingues, et al. A transformação natural facilita a transferência de transposons, integrons e de genes entre espécies bacterianas. Patógenos PLOS. 2012, 8(8): e1002837.
- Dubnau, D. Captação de DNA em bactérias. Annu Rev Microbiol. . 1999, 53: (217-44).
- Solar, G del, et al. Replicação e controle de plasmídeos bacterianos circulares. Microbiol Mol Biol Rev. . 1998, Vol. 62, 2: (434-64).
- Bennett, PM. Resistência a antibióticos codificada por plasmídeo: aquisição e transferência de genes de resistência a antibióticos em bactérias. Br J Farmacol. . 2008, Vol. 153, S1: (S347-S357).
- MLlosa, et al. Conjugação bacteriana: um mecanismo de duas etapas para o transporte de DNA. Mol Microbiol. Julho de 2002;, Vol. 45, 1: (1-8).
- Roychoudhury, A, Basu, S e Sengupta, DN. Análise comparativa de eficiências de diferentes métodos de transformação de E. coli usando dois vetores plasmídicos comuns. Indiano J Biochem Biophys. . 2009, Vol. 46, 5: (395-400).
- Khan, S, et al. Papel da tecnologia de DNA recombinante para melhorar a vida. I. nt J Genômica. . 2016, 2016:2405954.
- Marsischky, G e LaBaer, J. Muitos caminhos para muitos clones: um olhar comparativo sobre os métodos de clonagem de alto rendimento. Genoma Res. 2004, Vol. 14, 2020-28.
- Doudna, JA e Charpentie, E. A nova fronteira da engenharia genômica com CRISPR-Cas9. ciência. 2014, Vol. 346, 6213-1258096.
- Bom, A. Em direção às plantas fixadoras de nitrogênio. ciência. 2018, Vol. 359, 6378: 869-70.
No início do século 20, um bacteriologista britânico chamado Frederick Griffith estava trabalhando com a bactéria causadora de pneumonia Streptococcus pneumoniae. Ele realizou um experimento simples usando duas cepas diferentes. Uma cepa é conhecida como cepa S por causa de uma cápsula protetora que faz com que as colônias ou aglomerados que ela forma pareçam lisas e também a torna virulenta ou prejudicial. A segunda foi a cepa R, uma versão da bactéria sem a cápsula protetora, dando às colônias uma aparência áspera e tornando-a não virulenta.
Primeiro, Griffith pegou algumas das bactérias da cepa S e as aqueceu, produzindo uma versão morta pelo calor da cepa S. Em seguida, ele reuniu alguns ratos e os dividiu em quatro grupos. Ele injetou no primeiro grupo a cepa S virulenta e o segundo com a cepa R não virulenta. Ele dosou o terceiro grupo com a cepa S morta pelo calor e, finalmente, combinou a cepa S morta pelo calor e a cepa R juntas, e injetou essa mistura no quarto grupo. Como esperado, os camundongos do primeiro grupo morreram e os do segundo e terceiro grupo sobreviveram. Mas, para surpresa de Griffith, os ratos do último grupo também morreram.
Quando ele publicou seu estudo em 1928, ele chamou esse misterioso processo de transformação, pois especulou a presença de um princípio transformador subjacente, que permitiu que a cepa anteriormente não virulenta se tornasse mortal. Mais tarde, em 1943, Avert, MacLeod e McCarty relataram que esse princípio transformador era provavelmente o ácido desoxirribonucléico, ou DNA, que agora sabemos ser o material de hereditariedade. Essencialmente, o que aconteceu no experimento de Griffith foi que, quando as bactérias foram combinadas, algum DNA vazou da cepa S morta pelo calor e para as células da cepa R, transformando essas bactérias não virulentas e passando as informações para fazer a cápsula protetora, transformando a cepa R em virulenta, agora capaz de matar os animais do quarto grupo.
Avançando para hoje, os cientistas desenvolveram uma maneira muito mais simples de estudar a transformação bacteriana, usando a bactéria E. coli e pequenos loops circulares de DNA chamados plasmídeos. Normalmente, o plasmídeo usado em experimentos de transformação inclui um gene para uma função especial, como resistência a antibióticos. E. coli são um excelente assunto para transformação porque podem exibir uma propriedade chamada competência, a capacidade de absorver DNA do ambiente. Essencialmente, isso significa que, sob certas condições ambientais, como um produto químico ou um choque elétrico ou térmico, a parede celular da E. coli pode se tornar temporariamente permeável e permitir a absorção de DNA do ambiente. Uma vez que o plasmídeo está dentro da E. coli, ele pode ficar no citoplasma de sua nova célula hospedeira e ser replicado e expresso ao longo de gerações ao lado do genoma, ou pode se incorporar totalmente ao genoma do hospedeiro. Se a bactéria perder o plasmídeo a qualquer momento, a célula também perderá sua resistência aos antibióticos e, portanto, os cientistas cultivam as bactérias em um meio contendo o antibiótico para garantir que os únicos sobreviventes sejam aqueles que contêm o plasmídeo de interesse.
Neste laboratório, você aprenderá como transformar células de E. coli com um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos, enquanto pratica técnicas microbiológicas estéreis.
No início do século 20, um bacteriologista britânico chamado Frederick Griffith estava trabalhando com a bactéria causadora de pneumonia Streptococcus pneumoniae. Ele realizou um experimento simples usando duas cepas diferentes. Uma cepa é conhecida como cepa S por causa de uma cápsula protetora que faz com que as colônias ou aglomerados que ela forma pareçam lisas e também a torna virulenta ou prejudicial. A segunda foi a cepa R, uma versão da bactéria sem a cápsula protetora, dando às colônias uma aparência áspera e tornando-a não virulenta.
Primeiro, Griffith pegou algumas das bactérias da cepa S e as aqueceu, produzindo uma versão morta pelo calor da cepa S. Em seguida, ele reuniu alguns ratos e os dividiu em quatro grupos. Ele injetou no primeiro grupo a cepa S virulenta e o segundo com a cepa R não virulenta. Ele dosou o terceiro grupo com a cepa S morta pelo calor e, finalmente, combinou a cepa S morta pelo calor e a cepa R juntas, e injetou essa mistura no quarto grupo. Como esperado, os camundongos do primeiro grupo morreram e os do segundo e terceiro grupo sobreviveram. Mas, para surpresa de Griffith, os ratos do último grupo também morreram.
Quando ele publicou seu estudo em 1928, ele chamou esse misterioso processo de transformação, pois especulou a presença de um princípio transformador subjacente, que permitiu que a cepa anteriormente não virulenta se tornasse mortal. Mais tarde, em 1943, Avert, MacLeod e McCarty relataram que esse princípio transformador era provavelmente o ácido desoxirribonucléico, ou DNA, que agora sabemos ser o material de hereditariedade. Essencialmente, o que aconteceu no experimento de Griffith foi que, quando as bactérias foram combinadas, algum DNA vazou da cepa S morta pelo calor e para as células da cepa R, transformando essas bactérias não virulentas e passando as informações para fazer a cápsula protetora, transformando a cepa R em virulenta, agora capaz de matar os animais do quarto grupo.
Avançando para hoje, os cientistas desenvolveram uma maneira muito mais simples de estudar a transformação bacteriana, usando a bactéria E. coli e pequenos loops circulares de DNA chamados plasmídeos. Normalmente, o plasmídeo usado em experimentos de transformação inclui um gene para uma função especial, como resistência a antibióticos. E. coli são um excelente assunto para transformação porque podem exibir uma propriedade chamada competência, a capacidade de absorver DNA do ambiente. Essencialmente, isso significa que, sob certas condições ambientais, como um produto químico ou um choque elétrico ou térmico, a parede celular da E. coli pode se tornar temporariamente permeável e permitir a absorção de DNA do ambiente. Uma vez que o plasmídeo está dentro da E. coli, ele pode ficar no citoplasma de sua nova célula hospedeira e ser replicado e expresso ao longo de gerações ao lado do genoma, ou pode se incorporar totalmente ao genoma do hospedeiro. Se a bactéria perder o plasmídeo a qualquer momento, a célula também perderá sua resistência aos antibióticos e, portanto, os cientistas cultivam as bactérias em um meio contendo o antibiótico para garantir que os únicos sobreviventes sejam aqueles que contêm o plasmídeo de interesse.
Neste laboratório, você aprenderá como transformar células de E. coli com um plasmídeo contendo um gene de resistência a antibióticos, enquanto pratica técnicas microbiológicas estéreis.
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