Electron Cryotomography de células bacterianas

I. Preparação da Cultura célula bacteriana

1. Cultivar as células bacterianas em seus meios de comunicação normais para a fase desejada em uma cultura poucos ml de líquido. Se maior concentração é necessária, fiação e re-suspensão em novas mídias podem ser adotadas, mas esteja ciente de que este processo, por vezes, introduz mudanças estruturais nas células.
2. Verifique no microscópio de luz para garantir que a cultura é livre de contaminantes e em uma confluência apropriada.
3. Algumas células bacterianas pode furar ou até mesmo crescer nas grades EM. Quando as células que crescem em grades, grades de ouro com um casaco de carbono são mais frequentemente usado para evitar a toxicidade para as células. Eles devem ser descarregados brilho por 2 minutos, esterilizados sob uma luz UV por 15 minutos, e colocados diretamente na cultura líquido. Células aderentes irá naturalmente manter o grid, e outros podem ser solicitados a aderir à rede, protegendo a rede em 0,1% de poli-L-lisina em primeiro lugar. Verifique as grades no microscópio de luz para ter certeza de a concentração de células é apropriado antes do congelamento.

II. Mergulhe congelamento de células finas

Para fina de células bacterianas, a suspensão de células intactas é mergulhar congelados em uma grade de EM. O processo preserva a estrutura ultra-das células de bactérias e evitar a evaporação da água no alto vácuo do EM mais tarde. Isso pode ser feito tanto com os dispositivos feitos por congelamento de mergulho, ou como nós mostramos aqui, com um freezer mergulho comercial automático, FEI Vitrobot MKIII. ⁴

1. Descarga luminescente de carbono revestido de grade EM para 2-4 minutos. Isso faz com que a superfície da grade hidrofílica, contribuindo assim para a amostra uniformemente distribuído em toda a grade inteira.
2. Mix 100μl de solução de ouro coloidal (diâmetro de partícula de 10 nm) com 25μl de uma solução de BSA 5% concentrado. Os casacos BSA as partículas de ouro e isso impede a sua agregação.
3. Centrifugar a BSA e mistura de partículas de ouro no 18000g por 15 minutos. Após a remoção do sobrenadante, o pellet restantes ouro é misturado com 20 mL de solução celular. A BSA partículas de ouro tratados não reagem com as células, mas eles serão necessários como marcadores fiduciais para a reconstrução das tomografias.
4. Aplicar 4 mL da solução de mistura de células e de ouro para o brilho da grade EM descarregada na Vitrobot em 100% de umidade. A grade é automaticamente apagado de ambos os lados com um filtro de papel n º. Isso remove o excesso de líquido, de modo que somente um filme fino de células em seus meios de comunicação permanece. A grade é, então, mergulhou rapidamente em uma mistura líquida de etano e propano, que é resfriado até cerca de 77K com nitrogênio líquido. Durante este processo, a amostra é congelada tão rapidamente que a formação de cristais de gelo é impedida em filmes finos <1 mícron.
5. Remova cuidadosamente a grelha a partir da mistura de etano / propano e rápida de transferir em uma caixa de armazenamento de rede que é mantida sob nitrogênio líquido.

III. Congelamento de pressão alta e Cryo Seccionamento de Células Thicker

Para as células mais espessas, o congelamento de alta pressão reduz a cristalização de gelo e secção posterior crio torna amostras fina o suficiente para EM de imagem. ^{5, 6, 7} Há muitos suportes de amostras diferentes disponíveis para o congelamento de alta pressão, a seleção vai depender da amostra, o tipo de máquina de congelação utilizado ou a aplicação de investigação selecionado. Aqui usamos Bal-Tec HPM 010 freezer de alta pressão e ultra-micrótomo modelo crio UC6/FC6 da Leica Microsystems.

1. Para as bactérias, 15mls giratório cultura OD> 0,5 é levado diretamente a partir dos 37 ° C incubadora e centrifugado a 1000rpm por 3 minutos. Depois de remover o sobrenadante de 0,5 ml, misture o restante da cultura de pelotas com 0,5 ml de dextran 20% crioprotetor e então centrifugue a 13000rpm por 15 segundos.
2. Depois de remover o sobrenadante, 0,1 ml da pipeta do pellet super-cola em calor, selada ponta micropipeta que já contém 0,2 ml de 20% dextran cryoprotecant (40000Mwt). Centrifugar a mistura na ponta micropipeta em 13.000 rpm por 30 segundos e remova o sobrenadante. A 50-10 mL pellet apertado é visto na ponta selada.
3. A "Teflon" bronze com cúpula revestida montada planchet pronto no braço de suporte de alta pressão freezer recebe o colar em um meio-cúpula e é selada com o seu chapéu plana parceiro de bronze.
4. O conjunto do braço é, então, prontamente inserido no freezer pressão alta preparado pronto para congelamento.
5. A 2100 bar de pressão da unidade planchet combinado de latão contendo as células é rapidamente resfriado por um jato de nitrogênio de alta pressão do líquido, a remoção do conjunto do braço instantânea e mergulhar em um banho de nitrogênio líquido impede a planchet do aquecimento.
6. Unidades Planchet são armazenadas em nitrogênio líquido até serem necessárias para crio-seccionamento.
7. Para expor a cúpula bem-congelados de células para o seccionamento, os dois planchets bronze são cuidadosamente separados under nitrogênio líquido.
8. A cúpula perfeitamente congelados de células tem um aspecto vítreo, livres de rachaduras e fissuras nucleação de gelo.
9. Este planchet é transferido para um pré-resfriada -170 ° C e câmara de montado de forma segura sobre o crio-micrótomo como vice-chuck.
10. O cryomicrotome resfriado contém cryotools essenciais necessários para o corte, estas incluem: uma faca de baixo ângulo crio-diamante, uma ferramenta de diamante de corte, plataforma de imprensa, caixa de armazenamento de rede, uma unidade de spray anti-estático e um aparelho de grade exploração.
11. Para fitas de sucesso seccionamento uma região cúpula exterior é, inicialmente em forma de <0,2 milímetros quadrados pela ferramenta de diamante de corte e uma velocidade rápida de corte, mantendo a profundidade de 200μm ~ perímetro bem congelado.
12. Com o spray anti-estático direcionado para a faca de baixo ângulo e grades de cobre de apoio de proximidade, a faca de diamante é cuidadosamente avançados para a face polida bloco preparado para corte.
13. Micrótomo parâmetros são escolhidos, como uma definição de espessura de corte entre 50 a 350 nm, juntamente com uma velocidade de corte de ~ 0.4mm/sec e janela de corte estreita. É importante controlar o intervalo de spray anti-estático e intensidade às condições de baixa umidade na área imediata.
14. Como primeiras seções são produzidos um aplicador de cílios finos é manobrado manualmente ou micromanipulador para prender as seções iniciais de correr fora do baixo ângulo fio da navalha de diamante.
15. Enquanto a fita de seções é forçado a sair a faca, eles são gentilmente apoiado por uma sonda de cílios e guiou todo o apoio da rede de cobre nas proximidades.
16. Furar as seções, a grade carregado com fitas é então firmemente pressionado através de uma sonda de prata polida resfriado, algumas seções são tão altamente carregadas os mais recentes dispositivos anti-estático pode ajudar no processo de adesão.
17. Caixas de grade são mantidos para o armazenamento de longo prazo em um nitrogênio líquido refrigerado shipper seco até o microscópio está pronto para a transferência de grade.

IV. Examine as células usando o microscópio de luz Cryo

As células bacterianas no grid podem ser visualizados usando o microscópio de luz crio (cryoLM). O microscópio que usamos aqui é um microscópio invertido Nikon personalizado Ti E / B, com distância de trabalho extra longas (ELWD) 60x lente objetiva ar. As grades são mantidas em um estágio durante crio imagens, que é uma versão modificada FEI estágio crio para microscópio de luz. Usando uma grade finder, as células podem ser localizados no quadrículas e as imagens cryoLM ser correlacionada com a tomogramas cryoEM.

1. Grades de carga em cartuchos de crio-estação. Os cartuchos são personalizadas modificado a partir do nosso cartucho de EM padrão para a FEI TF30H-Polara. A grade é pressionada por anéis de grampo de cobre. O cartucho é mantida em um tubo em nitrogênio líquido para a transferência.
2. Resfriar o estágio crio até à temperatura de nitrogênio líquido (-190 ° C).
3. Carregar o cartucho no palco crio e passar a grade na janela de visualização. O estágio pode conter até dois cartuchos de costume modificado.
4. Abaixe a lente condensadora e focar a lente objetiva de 60x em grid.
5. Encontrar as células e tirar fotos. Para LM correlacionados e estudo EM, a grade é digitalizado em torno da área das células, para localizar as células mais tarde na EM.
6. Depois de imagem da grelha, coloque o cartucho de volta para dentro do tubo e manter o tubo em nitrogênio líquido até que esteja pronto a ser trabalhada em EM.

V. Coletar Series Tilt no TEM Cryo

Para obter uma tomografia 3D da célula bacteriana, uma série de imagens de projeção são tomadas enquanto a amostra é inclinada de forma incremental ao longo de um ou dois eixos no TEM crio. Dada a ângulos de inclinação e outras configurações experimentais, existem diversos softwares disponíveis para coletar automaticamente a série de inclinação. Usamos para o nosso Leginon TEM crio que é FEI TF30H-Polara. Que permite automaticamente levando série inclinação de células pré-selecionados. ⁸

1. Carregar os cartuchos no suporte multi-selecção (MSH) na estação crio pré-resfriada. O MSH pode armazenar até 6 cartuchos.
2. Conecte o MSH ao TF30H-Polara, escolher um cartucho e insira-o na coluna de EM.
3. Iniciar Leginon cliente no computador e programa EM Leginon principal na outra estação de trabalho.
4. Criar presets (condições de imagem) para uma sessão de Leginon. Os parâmetros importantes são a ampliação, o valor sob foco, a dose de elétrons e os ângulos de inclinação para a série de inclinação, inclusive ângulo inicial, ângulo de ponta e incrementos.
5. Escolha alvos em imagens a partir do menor ampliação e enviá-los para a próxima etapa com maior ampliação.
6. Fila todos os alvos de inclinação da série coleta e enviar todos eles para a etapa de "tomografia" final.
7. O processo de coleta de dados pode ser monitorado através da ferramenta de web a partir de uma estação de trabalho local.
8. Após a coleta de dados experimentais é feito, para baixocarregar a conclusão tilt-série em uma estação de trabalho local para a reconstrução.

VI. Biossegurança considerações

A maioria das amostras biológicas que nós trabalhamos com são não-patogênico e foram isolados do solo, a água da torneira ou do intestino dos insetos. Técnica asséptica básica é suficiente para lidar com essas amostras. Trabalhando com patógenos requer a implementação de medidas de segurança adicionais, porém para os perigos extremos, alguns laboratórios têm instalado toda Cryo-EM microscópios dentro BSL-3 laboratórios. A seguir estão algumas das maneiras de ter reduzido o risco de trabalhar com patógenos em nosso laboratório.

1. A patogenicidade de uma amostra pode ser atenuada ou quimicamente ou geneticamente. Muitos laboratórios fazendo Cryo-EM de vírus inativado ter-los com fixadores químicos antes de mergulhar de congelamento. Como alternativa, as mutações-chave pode ser introduzido que tornam as amostras não-infecciosos, incluindo, por exemplo, mutações inativadoras ponto em certas enzimas ou receptores batendo para fora.
2. Equipamentos de proteção individual, como luvas, jaleco e óculos de proteção devem ser usados.
3. Amostras perigosos podem ser manipulados em uma cabine de segurança biológica (CSB). Culturas bacterianas podem ser cultivadas, concentrados, e até mesmo mergulhar congelado em EM grades no BSC. Temos um menor, dispositivo mergulhar congelamento-manual que se encaixa em nosso BSC para esta finalidade. Se o maior consistência oferecido pelo automática mergulhar-freezers é necessário, eles podem ser introduzidos no BSC, ou, mais simplesmente, em certos casos, temos apoiado as almofadas blotting da nossa Vitrobot com folha de alumínio para evitar a contaminação do dispositivo. Ao trabalhar com um BSC, como muitas das ferramentas e materiais possível entrar ou sair do gabinete devem ser desinfetados com álcool 70%. Ao preparar nossas redes, usamos pequenos volumes de uma cultura bacteriana ou viral (geralmente 4 ul), a maioria dos quais fica apagado pelo papel Whatman. O papel absorvente, ponteiras, e da cultura restantes são descartados como resíduos perigosos. Todas as ferramentas e superfícies expostas são desinfectados com lixívia diluída, 95% de etanol e depois água.
4. Uma vez que as grades estão congelados, eles são conservados a temperaturas de nitrogênio líquido durante coleta, armazenamento e dados. Tem sido demonstrado que as células podem sobreviver congelamento e descongelamento, em seguida, embora, por isso continuamos a tratá-los como perigosos durante coleta, armazenamento e dados. No final de coleta de dados, cartuchos contendo grades congeladas são removidos da crio-TEM e caiu diretamente em álcool a 70%. Embora raro, deve-se notar que às vezes as redes são "caiu" dentro da coluna, e as conseqüências de um evento como esse deve ser contemplado para cada amostra perigosos. A maioria do microscópio está à temperatura ambiente, de modo a amostra em uma grade caiu provavelmente descongelar dentro da coluna e tornar-se completamente desidratado no vácuo ultra-alto da EM. Isto, obviamente, inativar algumas amostras biológicas, mas talvez não vírus robusto, e os restos desidratado da amostra poderia ser lançado como aerossóis, quando a coluna do microscópio é o próximo aberta para o serviço.

VII. Tomografia Reconstrução

O tomogramas das células bacterianas são reconstruídas através de software. Existem diversos softwares disponíveis para este trabalho. Usamos Raptor para a reconstrução automática e tomogramas triagem. ⁹ Como o alinhamento automático série de inclinação e posterior reconstrução é uma tarefa não-trivial, Raptor atualmente não têm uma taxa de sucesso de 100%. No caso do Raptor falha ou a necessidade de uma reconstrução de alta qualidade, usamos o alinhamento da imagem manual e reconstrução com eTomo na suíte de software IMOD tomografia. ^{10, 11}

1. O download de cada série inclinação individual do servidor Leginon local. Salvá-los em um diretório onde eles podem ser facilmente localizados.
2. Manualmente inspecionar a série de inclinação usando visualizador 3dmod IMOD e descartar aqueles Leginon quando falhou o alvo ou de monitoramento produzindo uma série de inclinação útil.
3. Corremos Raptor distribuídos sobre as máquinas Linux no laboratório através de Peach (um sistema baseado em Pérola para distribuir tarefas através de uma rede). Nós especificar o tamanho dos nossos marcadores fiducial, ou seja, as partículas de ouro coloidal, o número de marcadores a serem utilizados para a reconstrução, o pixel de tamanho, a espessura desejada de reconstrução, o fator binning e uma série de configurações básicas (tais como entrada, caminhos de saída eo formato de saída) na linha de comando e deixá-lo funcionar, geralmente 20min a 2h por um 122-imagem dataset (2k por 2k). Se estiver satisfeito com o resultado da reconstrução, as etapas a seguir nesta seção podem ser ignorados.
4. Quando a reconstrução manual é necessário, renomear arquivos ". Mrc" para "st." Tilt e carregar série individuais para o GUI eTomo na suíte tomografia IMOD.
5. Especificar tipo de eixo de inclinação da série (eixos simples ou dupla), e digite o tamanho fiducial utilizado em sapreparação mple. Digitalizar o cabeçalho do arquivo para determinar o tamanho do pixel, e prossiga clicando em "Criar scripts Com".
6. Siga os passos de cada guia na GUI eTomo para reconstruir a tomografia da série de inclinação. Inspecionar e verificar o resultado após cada etapa, e se não ficar satisfeito, sempre podemos voltar a qualquer passo anterior e reprocessar a partir daí. "Pré-processamento" é para realizar o processamento de preparação e remover anormalmente alta intensidade pixels causados ​​por raios-X. "Alinhamento grosseiro" produz uma série de inclinação em que cada imagem de projeção subseqüentes na série de inclinação está alinhada com as anteriores, de correlação cruzada. Nós definimos contas que o ouro para usar como fiducials em "Geração Modelo Fiducial", eo programa rastreia o fiducial marcadores em cada imagem de projeção e constrói "Alinhamento Fine". "Posicionamento tomografia" permite cortar a tomografia em Z. "Stack Alinhados Final" é gerado através de interpolação linear, e funções como CTF-correção, Gold-Eraser e 2D de filtragem pode ser aplicada, opcionalmente. A tomografia é calculado em "Gerar tomografia" por ponderada retro-projeção no espaço de Fourier. "Pós-processamento" permite corte da tomografia para o XY-região de interesse e escala o contraste na faixa das estruturas de interesse, e "Clean Up" exclui os arquivos intermediário e libera o espaço em disco.

VIII. Armazenamento dos tomogramas no banco de dados

Nós usamos um banco de dados baseado na web em casa para organizar, armazenar, pesquisar e distribuir os dados tomográficos. Para cada série de inclinação, pode-se registrar os detalhes da amostra, os parâmetros de coleta de microscópio, série tilt-prima, bem como associada a reconstrução 3D e arquivos de outras transformações. A página principal apresenta uma imagem em miniatura e um destaque "YouTube" como filme para cada tomogram, e as entradas podem ser organizados por download de freqüência, o criador tipo de amostra, ou a data. Os usuários podem pesquisar o banco de dados digitando palavras-chave ou características especiais. Atualmente mais de 4.500 série tilt tomográfica tenham sido depositados no banco de dados, cobrindo cerca de 60 tipos de espécies / amostra, com um total de mais de 11.000 arquivos associados.

IX. Análise e Segmentação do tomogramas

1. Os detalhes estruturais do tomogramas podem ser vistos e analisados ​​através de diferentes softwares com ferramentas de processamento de imagem, por exemplo, visualizador de 3dmod IMOD com ZAP, XYZ e janela Slicer.
2. O próximo passo é criar uma segmentação da imagem 3D (tomografia). A segmentação atribui a cada voxel (pixel volumétrico) da imagem 3D de um rótulo que descreve a que região ou o material voxel pertence, por exemplo, uma membrana ou um citoesqueleto. Usamos ferramentas de software, tais como 3dmod em IMOD e Amira (Imaging Visage).
3. Apesar de algumas ferramentas de software fornecer módulos segmentação automática (por exemplo, a segmentação limiar), que muitas vezes funcionam apenas para imagens com alto contraste. As imagens 3D derivado de baixa dose cryotomography elétrons têm baixo contraste de tal forma que na maioria dos casos temos que atribuir manualmente um rótulo para cada voxel.
4. A segmentação é armazenado em um arquivo de dados separado. Ele pode ser usado para gerar um modelo de superfície em que cada região é mostrada com uma cor diferente e visualizados em 3D.
5. O tomogramas pode ser usado para outras análises. Por exemplo, combinando modelo e posterior cálculo pode produzir informação estatística do complexo macromolecular, tais como os ribossomos. Subvolume alinhamento e média mostra estruturas em maior contraste e revela detalhes mais finos.

X. Fazer filmes baseados em tomografias

Fazemos filmes para resumir cada projeto e para dar um passeio visual de nossas imagens tomográficas.

1. Fazer um script das características dos dados que gostaria de mostrar e como processar essas características. Por exemplo, em um filme típico de um projeto de tomografia de célula inteira, começamos mostrando uma série de dados representativos de inclinação e siga com vista fatia por fatia do tomogram reconstruído. Em seguida, vamos mostrar uma segmentação de macromoléculas chave na célula, por exemplo, um motor flagelar ou um complexo quimiorreceptora ou um filamento citosólica. Finalmente, concluímos com uma modelo mostrando uma interpretação idealizada das macromoléculas que estamos estudando.
2. Softwares gráficos de representação, como Amira ou Chimera são usados ​​para processar os quadros individuais ainda do filme. Normalmente, montar filmes de clipes curtos para facilitar as mudanças a cada clipe.
3. Use software comercial do filme de edição como Adobe Premiere para montar os quadros ainda em clipes de filme, e em seguida os clipes de filme dentro do filme final.
4. Nós começamos a adicionar uma faixa de áudio que narra o filme. A narração funciona como uma "lenda filme" e permite que a audiência se concentre sobre os dados que está sendo apresentado enquanto assistia ao filme.

XI. Animação

Visualnarrativa se comunica sem a necessidade de conhecimento do vocabulário complexo de domínios científicos específicos. Conceitos difíceis tornam-se simples quando acompanhadas por demonstração visual. A prática de ilustrar as idéias biológicas com cartoons não é nova. No entanto, apenas na última década tem as ferramentas sofisticadas de criação de conteúdo 3D profissional foi exercida sobre a tarefa de construir animações científicas. Existem hoje dezenas de pesquisadores ativamente traduzir em sistemas biológicos dinâmicos animações 3D. Muitas animações bonitas são exibidos em http://MolecularMovies.org . Esse site também hospeda tutoriais e distribui um kit de ferramentas livres para a manipulação de estruturas moleculares em Autodesk Maya. A suíte open source de conteúdo 3D, Blender, contém vários user-generated importadores PDB.

O processo de fazer uma animação 3D em geral, envolve três etapas:

1. Modelagem: Nós usamos softwares gráficos representação para exportar superfícies em formatos que podem ser importados para Maya. Estas superfícies são ou segmentações de tomogramas reconstruída, por exemplo, membranas, grânulos, ou filamentos, ou representações de superfícies molecular. Segmentações tomografia são realizados em Amira; superfícies molecular são gerados em Chimera ou VMD. Representações atômica de moléculas podem ser importados diretamente para Maya a partir de arquivos PDB. Uma vez que os modelos estão dentro de Maya, eles podem ser modificados, duplicado, e posicionados conforme o caso.
2. Animação: Animações são tradicionalmente construídas à mão, com o artista manualmente mudando objetos em movimento e gravação de uma série de quadros-chave. Novos avanços em softwares gráficos 3D permitem agora dinâmicas a serem geradas processualmente, via built-in módulos e APIs scripting.
3. Rendering: dinâmica processual pode fornecer animações convincente da dinâmica de processos biológicos, tais como auto-montagem estrutural. No entanto, devido à dificuldade de simular de forma realista os sistemas biológicos, a maioria das animações 3D ainda são construídos usando técnicas tradicionais quadro-chave. Uma vez que a dinâmica estão em ordem, anotações visuais, texturas e efeitos de iluminação podem ser acrescentados. Finalmente, o caminho da câmara é escolhido e completou a animação é renderizada em um filme.