Summary
后生因素可以与基因程序相互作用, 调节基因表达, 调节 B 细胞功能。结合体外b 细胞刺激、qRT PCR、高通量 rna 序列和 mRNA 序列方法, 可以分析 b 细胞中 miRNA 和基因表达的表观遗传调控。
Abstract
抗体应答是通过几个关键的 B 细胞内在的过程来完成的, 包括体细胞变异 (SHM), 类开关 DNA 重组 (CSR) 和血浆细胞分化。近年来, 表观遗传修饰或因素, 如组蛋白脱乙酰和 rna (rna), 已被证明与 B 细胞的遗传程序, 以形成抗体反应, 而表观遗传因素的功能障碍已发现导致自身抗体应答。分析 b 细胞的基因组全 miRNA 和 mRNA 表达对表观遗传调节因子的反应, 对于了解 b 细胞功能和抗体应答的表观遗传调节具有重要意义。在这里, 我们演示了一个协议诱导 b 细胞进行 CSR 和细胞分化, 治疗这些 b 细胞与组蛋白乙酰 (HDAC) 抑制剂 (助), 并分析 mRNA 和 rna 表达。在这个协议, 我们直接分析互补 DNA (cDNA) 序列使用下一代 mrna 测序 (mrna-seq) 和 miRNA 的技术, 测序读取的基因组, 和定量的反向转录 (qRT)-PCR。通过这些方法, 我们已经定义, 在 B 细胞中诱导的 csr 和细胞分化, 人类发展指数, 一个后生的调节器, 选择性地调节 miRNA 和 mRNA 表达, 改变 csr 和细胞分化。
Introduction
表观遗传标记或因素, 如 DNA 甲基化, 组蛋白后修饰, 编码 rna (包括 rna), 通过改变基因表达1调节细胞功能。表观遗传修饰调节 b 淋巴细胞功能, 如免疫球蛋白类-开关 DNA 重组 (CSR), 体细胞变异 (SHM), 并分化为记忆 b 细胞或血浆细胞, 从而调节抗体和自我抗体响应2,3。CSR 和 SHM 的关键要求激活诱导的胞脱氨酶 (援助, 编码为Aicda), 这是高度诱导 B 细胞响应 t 依赖性和 t 独立抗原4。类交换/hypermutated b 细胞进一步分化成血浆细胞, 其中分泌大量的抗体在时尚严重依赖于 B 淋巴细胞诱导成熟蛋白 1 (Blimp1, 编码为Prdm1)5。B 细胞异常的表观遗传变化可能导致异常的抗体/自身抗体应答, 这会导致过敏反应或自身免疫1,4。了解后生因素, 如 rna, 调节 B 细胞内在基因表达不仅对疫苗的发展很重要, 而且对于揭示潜在的异常抗体/自身免疫反应的机制也是必不可少的。
组蛋白乙酰化和脱乙酰度是由组蛋白乙酰 (HAT) 和组蛋白乙酰 (HDAC) 催化的蛋白组蛋白的赖氨酸残留修饰。这些修改导致染色质的增加或减少的可及性, 并进一步允许或阻止转录因子或蛋白质与 DNA 的结合和基因表达的改变5,6,7,8. HDAC 抑制剂 (HDI) 是一类干扰 HDACs 功能的化合物。在这里, 我们使用 HDI (VPA) 来解决 HDAC 对 B 细胞固有基因表达谱的调节及其机制。
rna 是小的, 编码 rna 大约18到22核苷酸长度是通过几个阶段产生的。miRNA 寄主基因转录和形成发夹主 rna (pri-rna)。它们被出口到细胞质中, 其中 rna 被进一步加工成前体 rna (pre-miRNAs)。最后, 成熟的 rna 是通过 pre-miRNAs 的裂解形成的。rna 识别在其目标基因的 3 "未翻译区域" 中的互补序列6,7。通过后沉默, rna 调节细胞活动, 如增殖, 分化, 和凋亡10,11。由于多个 rna 可以针对同一 mRNA, 而一个单一的 miRNA 可能针对多个基因, 因此重要的是要有一个上下文视图的 miRNA 表达式配置文件, 以了解个人的价值和 rna 的集体效应。rna 已被证明参与 b 细胞的发育和外周分化, 以及 b 细胞阶段特异性分化, 抗体应答, 和自身免疫1,4,9。在 3 "UTR Aicda和Prdm1中, 有几个经过验证或预测的进化保守站点, 可通过 rna8进行攻击。
后生调制, 包括组蛋白后修饰和 rna, 显示一个细胞类型和细胞阶段特异的基因表达调控模式9。在这里, 我们描述的方法, 以确定人的 HDI 介导的 miRNA 和 mRNA 表达, 社会责任, 和血浆细胞分化。其中包括诱导 B 细胞接受 CSR 和细胞分化的协议;用 HDI 治疗 B 细胞;并通过 qRT PCR、miRNA-seq 和 mrna-seq10、11、12、813来分析 miRNA 和 mrna 的表达。
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Protocol
该协议遵循圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物保育和使用委员会的动物保育准则.
1. 刺激企业社会责任、血浆细胞分化和 HDI 治疗的小鼠 B 细胞
- 脾细胞悬浮液的制备 注: 执行除鼠标外的层流罩中的所有步骤安乐死和解剖。
- 通过 CO 2 吸入安乐特定的无病原体 C57BL/6J 小鼠 (8-12 周龄)。
- 将鼠标放在解剖板上, 腹部朝上。用18口径1.5 英寸的皮下注射针头把所有四英尺的老鼠引脚.
- 用70% 乙醇浸泡过的湿巾对皮肤进行消毒.
- 使用一组蒸压的外科工具 (镊子和解剖剪刀) 切开胸腔下方的皮肤, 使脾脏可视化 (在腹部左侧, 就在肝脏下方).
- 使用另一种无菌钳和剪刀来提取脾脏, 它位于胃的更大的曲率之下, 通过用镊子钳夹脾并用解剖剪刀切断所有的连接组织。确保删除所有连接的组织.
- 将脾脏放入含有1000和 #181 的1.5 毫升离心管中; 完全 RPMI1640 培养基 (RPMI 1640 培养基补充10% 热灭活胎小牛血清 (FBS), 2 毫米 l-谷氨酰胺, 100 和 #181; g/毫升青霉素, 100 和 #181; g/毫升链霉素, 0.25 和 #181; g/毫升两性霉素 B, 和50和 #181; M 和 #946;-基).
- 将 70 #181; m 细胞过滤器放入一个50毫升的聚丙烯锥形离心管中, 然后将脾脏从离心管上倒入细胞滤网。使用15毫升聚丙烯锥形离心管的尖端, 通过过滤器轻轻地将脾脏捣碎。用15到20毫升的完全介质冲洗细胞过滤器.
- 向下旋转 350 x g 的单元格5分钟并丢弃上清.
- 取出脾脏细胞悬浮液中的红血球。重细胞颗粒在裂解缓冲液中 (每脾5毫升)。在室温下孵育4分钟, 偶尔摇动, 然后用25毫升完全培养基进行淬火.
- 将 350 x g 的单元格向下旋转5分钟, 然后丢弃上清。重1或10毫升的完整培养基中的细胞颗粒。使用例计数可用的单元格.
- b 单元格隔离
注意: 按照制造商和 #39 的指示, 按负选择隔离 B 单元格。非 b 细胞的目标是去除化抗体针对非 b 细胞 (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) 和 TER119) 和亲和涂层磁性粒子。- 准备0.25 和 #160; 在无菌8毫升 (5 x 12 mm) 聚苯乙烯圆底管的完整介质中, 1 x 10 75 细胞/毫升的2毫升细胞悬浮液。将正常大鼠血清 (50 和 #181; L/毫升) 添加到样品中.
- 添加50和 #181; 与样品的分离鸡尾酒。通过轻轻地移 上下 2-3 次并在室温下孵育10分钟, 将单元格混合在一起.
- 添加75和 #181; 将亲和的磁性微粒涂到样品中。混合的混合物, 轻轻移上下2-3 次和孵化2.5 分钟的室温.
- 添加完整的 RPMI 1640 介质。混合的细胞, 轻轻移上下 2-3 倍.
- 将管 (不带盖子) 放入磁体中, 在室温下孵育2.5 分钟. 将含有未接触 B 细胞的上清液倒入新的15毫升锥形管中.
- 使用例和台盼蓝染色对活细胞进行计数。通过流式细胞仪分析 b 细胞表面标记物, 如 B220 和 CD19, 评估 b 细胞的纯度.
- b 细胞刺激和 HDI 治疗
- 重完全 RPMI 1640 培养基中的纯化 b 细胞, 最终浓度为 0.3 x 10 6 细胞/毫升.
- 使用48孔细胞培养板进行细胞培养。对于每个井, 添加1毫升纯化 B 细胞悬浮液 (0.3 x 10 6 细胞/毫升), LPS (3 和 #181; g/毫升最终浓度) 从 大肠杆菌 , IL-4 (5 ng/毫升最终浓度), 和0或500和 #181; M HDI (戊酸;VPA).
- 孵育37和 #176 的细胞; C 和 5% CO 2 60 h 用于 qRT PCR 和高通量 mRNA 和 miRNA 序列分析, 或 96 h 用于流式细胞仪分析.
- 流式细胞仪分析 CSR 和等离子体细胞分化
- 在培养了96小时后, 通过多次移单元格, 将每一个井中的细胞分离出来。将细胞悬浮液转化为1.5 毫升的离心管。用台式离心机将电池在 350 x g 上旋转5分钟, 丢弃上清液.
- 重100和 #181 的单元格 (HBSS), 包含 1% BSA 和 0.5 ng/ml 荧光素 ( FITC )- 共轭山羊抗 - 小鼠 IgM 抗体 (Ab) , 0.2 ng/ml 复方 (APC)-共轭鼠 anti-mouse IgG1单克隆抗体, 0.2 ng/ml 藻 (PE)-共轭大鼠 anti-mouse B220 抗体, 0.2 ng/毫升 PE-Cy7-conjugated 鼠 anti-mouse CD138 抗体, 2 ng/ml 7-aminoactinomycin D (7-反倾销).
- 在室温下用荧光共轭抗体 (步骤 1.4.2) 孵育细胞30分钟.
- 用1毫升的 HBSS 和 1% BSA 冲洗细胞.
- 使用台式离心机向下旋转 1500 x g 的电池5分钟, 并丢弃上清液.
- 重300和 #181 中的细胞, HBSS 1% BSA, 将细胞悬浮液转移到圆底的聚苯乙烯管上。用箔盖住管子以避免光线照射.
- 对单细胞悬浮液进行流式细胞仪分析。为每个补偿样本收集5万事件和其他示例的25万事件。使用设备软件分析数据.
- 通过使用脉冲几何门 (fsc-h x fsc-a 和 ssc-h x ssc a) 消除碎片和双峰。适当的门 7-反倾销的阴谋, 以排除死细胞.
2。高通量的 mRNA-Seq
- 在60小时的区域性之后, 从 2-4 和 #215 中提取总 rna; 10 6 单元格使用总 rna 隔离套件, 它可以根据制造商和 #39 的指示恢复小 rna。包括一 dnasei I 治疗步骤.
- 根据制造商和 #39 的说明, 使用 bioanalyzer 验证 RNA 完整性.
- 使用500-1、000 ng 高质量的总 rna (rna 完整性数字和 #62; 8.0) 用于 rna 序列库的制备和商业 rna 样本 p代表工具包按照制造商和 #39 的说明操作.
- 根据各自的适配器的 6-bp 索引部分将单个 mRNA 序列库汇集在一起, 并按 50 bp/序列顺序排列库。根据制造商和 #39 的协议使用高通量的 DNA 系统.
- 顺序运行后, 解与 CASAVA 一起生成每个示例的 fastq 文件。执行读取映射和生物信息学分析, 如前面所概述的 11 .
- 使用 TopHat2 默认设置将所有顺序读取与其参考基因组 (UCSC 小鼠基因组构建 mm9) 对齐 14 。使用 HTSeq 来处理 bam 文件, 以获取所有样本中每一个基因的计数.
3。高通量 miRNA-seq
- 使用 100 ng-1 和 #181; 在步骤2.1 中编写的高质量总 rna g, 使用商业小 rna-seq 套件编写小的 rna 序列库.
- 结扎将退化的3和 #39; 适配器放到5和 #8242 上; 开始的小 RNA 分子的末端与商业结扎试剂盒。结扎退化的5和 #39; 适配器到3和 #8242; 开始的小 RNA 分子的末端与商业结扎试剂盒。通过反向转录将 rna 转化为 cDNA, 用商用试剂盒放大 PCR 扩增小 rna 序列库.
- 使用6% 本机页凝胶分离最后的小 RNA 序列库。运行的凝胶与1X 的缓冲区在200伏, 直到溴蓝色跟踪染料带接近底部的凝胶 (0.5-1 厘米).
- 从玻璃盘中取出凝胶, 然后用溴溴化物 (0.5 和 #181; 水中的 g/毫升) 在一个干净的容器中 2-3 min. 可视化 UV transilluminator 或其他凝胶文件仪器上的凝胶带.
- 用干净的剃刀把 150 bp 波段剪掉, 放到1.7 毫升的管子里.
- 根据制造商的说明使用凝胶萃取试剂盒提取 DNA.
- 检查最终库的大小分布, 并使用商用的超敏 DNA 检测方法, 并按照制造商和 #39 的商业 dsDNA 检测浓度进行检测; 说明.
- 将库用于放大, 然后根据制造商和 #39 的协议, 使用商业高通量 DNA 测序系统进行后续排序.
- 解与 CASAVA 一起为每个制造商和 #39 的协议生成每个示例的 fastq 文件.
- 对于每个样本的小 rna-seq 分析, 根据制造商和 #39 的协议使用闪烁进行小的 rna 对准。
- 删除与污染物 (如线粒体、rRNA、底漆等) 对齐的读取.
- 将数据与成熟的 miRNA 序列对齐.
- 将数据与发夹回路序列 (前体 miRNA) 对齐.
- 将数据与其他小 RNA 序列对齐 (使用 fRNA 数据库) 15 .
- 在对所有示例进行量化后, 定义不同组/示例之间的差异表达 rna。预测 rna 目标选择的基因或基因, 可以使用在线 miRNA 目标预测工具 (如 TargetScan 16 、微观世界 17 和 PicTar 18) 的选择性 miRNA 来瞄准。.
- 如果需要功能注释或路径分析, 请将预测的基因提交到独创性路径分析 (国际音标) 或 DAVID.
4。定量 rt-pcr (qRT pcr) 的基因和 rna
- qRT-pcr 分析 mRNA
- 从 0.2-5 和 #215 中提取 rna; 10 6 细胞使用商业总 rna 隔离套件, 可以恢复小 rna, 跟随制造商和 #39 的指示。包括一 dnasei I 治疗步骤.
- 用第一链 cdna 合成系统的全 RNA cdna, 利用寡糖-dT 引物.
- 采用 qRT pcr 方法, 利用 2x real-time pcr 方法, 用适当的引物对 cDNA 进行定量, 并与以下协议相结合:95、#176; c 为十五年代, 40 周期94和 #176; c 为十年代, 60 和 #176; c 为三十年代, 72 和 #176; c 为三十年代.
- 在72和 #176 期间执行数据获取; c 扩展步骤, 并执行从72到95和 #176 的熔融曲线分析; c.
- qRT miRNA
- 分 RNA 的 PCR 分析从步骤4.1.1 中准备的样本中提取.
- 反转-转录 RNA 为 cDNA。按照制造商和 #39 的说明使用商业 rna 反转录套.
- 使用 SYBR 绿色 real-time pcr 大师组合与 250 nM 成熟 miRNA 前向引物与通用反向底漆的 rna 进行 real-time pcr。
- 解冻 2x PCR 主混合、miRNA 特定的正向底漆和室温下的通用反向底漆。混合各个解决方案.
- 准备一个25和 #181 的反应组合; L 每好反应容量 (用于96井 PCR 板):
2x PCR 主混合12.5 和 #181; l
miRNA 前引物 (2.5 和 #956; m) 2.5 和 #181; l
通用反向底漆 (2.5 和 #956; m) 2.5 和 #181; l
RN无 water5 和 #181; l - 添加22.5 和 #956; l 的反应混合到一个96的 PCR 板。添加2.5 和 #181; L 模板 cDNA (50 pg-3 ng) 到各自的板材井.
- 紧紧地封住底片。离心板1分钟, 在 1000 x g 和室温.
- 将盘放在 real-time 循环中, 并启动以下循环程序:95、#176; c 为5分钟, 40 周期为94和 #176; c 为十五年代, 55 和 #176; c 为三十年代, 和72和 #176; c 为三十年代.
- 使用 and #916; #916; 用电子表格进行 qRT PCR 数据分析的 Ct 方法。将相关 rna 的表达规范化到小核/核仁 rna Rnu6/RNU61/2、Snord61/SNORD61、Snord68/SNORD68 和 Snord70/SNORD70 的表达.
- 统计分析
- 执行统计分析, 通过配对和未配对的学生和 #39 来确定 p 值 t 使用电子表格进行测试, 并考虑 p 值和 #60; 0.05 作为重要.
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Representative Results
使用我们的协议, 纯化 B 细胞放置 LPS (3 µg/毫升) 和 IL-4 (5 ng/毫升) 的96小时可以诱导30-40% 的 CSR 到 IgG1 和〜10% 的血浆细胞分化。在与 HDI (500µM VPA) 治疗后, 对 IgG1 的 CSR 降低到 10-20%, 而血浆细胞分化降低到 ~ 2% (图 1)。post-recombination Iμ-Cγ1和成熟的 VhDJh-Cγ1记录的数量的减少进一步证实了 HDI 对 csr 的抑制, 这是已完成的 csr 的标志。由 qRT-PCR 测量, Aicda的表达, 这是关键的 CSR/SHM, 和Prdm1和Xbp1, 这是重要的等离子体细胞分化, 被证明是由 VPA (图 2) 抑制。
在 B 细胞中, 人类发展指数对 mRNA 表达的调节是高度选择性的。由 LPS 和 IL-4 刺激的 b 细胞中的 mRNA-seq 测定, 只有0.3% 的这些高度表达基因上调的人的 hdi 超过两倍, 只有0.36% 的高度表达 (和 #62; 在 b 细胞没有 HDI 治疗的20拷贝/细胞) 基因, 包括Aicda、Prdm1和Xbp1,由 HDI 超过 50% (图 3) 减少。
Aicda、Prdm1和Xbp1表达式的下调可能由 rna 进行介导, 这是基因表达的负调节因子。通过使用 miRNA 目标预测工具 (TargetScan.org、miRNA.org 和 miRbase.org), 我们确定了可能针对rna或Aicda的多个 Prdm1。用 HDI 或零处理的 B 细胞 miRNA 剖面的 miRNA 分析表明, 助有选择地上调Aicda-和Prdm1-目标 rna (图 4-6)。
图 1.采用流式细胞仪对 B 细胞标记 B220 的表面表达、表面抗体 IgG1 和血浆细胞标记 CD138 进行了分析.
B220+ IgG1+单元格被转换为 IgG1 的 B 单元格。B220低CD138+单元格是等离子体细胞。在无或 HDI (VPA, 500 M) 为 96 h 的情况下, 以 LPS 和 IL-4 刺激的 b 细胞的 IgG1-switched b 细胞和血浆细胞的百分比表示为门内的数字。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。完成 CSR 的标志表达;成熟的 VhDJh-Cγ1抄本和 post-recombination Iμ-Cγ1抄本;Aicda、 Prdm1和Xbp1分别通过 qRT-PCR、归一化到Cd79b抄本进行了分析, 并显示在直方图中。
在500µM VPA 的存在下, 以 LPS 和 IL-4 刺激的 b 细胞中的基因表达, 与具有相同刺激的 b 细胞中的基因表达相关, 表现为1。数据是从三独立实验。p值, 配对t-测试。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。用 LPS 和 IL-4 刺激 B 细胞, 用 HDI (VPA, 500 µM) 或零进行治疗, 60 h. mrna 表达的 seq。
(A) 三独立实验中的平均 mRNA 表达水平 (每 kilobase 每百万映射读数, RPKMs) 在散布图中描述。每个图形对应一个单独的 mRNA 表达水平。两条虚线是两条折线。位于顶部虚线或底部虚线下方的散点图表示基因分别在 VPA 和零诱导下的两倍或少于一半。(b) 条形图描述了在 LPS 和 IL-4-stimulated b 细胞中处理的人的 HDI 的 mRNA 表达水平 (平均 RPKMs 从三独立实验) 的平均变化, 与 nil. 治疗的 b 细胞相比仅基因在平均 RPKM 和 #62; 20 在 LPS 和 IL-4-stimulated B 细胞处理以零被包括。在每一个单独的实验中, 如散射图 (C) 或条形图 (D) 所示, 其 mRNA 表达方式与 (a) 和 (B) 的描述相同。p值, 配对t-测试。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。用 LPS 和 IL-4 刺激 B 细胞, 用 HDI (VPA, 500 µM) 或零进行治疗, 60 h. miRNA 表达, miRNA-seq. 分析
(A) 用人的 HDI 处理的 b 细胞平均 miRNA 表达水平的变化与用零处理的 b 细胞相比, 用条形图描述。(b) 在三独立的实验中, 用人的 HDI 处理的 b 细胞 miRNA 表达水平的变化, 用条形图描述。仅 rna 平均转速和 #62; 0.5 在 LPS 和 IL-4-stimulated B 细胞处理以零被包括。请单击此处查看此图的较大版本.
图5。HDI 增加了Aicda-目标 rna 的表达式, 如 miRNA-seq. 所示
(A) 在Aicda基因的 3 "UTR 中, rna 及其目标站点的序列对齐方式。(b) b 细胞在人类发展指数 (VPA, 500 M) 的存在或缺失时, 用 LPS 和 IL-4 培养60小时。对目标为Aicda 3 "UTR 的 rna 的表达式进行了 miRNA 分析, 并将其描述为 RPM。p值, 配对t-测试。请单击此处查看此图的较大版本.
Prdm1 3 "UTR 被 miRNA-seq 分析, 并被描述为 RPM。p值, 配对t-测试。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议提供了诱导 B 细胞类交换和细胞分化的综合方法;分析其对表观遗传调节剂的影响, 即 HDI;并检测人的 HDI 对这些细胞的 mRNA 和 miRNA 表达的影响。大多数这些方法也可以用来分析表观遗传因子对人 B 细胞功能和 mRNA/miRNA 表达的影响。qRT PCR 和 mRNA-seq/miRNA 的方法也可以用来分析 B 细胞分离的小鼠与后生调节剂, 如助。
表观遗传调节可能影响细胞增殖和活力等多种不同的细胞功能, 从而影响社会责任和血浆细胞分化。因此, 应对 B 细胞的细胞增殖、生存能力和细胞周期进行分析。通过 qRT PCR 方法分析人类发展指数或其他表观遗传调控蛋白对 mRNA 和 miRNA 表达的调节, 其中的一个挑战是选择合适的管家基因或小 RNA。许多常见的持家基因可以改变到不同程度的表观遗传调节。应测定多种不同的持家基因的表达水平, 并用 qRT PCR 法对特定基因表达进行规范化。这个问题也可以通过 mrna-seq 和 miRNA-seq 来解决, 在这种情况下, 单个基因或 rna 的表达可以通过基因组范围的 mrna 或 miRNA 水平来正常化。
mrna-seq 不仅可以定义一个适当的生物信息学管道的 mrna 表达谱, 但这种方法也可以定义长编码 RNA (lncRNA) 剖面。mRNA-seq 通常涉及丰富的聚 (A) + rna 的寡糖 (dT) 选择。由于许多 lncRNA 是已知的缺乏聚 (a) 尾, mRNA-seq 的方法, 涉及寡核苷酸 (dT) 选择不能确定完整的信息 lncRNA 表达。为了实现对 mRNA 和 lncRNA 表达谱的完全覆盖, 应使用 RNA-seq 方法, 涉及 rRNA 损耗。在我们的大多数实验中, 我们使用一个商用试剂盒来提取总 RNA, 包括 miRNA, 用于 miRNA-seq, mRNA-seq, 和 qRT PCR。在构建高通量测序库之前, 通过在自动化的 rna、DNA 和蛋白质样品 QC 系统上运行分来验证总 rna 质量。如果要用于小 rna 库的制备, 建议 rna 样本的数量为7.0 或更高。在小 rna 种类 (15-30 核苷酸) 的大小范围内, 具有较低林数的样品的降解 rna 产品的百分比较高。当林号低于7.0 时, 覆盖范围就不会那么好了。对于不太理想的 RNA 样本, 另一种选择是执行 rRNA 损耗方法, 而不是 mRNA 隔离方法, 但这要求样品至少 10 ng/毫升。
在这里使用的 mRNA 序列的协议优化 100-1000 ng 总 RNA。对于使用少于 100 ng 总 rna 的 miRNA, 小 rna seq 文库的制备应遵循更灵敏的小 rna-seq 准备协议, 它利用了大多数已知 rna 分子的天然结构。大多数成熟的 rna 有一个5磷酸酯和一个3羟基的生物通路的结果。因此, 此套件中的 3 "和 5" 适配器直接与 rna 相连。
为了分析人类发展指数对 B 细胞 mRNA 和 miRNA 表达的影响在体内, 可以使用 VPA 或其他助治疗小鼠, 将这种 hdi 添加到饮用水中, 并通过 t 依赖性抗原 NP CGG 或 t 独立的小鼠腹腔注射。抗原 NP-LPS 可以执行。免疫后10天即可从脾脏中纯化 B 细胞。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作得到 NIH 资助 ai 105813 和 ai 079705 (对 pc), 狼疮研究的目标识别联盟狼疮补助金 ALR 295955 (对 pc), 和关节炎国家研究基金会研究补助金 (HZ)。TS 由中国长沙中南大学第二湘医院儿科医学中心支持, 湘医学院圣安东尼奥医科学生访问计划的背景。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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