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Immunology and Infection

वर्ग स्विच डीएनए पुनर्संयोजन और प्लाज्मा सेल भेदभाव से गुजरना करने के लिए प्रेरित बी कोशिकाओं में microRNAs और mRNAs की HDAC अवरोधक-मध्यस्थता मॉडुलन के जीनोम-वाइड विश्लेषण

Published: September 20, 2017 doi: 10.3791/55135
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,3, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio, 2Xiangya School of Medicine, Cental South University, 3Greehey Children’s Cancer Research Institute, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio

Summary

Epigenetic कारकों आनुवंशिक कार्यक्रमों के साथ बातचीत करने के लिए जीन अभिव्यक्ति मिलाना और बी सेल समारोह को विनियमित कर सकते हैं । इन विट्रो बी सेल उत्तेजना, qRT-पीसीआर, और उच्च प्रवाह microRNA-अनुक्रम और mRNA अनुक्रम दृष्टिकोण में संयोजन करके, हम बी कोशिकाओं में miRNA और जीन अभिव्यक्ति की epigenetic मॉडुलन का विश्लेषण कर सकते हैं ।

Abstract

एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं कई महत्वपूर्ण बी सेल के माध्यम से पूरा कर रहे हैं, दैहिक hypermutation सहित आंतरिक प्रक्रियाओं, (SHM), कक्षा स्विच डीएनए पुनर्संयोजन (सीएसआर), और प्लाज्मा सेल भेदभाव । हाल के वर्षों में, epigenetic संशोधनों या कारकों, जैसे citrullinated deacetylation और microRNAs (miRNAs), बी के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है-सेल आनुवंशिक कार्यक्रमों के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं आकार, जबकि epigenetic कारकों की शिथिलता के लिए नेतृत्व पाया गया है autoantibody प्रतिसाद. epigenetic मॉडुलन के जवाब में बी कोशिकाओं में जीनोम चौड़ा miRNA और mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण बी सेल समारोह और एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के epigenetic विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. यहां, हम बी कोशिकाओं उत्प्रेरण के लिए सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव से गुजरना के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन, citrullinated deacetylase (HDAC) अवरोधकों (HDIs) के साथ इन बी कोशिकाओं के इलाज, और mRNA और microRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल में, हम सीधे पूरक डीएनए (सीडीएनए) अगली पीढ़ी के mRNA अनुक्रमण (mRNA-seq) और miRNA-seq प्रौद्योगिकियों, अनुक्रमण का मानचित्रण का उपयोग कर अनुक्रम का विश्लेषण जीनोम के लिए पढ़ता है, और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन (qRT)-पीसीआर । इन तरीकों के साथ, हम परिभाषित किया है कि, बी कोशिकाओं में सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव, HDI, एक epigenetic नियामक से गुजरना करने के लिए प्रेरित, चुनिंदा miRNA और mRNA अभिव्यक्ति संग्राहक और सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव बदल जाता है ।

Introduction

Epigenetic मार्क्स या कारकों, जैसे डीएनए मिथाइल, citrullinated posttranslational संशोधनों के रूप में, और गैर कोडिंग RNAs (microRNAs सहित), जीन अभिव्यक्ति में फेरबदल करके सेल समारोह को मिलाना1। Epigenetic संशोधनों को विनियमित बी लिम्फोसाइट समारोह, जैसे immunoglobulin वर्ग स्विच डीएनए पुनर्संयोजन (सीएसआर), दैहिक hypermutation (SHM), और स्मृति बी कोशिकाओं या प्लाज्मा कोशिकाओं को भेदभाव, जिससे एंटीबॉडी और autoantibody संग्राहक प्रतिक्रियाएं2,3। सीएसआर और SHM गंभीर सक्रियण प्रेरित cytidine deaminase (सहायता, Aicdaके रूप में इनकोडिंग) है, जो उच्च बी कोशिकाओं में टी निर्भर और टी स्वतंत्र एंटीजन4के जवाब में प्रेरित है की आवश्यकता होती है । कक्षा बंद/hypermutated बी कोशिकाओं को आगे प्लाज्मा कोशिकाओं में अंतर है, जो एक फैशन में एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में स्रावित बी लिम्फोसाइट-प्रेरित परिपक्वता प्रोटीन 1 (Blimp1, के रूप में इनकोडिंग Prdm1)5पर निर्भर । बी कोशिकाओं में असामान्य epigenetic परिवर्तन ंयायपालिका एंटीबॉडी/autoantibody प्रतिक्रियाओं में परिणाम हो सकता है, जो एलर्जी प्रतिक्रिया या उन्मुक्ति1,4के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. समझ कैसे epigenetic कारकों, जैसे miRNAs, बी सेल मॉडुलन-आंतरिक जीन अभिव्यक्ति न केवल टीके के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी संभावित असामान्य एंटीबॉडी के तंत्र को प्रकट करने के लिए आवश्यक/autoantibody प्रतिक्रियाओं ।

citrullinated acetylation और deacetylation citrullinated catalyzed (HAT) और citrullinated acetyltransferase (citrullinated) द्वारा आम तौर पर deacetylase प्रोटीन पर lysine अवशेषों में संशोधन कर रहे हैं । ये संशोधन क्रोमेटिन की बढ़ती या घटते पहुंच के लिए नेतृत्व करते है और आगे की अनुमति या प्रतिलेखन कारकों या डीएनए को प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन5,6के बंधन को रोकने के, 7 , 8. HDAC अवरोधकों (HDI) यौगिकों के एक वर्ग है कि HDACs के समारोह में हस्तक्षेप कर रहे हैं । यहां, हम HDI (VPA) का इस्तेमाल किया बी कोशिकाओं के आंतरिक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पर HDAC के विनियमन और उसके तंत्र पर पता ।

miRNAs छोटे हैं, गैर कोडिंग RNAs लगभग 18 से 22 न्यूक्लियोटाइड लंबाई में है कि कई चरणों के माध्यम से उत्पंन कर रहे हैं । miRNA मेजबान जीन लिखित और कांटा प्राथमिक microRNAs (पंचायती राज-miRNAs) फार्म कर रहे हैं । वे कोशिका, जहां पंचायती राज-miRNAs आगे के अग्रदूत miRNAs (पूर्व miRNAs) में संसाधित कर रहे है निर्यात कर रहे हैं । अंत में, परिपक्व miRNAs पूर्व miRNAs के दरार के माध्यम से गठित कर रहे हैं । miRNAs अपने लक्ष्य mRNAs6,7के ' 3 unअनुवादित क्षेत्र के भीतर पूरक दृश्यों को पहचाना । पोस्ट-transcriptional मुंह के माध्यम से, miRNAs जैसे प्रसार, विभेदन, और apoptosis10,11के रूप में सेलुलर गतिविधि को विनियमित । के बाद से एकाधिक miRNAs एक ही mRNA लक्ष्य कर सकते हैं, और एक एकल miRNA संभावित एकाधिक mRNAs लक्ष्य कर सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के एक में संदर्भ को देखने के लिए व्यक्तिगत और miRNAs के सामूहिक प्रभाव के मूल्य को समझते हैं । miRNAs को बी सेल विकास और परिधीय भेदभाव, साथ ही साथ बी-सेल स्टेज-विशिष्ट भेदभाव, एंटीबॉडी प्रतिक्रिया, और उन्मुक्ति1,4,9में शामिल होने के लिए दिखाया गया है । Aicda और Prdm1के 3 ' UTR में, वहां रहे है कई मांय या भविष्यवाणी की evolutionarily साइटों है कि miRNAs8द्वारा लक्षित किया जा सकता है संरक्षित ।

Epigenetic मॉडुलन, citrullinated पद-प्रतिलेखन संशोधन और miRNAs सहित, एक सेल-प्रकार और सेल स्टेज-जीन अभिव्यक्ति9के विशिष्ट विनियमन पैटर्न प्रदर्शन. यहाँ, हम miRNA और mRNA अभिव्यक्ति, सीएसआर, और प्लाज्मा सेल भेदभाव के HDI मध्यस्थता मॉडुलन को परिभाषित करने के लिए तरीकों का वर्णन. ये सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव से गुजरना करने के लिए बी कोशिकाओं उत्प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल शामिल हैं; HDI के साथ बी कोशिकाओं के इलाज के लिए; और qRT द्वारा miRNA और mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए-पीसीआर, miRNA-seq, और mRNA-seq10,11,12,8,13।

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Protocol

< p class = "jove_content" > प्रोटोकॉल सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के पशु देखभाल दिशानिर्देश इस प्रकार है ।

< p class = "jove_title" > 1. सीएसआर के लिए माउस बी कोशिकाओं की उत्तेजना, प्लाज्मा सेल विभेद, और HDI उपचार

  1. तिल्ली सेल के निलंबन की तैयारी
    नोट: माउस के लिए छोड़कर एक लामिना प्रवाह हुड में सभी चरणों का प्रदर्शन इच्छामृत्यु और विच्छेदन ।
    1. Euthanize विशिष्ट रोगज़नक़-नि: शुल्क C57BL/6J माउस (उंर के 8-12 सप्ताह) द्वारा सह 2 सांस लेना ।
    2. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ पेट के साथ विदारक बोर्ड पर माउस रखना । माउस के सभी चार फुट के साथ 18 गेज, १.५-hypodermic सुई में पिन.
    3. ७०% इथेनॉल लथपथ पोंछे का उपयोग कर त्वचा निष्फल ।
    4. autoclaved शल्य चिकित्सा उपकरण (संदंश और विदारक कैंची) के एक सेट का उपयोग सिर्फ ribcage के नीचे त्वचा के माध्यम से कटौती करने के लिए तिल्ली कल्पना (पेट के बाईं ओर, बस जिगर के नीचे).
    5. तिल्ली को निकालने के लिए एक और बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग करें, जो पेट की अधिक से अधिक वक्रता के नीचे है, संदंश के साथ धीरे तिल्ली दबाना द्वारा और विदारक कैंची के साथ सभी को जोड़ने ऊतक काटने से. सभी जोड़ने ऊतक को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें.
    6. तिल्ली को १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में रखें जिसमें १,००० & #181; l पूरा RPMI1640 मध्यम (RPMI १६४० मध्यम 10% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (FBS), 2 मिमी L-glutamine, १०० & #181; g/ml पेनिसिलिन, १०० & #181; g/ml streptomycin, ०.२५ & #181; छ/मब amphotericin ज, व ५० & #181; M & #946;-mercaptoethanol).
    7. जगह एक ७०-& #181; m सेल छलनी में एक ५०-एमएल के के. ए. शंकु केंद्रापसारक ट्यूब और microcentrifuge ट्यूब से सेल छलनी पर तिल्ली डालना । धीरे छलनी के माध्यम से तिल्ली मैश करने के लिए एक 15 मिलीलीटर के शंकु केंद्रापसारक ट्यूब की नोक का प्रयोग करें । पूरा माध्यम के 15 से 20 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी कुल्ला ।
    8. 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और supernatant.
      9. त्यागें
    9. तिल्ली कोशिका निलंबन से लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दें । ले lysis बफर (तिल्ली प्रति 5 मिलीलीटर) में सेल गोली reसस्पेंड । सामयिक झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए मशीन और फिर पूरा मध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ बुझाना ।
    10. 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और supernatant त्यागें । 1 या पूर्ण माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । एक hemocytometer.
      11. का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती
  2. b-cell आइसोलेशन
    नोट: b कक्षों को ऋणात्मक चयन से अलग करें निंनलिखित निर्माता & #39; s निर्देश । गैर बी कोशिकाओं के खिलाफ गैर बी कोशिकाओं (सीडी, सीडी, CD11b, CD43, CD49b, सीडी 90.2, biotinylated-6C/जी (जीआर-1), और TER119) और streptavidin लेपित चुंबकीय कणों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ हटाने के लिए लक्षित कर रहे हैं ।
    1. तैयार एक ०.२५ & #160; करने के लिए 2 मिलीलीटर सेल निलंबन के 1 x 10 8 कोशिकाओं/एमएल में पूर्ण मध्यम में एक बाँझ 5 मिलीलीटर (12 x ७५ मिमी) polystyrene दौर-नीचे ट्यूब. नमूना के लिए सामान्य चूहा सीरम (५० & #181; L/mL) जोड़ें.
    2. Add ५० & #181; L/एमएल अलगाव कॉकटेल के नमूने के लिए । धीरे pipetting ऊपर और नीचे 2-3 बार और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी से कोशिकाओं को मिलाएं ।
    3. Add ७५ & #181; L/एमएल streptavidin-लेपित चुंबकीय कणों के नमूने के लिए । मिश्रण को धीरे से ऊपर और नीचे 2-3 बार pipetting और कमरे के तापमान पर २.५ मिनट के लिए गर्मी से मिक्स ।
    4. जोड पूर् RPMI १६४० मध्यम । कोशिकाओं को धीरे से ऊपर और नीचे 2-3 बार pipetting से मिलाएं ।
    5. जगह ट्यूब (ढक्कन के बिना) चुंबक में और २.५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अछूता बी कोशिकाओं से युक्त supernatant बंद डालो ।
    6. एक hemocytometer और Trypan नीले दाग का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती । बी सेल की सतह मार्करों के प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा बी कोशिकाओं की पवित्रता का आकलन, जैसे B220 और CD19.
  3. बी सेल उत्तेजना आणि HDI उपचार
    1. पूर्ण RPMI १६४० मध्यम में शुद्ध बी कोशिकाओं को फिर से स्थगित ०.३ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल.
      2. की एक अंतिम एकाग्रता में
    2. सेल संस्कृति के लिए एक ४८-well सेल कल्चर प्लेट का उपयोग करें । प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, शुद्ध बी सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें (०.३ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल), एलपीएस (3 & #181; जी/एमएल अंतिम एकाग्रता) से ई कोलाई , IL-4 (5 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता), और 0 या ५०० & #181; M HDI (वैल्पोरिक अम्ल; VPA).
    3. पर ३७ & #176; ग और 5% कं 2 के लिए ६० ज के लिए qRT-पीसीआर और उच्च प्रवाह mRNA-और miRNA अनुक्रमण विश्लेषण, या ९६ के लिए एच cytometry विश्लेषण ।
  4. प्रवाह cytometry सीएसआर और प्लाज्मा सेल विभेद
    1. के विश्लेषण संस्कृति के ९६ ज के बाद, कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग और नीचे कई बार । एक १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए ३५० x g पर कोशिकाओं के नीचे स्पिन एक बेंच-टॉप केंद्रापसारक का उपयोग कर और supernatant.
      2. त्यागें
    2. १०० & #181 के साथ कोशिकाओं को पुनर्स्थगित; HBSS बफर की एल युक्त 1% BSA और ०.५ एनजी/एमएल fluorescein ( FITC )- संयुग्मित बकरी विरोधी - माउस आईजीएम एंटीबॉडी (Ab) , ०.२ एनजी/एमएल allophycocyanin (APC)-संयुग्मित चूहा विरोधी माउस IgG1 मोनोक्लोनल Ab (मॉब), ०.२ एनजी/एमएल phycoerythrin (पीई)-संयुग्मित रैट एंटी-माउस B220 मॉब, ०.२ एनजी/एमएल पे-Cy7-संयुग्मित रैट एंटी-माउस CD138 मॉब, और 2 एनजी/एमएल 7-aminoactinomycin डी (7-AAD).
    3. प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं-संयुग्मित एंटीबॉडी (कदम 1.4.2) 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में
    4. 1% BSA के साथ HBSS की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    5. 5 मिनट के लिए १,५०० x g पर कोशिकाओं के नीचे स्पिन एक benchtop केंद्रापसारक का उपयोग कर और supernatant.
      6. त्यागें
    6. ३०० में कोशिकाओं reसस्पेंड & #181; 1% BSA के साथ HBSS के एल और एक गोल नीचे polystyrene ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण. प्रकाश जोखिम से बचने के लिए पंनी के साथ ट्यूब कवर ।
    7. एक एकल सेल निलंबन पर प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं । प्रत्येक मुआवजा नमूना और अंय नमूनों के लिए २५०,००० घटनाओं के लिए ५०,००० घटनाओं लीजिए । विश्लेषण उपकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा.
    8. एक पल्स ज्यामिति गेट (FSC-एच एक्स FSC-ए और एसएससी-एच एक्स एसएससी-ए) का उपयोग करके मलबे और दोहरी को खत्म । उचित 7 पर भूखंड गेट-AAD मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 2. उच्च-प्रवाह mRNA-Seq

  1. संस्कृति के ६० ज के बाद, कुल आरएनए से निकालें 2-4 & #215; 10 6 एक कुल आरएनए अलगाव किट है कि छोटे शाही सेना के निर्माता & #39 के बाद ठीक कर सकते है का उपयोग कर कोशिकाओं; एस निर्देश । एक DNase मैं उपचार कदम शामिल हैं ।
  2. एक विश्लेषक का उपयोग कर आरएनए अखंडता सत्यापित करें, निर्माता & #39; s निर्देश का पालन.
  3. का उपयोग 500-1000 उच्च गुणवत्ता कुल आरएनए के एनजी (आरएनए अखंडता संख्या रिण & #62; ८.०) एक वाणिज्यिक आरएनए नमूना पी के साथ आरएनए-seq पुस्तकालय तैयारी के लिएप्रतिनिधि किट निंनलिखित निर्माता & #39; s निद.
  4. पूल व्यक्तिगत mRNA-seq उनके संबंधित 6-बीपी सूचकांक एडेप्टर के भाग के आधार पर पुस्तकालयों और अनुक्रम ५० bp/अनुक्रम में पुस्तकालयों । निर्माता के अनुसार एक उच्च प्रवाह डीएनए प्रणाली का प्रयोग करें & #39; s चलत.
  5. sequencing चलाने के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए fastq फ़ाइल जनरेट करने के लिए चसव के साथ मल्टीप्लेक्स । प्रदर्शन पढ़ता मैपिंग और bioinformatics विश्लेषण, के रूप में पहले रेखांकित < सुप वर्ग = "xref" > 11 .
  6. संरेखित करें सभी अनुक्रमण उनके संदर्भ जीनोम के साथ पढ़ता है (UCSC माउस जीनोम बिल्ड mm9) TopHat2 डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग < सुप वर्ग = "xref" > १४ . प्रक्रिया HTSeq-count का उपयोग कर संरेखण से bam फ़ाइलों सभी नमूनों में जीन प्रति गणना प्राप्त करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 3. उच्च-प्रवाह miRNA-Seq

  1. उपयोग १०० एनजी-1 & #181; उच्च गुणवत्ता कुल आरएनए के जी, के रूप में चरण २.१ में तैयार, एक वाणिज्यिक लघु आरएनए-Seq किट का उपयोग करके छोटे आरएनए-Seq पुस्तकालय तैयारी के लिए.
  2. Ligate को पतित 3 & #39; एडाप्टर 5 & #8242 पर; एक वाणिज्यिक बंधाव किट के साथ शुरू छोटे आरएनए अणुओं के समाप्त होता है । Ligate 5 & #39; अनुकूलक 3 & #8242 पर; एक वाणिज्यिक बंधाव किट के साथ शुरू छोटे आरएनए अणुओं के समाप्त होता है । आरएनए को रिवर्स टेप द्वारा सीडीएनए में परिवर्तित करें और वाणिज्यिक किटों के साथ पीसीआर प्रवर्धन द्वारा लघु आरएनए-seq लाइब्रेरी को बढ़ाना.
  3. एक 6% TBE देशी पृष्ठ जेल का उपयोग करने के लिए अंतिम छोटी आरएनए-seq पुस्तकालय को अलग । २०० वी पर 1x TBE बफर के साथ जेल भागो bromophenol ब्लू ट्रैकिंग डाई बैंड के पास जेल (०.५-1 सेमी) के नीचे के पास ।
  4. ग्लास प्लेट्स और ethidium ब्रोमाइड (०.५ & #181; जी/पानी में एमएल) के साथ दाग से जेल निकालें 2-3 मिनट के लिए एक साफ कंटेनर में एक यूवी transilluminator या एक और जेल प्रलेखन साधन पर जेल बैंड कल्पना ।
  5. बाहर कट ~ १५०-बीपी बैंड एक साफ रेजर का उपयोग कर और यह एक १.७ मिलीलीटर ट्यूब में जगह है ।
  6. एक जेल निष्कर्षण किट प्रति निर्माता निर्देश का उपयोग डीएनए निकालें ।
  7. एक वाणिज्यिक उच्च संवेदनशीलता डीएनए परख और निर्माताओं के प्रति एक वाणिज्यिक dsDNA परख के साथ एकाग्रता के साथ अंतिम पुस्तकालय के आकार के वितरण की जांच करें & #39; निर्देश.
  8. पूल प्रवर्धन के लिए पुस्तकालयों और एक बाद sequencing निर्माता के प्रति एक वाणिज्यिक उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण प्रणाली के साथ चलाने & #39; s चलत.
  9. division के साथ चसव के लिए fastq फाइल जनरेट करने के लिए प्रत् येक नमूना प्रति निर्माता & #39; s चलत.
    10. प्रत्येक नमूने के छोटे आरएनए-seq विश्लेषण के लिए
  10. निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल प्रति छोटे आरएनए संरेखण के लिए फ़्लिक का उपयोग करें ।
    1. निकालें पढ़ता है कि दूषित पदार्थों, जैसे mitochondria, rRNA, प्राइमरों, और इसी तरह के लिए गठबंधन कर रहे हैं ।
    2. डेटा को परिपक्व miRNA अनुक्रम में संरेखित करें.
    3. डेटा कांटा लूप अनुक्रम (प्रणेता miRNA) के लिए संरेखित करें ।
    4. अन्य छोटी आरएनए अनुक्रम (fRNA डेटाबेस का उपयोग करके) डेटा संरेखित करें < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
  11. के बाद सभी नमूनों मात्रा रहे हैं, अलग समूहों के बीच miRNAs व्यक्त अंतर को परिभाषित/ miRNAs का पूर्वानुमान करें कि चयनित mRNAs या mRNAs को लक्षित किया जा सकता है जिसे ऑनलाइन miRNA लक्ष्य पूर्वानुमान उपकरणों का उपयोग करके किसी चुनिंदा miRNA द्वारा टार्गेट कर सकते हैं, जैसे TargetScan < सुप वर्ग = "xref" > 16 , सूक्ष्म < सुप class = "xref" > 17 , और PicTar < सुप class = "xref" > 18 .
  12. यदि कार्यात्मक एनोटेशन या मार्ग विश्लेषण की जरूरत है, सरलता मार्ग विश्लेषण (आइपीए) या दाऊद को भविष्यवाणी की जीन प्रस्तुत ।
< p class = "jove_title" > 4. मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (qRT-पीसीआर) की mRNAs और miRNAs

  1. qRT-पीसीआर का विश्लेषण mRNA
    1. से निकालें आरएनए 0.2-5 & #215; 10 6 कोशिकाओं है कि छोटे शाही सेना की वसूली कर सकते हैं एक वाणिज्यिक कुल आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग कर, निम्नलिखित निर्माता & #39; s निद. एक DNase मैं उपचार कदम शामिल हैं ।
    2. संश्लेषित oligo-डीटी प्राइमर का उपयोग कर एक पहली किनारा सीडीएनए संश्लेषण प्रणाली के साथ कुल आरएनए से सीडीएनए.
      3. उचित प्राइमरों के साथ qRT-पीसीआर द्वारा
    3. यों सीडीएनए, निम्नलिखित प्रोटोकॉल के साथ 2x वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिश्रण का उपयोग करना: ९५ & #176; ग के लिए 15 एस, ४० चक्र के ९४ & #176; ग के लिए 10 एस, ६० & #176; ग के लिए 30 एस, और ७२ & #176; ग के लिए 30 एस.
    4. ७२ & #176 के दौरान डाटा अर्जन करते हैं; सी विस्तार कदम और प्रदर्शन पिघलने वक्र विश्लेषण से ७२ ९५ & #176; c.
  2. qRT-पीसीआर का विश्लेषण miRNA
    1. Aliquot चरण शुू में तैयार नमूनों से आरएनए.
    2. रिवर्स-सीडीएनए में आरएनए टाइप । एक वाणिज्यिक microRNA रिवर्स प्रतिलेखन किट का प्रयोग करें, निर्माता & #39; s निर्देश का पालन.
    3. एक सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमर के साथ संयोजन के रूप में २५० एनएम परिपक्व miRNA आगे प्राइमरों के साथ एक SYBR हरी वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिश्रण का उपयोग कर microRNA के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन ।
      1. गल 2x पीसीआर मास्टर मिक्स, miRNA-विशिष्ट फॉरवर्ड प्राइमर, और यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर कमरे के तापमान पर । व्यक्तिगत समाधान मिश्रण ।
      2. एक 25 & #181 के लिए निम्नानुसार एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार; एल प्रति अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मात्रा (९६-well पीसीआर प्लेट में इस्तेमाल किया):
        2x पीसीआर मास्टर मिक्स १२.५ & #181; l
        miRNA फॉरवर्ड प्राइमर्स (२.५ & #956; M) २.५ & #181; l
        यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर (२.५ & #956; M) २.५ & #181; l
        आरएन नि: water5 & #181; l
      3. Add २२.५ & #956; l रिएक्शन मिक्स टू ए ९६-वेल पीसीआर प्लेट. Add २.५ & #181; L of टें पलेट सीडीएनए (५० pg-3 एनजी) को वैयक्तिक प्लेट वेल्स.
      4. कसकर प्लेट फिल्म सील । १,००० x जी और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक ।
      5. वास्तविक समय साइकिल चालक में थाली जगह और निंनलिखित साइकिल चालन कार्यक्रम शुरू: ९५ & #176; ग के लिए 5 मिनट, ४० चक्र के ९४ & #176; ग के लिए 15 एस, ५५ & #176; ग के लिए 30 s, और ७२ & #176; ग के लिए 30 एस.
    4. उपयोग क & #916; & #916; सीटी विधि एक स्प्रेडशीट के साथ qRT-पीसीआर डेटा विश्लेषण के लिए । लघु परमाणु की अभिव्यक्ति के लिए प्रासंगिक miRNAs की अभिव्यक्ति को सामान्य/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/Snord61, Snord68/Snord68, और Snord70/Snord70.
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. p मानों का निर्धारण करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण निष्पादित करना युग्मित और ख़राब छात्र & #39; s t- एक स्प्रेडशीट का उपयोग कर परीक्षण और विचार p मान & #60; ०.०५ के रूप में भरपुर.

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Representative Results

हमारे प्रोटोकॉल का प्रयोग, शुद्ध बी एलपीएस के साथ रखा कोशिकाओं (3 µ जी/एमएल) और IL-4 (5 एनजी/एमएल) ९६ के लिए IgG1 और ~ प्लाज्मा सेल भेदभाव के 10% के लिए सीएसआर के 30-40% प्रेरित कर सकते हैं । HDI के साथ उपचार के बाद (५०० µ m VPA), IgG1 करने के लिए सीएसआर 10-20% की कमी आई, जबकि प्लाज्मा सेल भेदभाव ~ 2% (चित्रा 1)में कमी आई. HDI-सीएसआर के मध्यस्थता निषेध पोस्ट-पुनर्संयोजन Iμ-Cγ1 और परिपक्व वीएचडीजेएचCγ1 टेप, जो पूरा सीएसआर की पहचान कर रहे हैं की कमी हुई संख्या से आगे की पुष्टि की थी. के रूप में qRT-पीसीआर द्वारा मापा, Aicda की अभिव्यक्ति है, जो सीएसआर के लिए महत्वपूर्ण है/SHM, और Prdm1 और Xbp1, जो प्लाज्मा सेल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं, VPA द्वारा बाधित किया जा दिखाया गया (चित्रा 2) ।

बी कोशिकाओं में HDI द्वारा mRNA अभिव्यक्ति का मॉडुलन अत्यधिक चयनात्मक था. के रूप में mRNA द्वारा मापा-बी कोशिकाओं में seq एलपीएस और आईएल-4 के साथ उत्तेजित, इन अत्यधिक व्यक्त mRNAs के केवल ०.३% से अधिक दो गुना HDI द्वारा विनियमित थे, और अत्यधिक व्यक्त की केवल ०.३६% (& #62; HDI उपचार के बिना बी कोशिकाओं में 20 प्रतियां/mRNAs, सहित Aicda, Prdm1, और Xbp1, HDI से अधिक ५०% (चित्रा 3) से कम थे ।

Aicda, Prdm1, और Xbp1 अभिव्यक्ति की downregulation संभवतः miRNAs द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है, जो जीन अभिव्यक्ति के नकारात्मक नियामक हैं. miRNA लक्ष्यीकरण पूर्वानुमान उपकरण (TargetScan.org, miRNA.org, और miRbase.org) का उपयोग करके, हमने एकाधिक miRNAs की पहचान की है जो संभावित रूप से Aicda या Prdm1को लक्षित कर सकते हैं । बी HDI या शूंय के साथ इलाज किया कोशिकाओं में miRNA profiling के miRNA-seq विश्लेषण से पता चला कि HDIs चुनिंदा Aicda और Prdm1लक्ष्यीकरण miRNAs (आंकड़े 4-6) ।

Figure 1
चित्र 1. बी की सतह अभिव्यक्ति-सेल मार्कर B220, सतह एंटीबॉडी IgG1, और प्लाज्मा-सेल मार्कर CD138 प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया ।
B220+ IgG1+ कोशिकाओं को IgG1 के लिए स्विच बी कोशिकाओं थे । B220कमCD138+ कोशिकाओं प्लाज्मा कोशिकाओं थे । बी कोशिकाओं से IgG1-स्विच बी कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओं का प्रतिशत शून्य या HDI (VPA, ५०० मीटर) की उपस्थिति में एलपीएस और IL-4 के साथ प्रेरित करने के लिए ९६ h के लिए गेट्स के भीतर की संख्या के रूप में संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. पूर्ण सीएसआर की पहचान की अभिव्यक्ति; परिपक्व वीएचडीजेएचCγ1 टेप और पोस्ट-पुनर्संयोजन Iμ-Cγ1 टेप; और Aicda, Prdm1, और Xbp1 qRT-पीसीआर, Cd79b टेप को सामान्यीकृत द्वारा विश्लेषण किया गया, और एक हिस्टोग्राम में दिखाया गया है ।
बी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति की उपस्थिति में एलपीएस और IL-4 के साथ उत्तेजित ५०० µ m VPA और बी कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रासंगिक की उपस्थिति में ही उत्तेजनाओं के साथ 1 के रूप में चित्रित किया गया । आंकडे तीन स्वतंत्र प्रयोगों से हैं. p मान, युग्मित t-परीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. बी कोशिकाओं एलपीएस और IL-4 के साथ उत्तेजित और HDI के साथ इलाज किया गया (VPA, ५०० µ मीटर) या शूंय के लिए ६० h. mRNA अभिव्यक्ति mRNA-seq द्वारा विश्लेषण किया गया था ।
(क) तीन स्वतंत्र प्रयोगों में औसत mRNA अभिव्यक्ति का स्तर (प्रति kilobase प्रति लाख पढ़ता है, प्रकीर्णन पुस्तकें, RPKMs) तितर-बितर भूखंडों में दर्शाए गए थे. प्रत्येक भूखंड एक व्यक्ति mRNA अभिव्यक्ति स्तर से मेल खाती है । दो डैश्ड लाइनें दो गुना लाइनें हैं । तितर बितर भूखंड ऊपर डैश्ड रेखा के ऊपर या नीचे डैश्ड रेखा से नीचे स्थित mRNAs कि एक्सप्रेस से अधिक दो बार या कम से आधे जब VPA और शूंय, क्रमशः द्वारा प्रेरित । (ख) बार रेखांकन mRNA अभिव्यक्ति के स्तर में औसत परिवर्तन (तीन स्वतंत्र प्रयोगों से औसत RPKMs) में चित्रित एलपीएस और IL-4 में HDI के साथ इलाज किया बी कोशिकाओं को उत्तेजित, के रूप में बी कोशिकाओं में उन की तुलना में शूंय के साथ इलाज किया । केवल mRNAs पर औसतन RPKM & #62; एलपीएस में 20 और IL-4-उत्तेजित बी कोशिकाओं को शूंय के साथ इलाज में शामिल हैं । प्रत्येक व्यक्तिगत प्रयोग में mRNA अभिव्यक्ति, जैसा कि एक कैटरिंग प्लाट (C) या बार ग्राफ (D) द्वारा दिखाया गया है, उसी तरह से (a) और (B) में दर्शाया गया है । p मान, युग्मित t-परीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. बी कोशिकाओं एलपीएस और IL-4 के साथ उत्तेजित और HDI के साथ इलाज किया गया (VPA, ५०० µ मीटर) या शूंय के लिए ६० h. miRNA अभिव्यक्ति miRNA-seq द्वारा विश्लेषण किया गया था ।
(क) बी कोशिकाओं में औसत miRNA अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन की तुलना में HDI के साथ इलाज के रूप में है कि बी कोशिकाओं में शूंय के साथ इलाज किया गया बार रेखांकन से दर्शाया गया है । (ख) बी कोशिकाओं में miRNA अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन HDI के साथ इलाज के रूप में है कि बी कोशिकाओं में तीन स्वतंत्र प्रयोगों में शूंय के साथ इलाज की तुलना में बार रेखांकन द्वारा चित्रित किया गया । केवल औसत आरपीएम & #62 पर miRNAs; ०.५ में एलपीएस और IL-4-उत्तेजित बी कोशिकाओं शूंय के साथ इलाज में शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. HDI Aicda-लक्ष्यीकरण miRNAs की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जैसा कि miRNA-seq द्वारा दिखाया गया है.
(क) miRNAs के अनुक्रम संरेखण और 3 ' UTR में उनके लक्षित साइटों के Aicda mRNAs । (ख) बी कोशिकाओं ६० एच के लिए HDI (VPA, ५०० मीटर) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एलपीएस और आईएल-4 के साथ संस्कृति थे । miRNAs की अभिव्यक्ति के लिए लक्ष्य की भविष्यवाणी की गई थी कि Aicda 3 ' UTR miRNA द्वारा विश्लेषण किया गया-seq और RPM के रूप में चित्रित । p मान, युग्मित t-परीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure alt=
चित्रा 6. HDI Prdm1-लक्ष्यीकरण miRNAs की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जैसा कि miRNA-seq द्वारा दिखाया गया है.
(क) miRNAs के अनुक्रम संरेखण और 3 ' UTR में उनके लक्षित साइटों के Prdm1 mRNAs । (ख) बी कोशिकाओं एलपीएस और IL-4 की उपस्थिति या HDI की अनुपस्थिति में (VPA, ५०० मीटर) के साथ संस्कृति थे ६० एच miRNAs है कि लक्ष्य के लिए भविष्यवाणी की गई थी की अभिव्यक्ति के लिए Prdm1 3 ' UTR द्वारा विश्लेषण किया गया miRNA-seq और RPM के रूप में चित्रित । p मान, युग्मित t-परीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल बी सेल वर्ग स्विचन और प्लाज्मा सेल भेदभाव प्रेरित करने के लिए व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है; epigenetic मॉडुलन, अर्थात् HDI द्वारा उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए; और इन कोशिकाओं में mRNA और miRNA अभिव्यक्ति पर HDI के प्रभाव का पता लगाने के लिए । इन तरीकों से अधिकांश भी मानव बी सेल समारोह और mRNA/miRNA अभिव्यक्ति पर epigenetic कारक के प्रभाव का विश्लेषण किया जा सकता है । qRT-पीसीआर और mRNA-seq/miRNA-seq दृष्टिकोण भी बी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चूहों से अलग epigenetic के रूप में HDIs मॉडुलन, इलाज.

epigenetic मॉडुलन ऐसे सेल प्रसार और व्यवहार्यता, जो सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव को प्रभावित कर सकता है के रूप में कई अलग सेल कार्यों, प्रभाव हो सकता है । इसलिए, कोशिका प्रसार, व्यवहार्यता, और HDI उपचार के साथ या बिना बी कोशिकाओं के कोशिका चक्र, विश्लेषण किया जाना चाहिए । qRT द्वारा HDI या अन्य epigenetic नियामकों द्वारा mRNA और miRNA अभिव्यक्ति के मॉडुलन का विश्लेषण करने के लिए चुनौतियों में से एक-पीसीआर एक उपयुक्त गृह व्यवस्था जीन या छोटे शाही सेना का चयन है. कई आम गृह व्यवस्था जीन epigenetic ढा द्वारा डिग्री अलग करने के लिए बदला जा सकता है । कई अलग गृह व्यवस्था जीन की अभिव्यक्ति का स्तर मापा जाना चाहिए और qRT-पीसीआर द्वारा विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया । इस मुद्दे को mRNA-seq और miRNA-seq द्वारा भी संबोधित किया जा सकता है, जहाँ व्यक्तिगत mRNAs या miRNAs की अभिव्यक्ति को जीनोम-वाइड mRNA या miRNA स्तरों से सामान्य किया जा सकता है.

mRNA-seq केवल एक उपयुक्त bioinformatics पाइपलाइन के साथ mRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को परिभाषित नहीं कर सकते हैं, लेकिन इस दृष्टिकोण भी लंबी कोडिंग आरएनए (lncRNA) प्रोफ़ाइल को परिभाषित कर सकते हैं । mRNA-seq आम तौर पर oligo (डीटी) चयन द्वारा पाली (ए) + RNAs के संवर्धन शामिल है । lncRNA की संख्या के रूप में पाली (क) मासा कमी करने के लिए जाना जाता है, mRNA-seq oligo (डीटी) चयन शामिल दृष्टिकोण lncRNA अभिव्यक्ति की पूरी जानकारी निर्धारित नहीं कर सकते । दोनों mRNA और lncRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल की पूरी कवरेज प्राप्त करने के क्रम में, एक आरएनए-seq rRNA कमी को शामिल दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । हमारे अधिकांश प्रयोगों में, हम कुल आरएनए को निकालने के लिए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करते हैं, जिसमें miRNA, miRNA-seq, mRNA-seq, और qRT-पीसीआर शामिल हैं । एक उच्च-प्रवाह sequencing लायब्रेरी का निर्माण करने से पहले, कुल आरएनए गुणवत्ता एक स्वचालित आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन नमूना QC सिस्टम पर एक aliquot चलाकर मान्य है । यह सिफारिश की है कि आरएनए नमूने ७.० या उच्चतर की एक रिण संख्या है अगर वे छोटे आरएनए पुस्तकालय तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं. कम रिण संख्या के साथ नमूनों छोटी आरएनए प्रजातियों (15-30 न्यूक्लियोटाइड) के आकार रेंज में नीचा आरएनए उत्पादों की एक उच्च प्रतिशत है । जब रिण संख्या ७.० से नीचे है, कवरेज के रूप में अच्छा नहीं होगा । कम से आदर्श आरएनए के नमूनों के लिए एक और विकल्प एक mRNA अलगाव दृष्टिकोण के बजाय एक rRNA कमी दृष्टिकोण प्रदर्शन करने के लिए है, लेकिन इस नमूने कम 10 एनजी/

mRNA-seq के लिए प्रोटोकॉल यहां इस्तेमाल किया १००-१,००० कुल आरएनए के एनजी के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । कुल आरएनए के १०० से कम एनजी का उपयोग कर miRNA-seq के लिए, छोटे आरएनए-seq पुस्तकालय तैयारी एक और अधिक संवेदनशील लघु आरएनए-seq तैयारी प्रोटोकॉल का पालन करना चाहिए, जो सबसे ज्ञात microRNA अणुओं के लिए आम प्राकृतिक संरचना का लाभ लेता है. सबसे परिपक्व miRNAs है एक 5 '-फॉस्फेट और एक 3 '-हाइड्रॉक्सिल समूह उनके उत्पत्ति मार्ग का एक परिणाम के रूप में । इस वजह से, इस किट में 3 ' और 5 ' एडेप्टर सीधे miRNAs करने के लिए ligated हैं ।

वीवो मेंबी-सेल mRNA और miRNA एक्सप्रेशन पर HDI के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए चूहों को पीने के पानी में इस HDIs को जोड़कर VPA या अन्य HDI से उपचारित किया जा सकता है और टी-निर्भर प्रतिजन एनपी-intraperitoneal या टी-इंडिपेंडेंट के साथ इन चूहों का CGG इंजेक्शन antigen NP-एलपीएस किया जा सकता है । प्रतिरक्षण के 10 दिनों के बाद तिल्ली से बी कोशिकाओं को शुद्ध किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान एअर इंडिया १०५८१३ और ऐ ०७९७०५ (पीसी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था, एक प्रकार का वृक्ष अनुदान ALR २९५९५५ (पीसी के लिए) में एक प्रकार का वृक्ष अनुसंधान लक्ष्य पहचान के लिए एलायंस, और गठिया राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान (हर्ट्ज के लिए) । टीएस बाल रोग चिकित्सा केंद्र, दूसरा Xiangya अस्पताल, मध्य दक्षिण विश्वविद्यालय, चांगशा, चीन द्वारा समर्थित किया गया था Xiangya के संदर्भ में-यूटी स्कूल ऑफ मेडिसिन सैन एंटोनियो मेडिकल छात्र कार्यक्रम का दौरा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific - Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२७ बी सेल कक्षा-स्विच डीएनए पुनर्संयोजन फ्लो cytometry citrullinated deacetylase (HDAC) अवरोधकों (HDIs) mRNA microRNA mRNA-seq miRNA-seq प्लाज्मा सेल विभेद
वर्ग स्विच डीएनए पुनर्संयोजन और प्लाज्मा सेल भेदभाव से गुजरना करने के लिए प्रेरित बी कोशिकाओं में microRNAs और mRNAs की HDAC अवरोधक-मध्यस्थता मॉडुलन के जीनोम-वाइड विश्लेषण
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Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

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