Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

Published: September 20, 2017 doi: 10.3791/55135
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,3, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio, 2Xiangya School of Medicine, Cental South University, 3Greehey Children’s Cancer Research Institute, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio

Summary

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

Abstract

תגובות נוגדנים מוכשרות דרך מספר תהליכי תא B קריטי-מהותי, לרבות היפרמוטציה (SHM), מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) התמיינות תאים פלזמה. בשנים האחרונות שינויים epigenetic או גורמים, כגון היסטון deacetylation מיקרו Rna (miRNAs), הוכחו אינטראקציה עם תוכניות גנטי B-cell לעיצוב תגובות נוגדנים, בעוד כבר מצאו את תפקוד של גורמים epigenetic להוביל נוגדן עצמי תגובות. ניתוח miRNA הגנום כולו והביטוי mRNA בתאים B בתגובה מאפננים epigenetic חשוב להבנת epigenetic ויסות התגובה נוגדן והפונקציה B-cell. . הנה, נדגים פרוטוקול גרימת B תאים לעבור התמיינות CSR ותא פלזמה, מתייחס האלו תאי B עם מעכבי היסטון deacetylase (HDAC) (HDIs), וניתוח mRNA microRNA הבעה. ב פרוטוקול זה, ננתח ישירות רצפי DNA (cDNA) משלימים באמצעות הדור הבא רצפי mRNA (mRNA-seq) וטכנולוגיות miRNA seq, מיפוי של הרצף מקריאה הגנום, ואת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית)-PCR. עם הגישות הללו הגדרנו, בתאי B המושרה לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות, HDI, הרגולטור epigenetic, באופן סלקטיבי ממיקרו miRNA והביטוי mRNA ומשנה בידול CSR ותא פלזמה.

Introduction

סימני epigenetic או גורמים, כגון מתילציה DNA, שינויים posttranslational היסטון אי קידוד RNAs (כולל מיקרו Rna), לווסת את תפקוד התא על ידי שינוי בביטוי גנים1. שינויים epigenetic לווסת את פונקציית B לימפוציטים, כגון אימונוגלובולינים מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) היפרמוטציה (SHM), התמיינות תאי זיכרון B או תאים פלזמה, ובכך להתכוונן נוגדן של נוגדן עצמי תגובות2,3. CSR SHM אנושות דורשים הפעלה-induced cytidine deaminase (סיוע, המקודדים כ- Aicda), אשר הוא מאוד המושרה בתאי B בתגובה תלויי-T ו- T-עצמאית אנטיגנים4. בתאי B class-החלפת/hypermutated נוספות להבדיל לתאי פלזמה, אשר מפרישים כמויות גדולות של נוגדנים אופנה אנושות תלויה ההבשלה לימפוציטים B-induced חלבון (Blimp1, בקידוד Prdm1) 15. שינויים epigenetic נורמלי בתאי B עלול לגרום תגובות נוגדנים סוטה/נוגדן עצמי, אשר יכול להוביל תגובה אלרגית או מחלת חיסון עצמי1,4. הבנת epigenetic כמה גורמים, כגון miRNAs, לווסת תא B-מהותי ביטוי גנים הוא לא רק חשוב להתפתחות חיסון, אך היא חיונית כדי לחשוף את המנגנון של תגובות נוגדנים חריג/נוגדן עצמי פוטנציאליים.

היסטון acetylation deacetylation שינויים של משקעי ליזין על חלבוני היסטון מזורז בדרך כלל על ידי היסטון acetyltransferase (כובע) היסטון deacetylase (HDAC) בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. לבצע שינויים אלה להוביל הנגישות עולה או יורדת של כרומטין, עוד יותר לאפשר או למנוע את הכריכה של גורמי שעתוק או חלבונים ל- DNA ואת משינוי של ג'ין ביטוי5,6, 7 , 8. מעכבי HDAC (HDI) הם קבוצה של תרכובות להפריע הפונקציה של HDACs. כאן השתמשנו HDI (VPA) לכתובת ברגולציה של HDAC על הפרופיל ביטוי גנים פנימיים של תאים B ועל מנגנון שלה.

miRNAs הם קטנים, ללא קידוד RNAs כ 18 עד 22 נוקלאוטידים אורך הנוצרות דרך מספר שלבים. miRNA מארח את הגנים הם עיבד ויוצרים מיקרו Rna ראשוני סיכת ראש (pri-miRNAs). והם מיוצאים אל הציטופלסמה, איפה pri-miRNAs הם עיבוד נוסף לתוך קודמן miRNAs (pre-miRNAs). לבסוף, בוגרת miRNAs נוצרות דרך החריץ של טרום-miRNAs. miRNAs לזהות את רצפי משלימה באזור 3' לא מתורגם של6,mRNAs7שלהם היעד. דרך להשתיק post-transcriptional, miRNAs לווסת את פעילות הסלולר, כגון התפשטות, התמיינות אפופטוזיס10,11. כיוון miRNAs מרובים ניתן לייעד את ה-mRNA זהה, miRNA יחיד אחד ניתן לייעד באופן פוטנציאלי mRNAs מרובים, חשוב לקבל תצוגה לפי הקשר של פרופיל ביטוי miRNA כדי להבין את הערך של הפרט ואת השפעת miRNAs קולקטיבית. miRNAs הוכחו להיות מעורב B-cell פיתוח, בידול היקפיים, כמו גם בידול ספציפיות שלב B-cell נוגדנים בתגובה, מחלת חיסון עצמי1,4,9. 3' UTR של Aicda , Prdm1, ישנם מספר מאומתים או החזוי אבולוציונית שנשמרת אתרי ניתן לפלח מאת miRNAs8.

אפנון epigenetic, לרבות שינוי היסטון שעתוק שלאחר miRNAs, להציג דפוס ספציפיות שלב התקנה מסוג תא ותא של ביטוי גנים9. כאן, אנו מתארים שיטות כדי להגדיר את אפנון בתיווך HDI של miRNA ואת הביטוי mRNA, CSR, ו פלזמה תאית התמיינות. אלה כוללים את הפרוטוקולים עבור גרימת B תאים לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות; לטיפול תאי B עם HDI; עבור ניתוח miRNA והביטוי mRNA מאת לרביעיית-PCR miRNA-seq, mRNA-seq10,11,12,8,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים והטיפול שימוש ועדות של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז סן אנטוניו.

1. גירוי של העכבר בתאי B CSR, פלזמה תאית התמיינות של טיפול HDI

  1. הכנה של הטחול תא המתלים
    הערה: לבצע את כל השלבים ב תא למינארי מלבד העכבר המתת חסד, לנתיחה.
    1. Euthanize ספציפי פתוגן ללא C57BL/6J העכבר (מגיל 8-12 שבועות) באמצעות אינהלציה 2 CO.
    2. שכב בעכבר בלוח ויבתר הבטן פונה כלפי מעלה. להצמיד כל מטר של העכבר עם מזרקים. אל תדאגי, 1.5 - ב.
    3. לחטא את העור באמצעות מגבונים לחים ספוג אתנול 70%-
    4. השתמש ערכה אחת של כלי ניתוח בלוק (מלקחיים ומספריים ויבתר) כדי לחתוך העור מתחת קשת הצלעות להמחיש את הטחול (בצד שמאל של הבטן, ממש מתחת הכבד).
    5. להשתמש מלקחיים סטרילי אחר ומספריים מספריים כדי לחלץ את הטחול, הנמצא מתחת שכדור גדול של הקיבה, על-ידי מחבר חובק למעקה הטחול בעדינות עם מלקחיים, כורתים את כל רקמת חיבור עם לנתח. הקפד להסיר את כל רקמת חיבור-
    6. מקום הטחול לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge המכיל 1,000 µL בינוני RPMI1640 מלאה (RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% לא פעיל חום העובר עגל סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין, פניצילין µg/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין, µg 0.25 mL/המפוטריצין ו- 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol).
    7. מניחים מסננת תא 70-מיקרומטר שפופרת צנטרפוגה חרוט פוליפרופילן 50-mL ויוצקים הטחול מהצינור microcentrifuge על גבי מסננת התא. להשתמש מועכים בעדינות הטחול דרך מסננת קצה צינור פוליפרופילן צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל. לשטוף את התא מסננת 15-20 מ של מדיום מלאה.
    8. ספין למטה התאים ב- 350 גרם x 5 דקות, להשליך תגובת שיקוע.
    9. להסיר כדוריות דם אדומות של המתלים תא הטחול. Resuspend בגדר תא במאגר פירוק ACK (5 מ"ל לכל הטחול). תקופת דגירה של 4 דקות בטמפרטורת החדר ברעידות ומדי פעם, ואז להרוות 25 מ של מדיום מלאה.
    10. ספין למטה את התאים ב- 350 גרם x עבור 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא ב- 1 או 10 מ"ל של מדיום מלאה. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer.
  2. B-cell בידוד
    הערה: B לבודד תאים לפי בחירה שלילי בעקבות היצרן ' s הוראות. Non-B תאים המיועדים להסרת עם biotinylated נוגדנים נגד תאי-B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) ו- TER119) ואת מצופים streptavidin חלקיקים מגנטיים. צינור עגול-התחתון
    1. הכן השעיה תא 0.25 ל 2 מ"ל של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ל מלאה במדיום פוליסטירן סטרילי 5 מ ל (12 x 75 מ מ). להוסיף סרום עכברים רגילה (50 µL/mL) הדגימה.
    2. בידוד µL/mL להוסיף 50 בקוקטייל המדגם. לערבב את התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה, למטה 2 - 3 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
    3. להוסיף µL/mL 75 מצופים streptavidin חלקיקים מגנטיים המדגם. לערבב את התערובת על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים דגירה 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. להוסיף בינוני RPMI 1640 מלאה. לערבב את התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.
    5. למקם את הצינור (ללא המכסה) לתוך המגנט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2.5 מינימלית לשפוך את תגובת שיקוע המכיל תאי B לא נגעה לתוך צינור חרוטי 15-mL-
    6. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer הכתם Trypan Blue. להעריך את הטוהר של תאי B על ידי ניתוח cytometry זרימה של סמנים משטח B-cell, כגון B220 ו- CD19.
  3. B-cell גירוי וטיפול HDI
    1. Resuspend בתאי B מטוהרים בינוני מלא RPMI 1640-ריכוז סופי של 0.3 x 10 6 תאים למ"ל.
    2. השתמש צלחת התרבות 48-ובכן תא תרבית תאים. כל טוב, הוסיפו 1 מ"ל של B-cell מטוהרים ההשעיה (0.3 x 10 6 תאים למ"ל), LPS (ריכוז סופי µg 3/mL) מ- Escherichia coli, IL-4 (ריכוז סופי 5 ng/mL), ו- 0 או 500 מיקרומטר HDI (חומצה ולפרואית; VPA).
    3. דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עבור 60 h לרביעיית-PCR וניתוח תפוקה גבוהה mRNA - ו miRNA-רצף, או h 96 לניתוח cytometry זרימה.
  4. Flow cytometry ניתוח של CSR ו פלזמה תאית התמיינות
    1. לאחר h 96 של תרבות, לנתק את התאים מכל קידוח מאת pipetting התאים למעלה ולמטה מספר פעמים. העברת התליה תא לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge. ספין למטה התאים ב- 350 גרם x עבור 5 דקות באמצעות צנטריפוגה ספסל-העליון ולמחוק את תגובת שיקוע.
    2. Resuspend התאים עם 100 µL HBSS מאגר המכיל 1% BSA ו- 0.5 ng/mL fluorescein (FITC) - מצומדת עז אנטי-נוגדן IgM העכבר – (אלב) , 0.2 ננוגרם למ"ל allophycocyanin (APC)-העכבר אנטי חולדה מצומדת IgG1 monoclonal Ab (mAb), 0.2 ננוגרם למ"ל phycoerythrin (PE)-מצומדת עכבר עכבר אנטי B220 mAb 0.2 ננוגרם למ"ל עכברוש PE-Cy7-מצומדת העכבר אנטי CD138 mAb, 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-מ)-
    3. דגירה התאים עם פלורסצנטיות מצומדת נוגדנים (שלב 1.4.2) בחושך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות
    4. לרחוץ את התאים עם 1 מ"ל של HBSS עם 1% BSA.
    5. ספין למטה התאים ב g x 1,500 למשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה benchtop להשליך תגובת שיקוע.
    6. Resuspend תאי µL 300 של HBSS עם 1% BSA ולהעביר התליה תא ל צינור עגול-התחתון פוליסטירן. לכסות את הצינור עם נייר כסף כדי למנוע חשיפה קלה.
    7. ניתוח cytometry זרימה בצע על השעיה תא בודד. איסוף אירועים 50,000 עבור כל דגימה פיצוי ואירועים 250,000 על הדגימות אחרים. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנות ציוד.
    8. לשלול את הלכלוך ואת doublets באמצעות שער הגיאומטריה הדופק (FSC-H-FSC-A והאס-H x האס-A). בהתאם שער העלילה על 7-מ כדי לא לכלול תאים מתים.

2. תפוקה גבוהה mRNA-Seq

  1. לאחר 60 h של תרבות, לחלץ את הרנ א סה כ 2-4 × 10 6 תאים באמצעות ערכת בידוד RNA הכולל לשחזור RNA קטנים בעקבות היצרן ' s הוראות. כוללים DNase אני שלב הטיפול.
  2. לוודא את תקינות RNA באמצעות של bioanalyzer, בעקבות היצרן ' הוראות s.
  3. השתמש 500-1, 000 ng של RNA סך באיכות גבוהה (RNA תקינות מספר רין > 8.0) עבור ה-RNA-seq הכנה ספריה RNA מסחריים מדגם pערכת נציג בעקבות היצרן ' הוראות s.
  4. מאגר של ספריות ה-mRNA בודדות-seq בהתבסס על שלהם בהתאמה מדד 6-bp חלקים המתאמים, רצף של הספריות ב- bp 50/רצף. להשתמש במערכת ה-DNA תפוקה גבוהה על פי היצרן ' פרוטוקולים s.
  5. לאחר רצף לברוח, demultiplex עם CASAVA כדי ליצור את קובץ fastq עבור כל דגימה. לבצע קריאות מיפוי וניתוח ביואינפורמטיקה, כמו המתוארים להלן 11.
  6. יישר כל קריאות רצף עם הפניה הגנום שלהם (UCSC העכבר הגנום לבנות mm9) באמצעות הגדרות ברירת המחדל TopHat2 14. לעבד את הקבצים באם יישור באמצעות HTSeq-count כדי להשיג את ספירת לכל הגנים בדגימות כל.

3. תפוקה גבוהה miRNA-Seq

  1. µg ng-1 השתמש 100 של RNA סך באיכות גבוהה, כפי המבושלות צעד 2.1, להכנה ספריית ה-RNA-seq קטן באמצעות ערכת ה-RNA-seq מסחרי קטן.
  2. Ligate 3 מנוונת ' מתאם אל 5 ′ הקצוות של ההתחלה מולקולות RNA קטנים עם ערכת מצדו מסחרי. מאתרים ומפסיקים את 5 מנוונת ' מתאם על גבי 3 ′ הקצוות של ההתחלה מולקולות RNA קטנים עם ערכת מצדו מסחרי. להמיר את הרנ א cDNA על-ידי שעתוק במהופך ומגבירים את ספריית ה-RNA-seq קטן על ידי הגברה PCR עם ערכות מסחריות.
  3. השתמש TBE 6% ילידי ג'ל דף כדי לבודד את ספריית ה-RNA-seq קטן הסופי. להפעיל את הג'ל עם מאגר X TBE 1 ב- 200 וולט עד הלהקה bromophenol כחול מעקב לצבוע סיומו התחתון של הג'ל (0.5 - 1 ס מ)-
  4. להסיר את הג'ל הזכוכיות, כתם עם אתידיום ברומיד (0.5 µg/mL במים) במיכל נקי עבור 2-3 דקות הג'ל להקות transilluminator UV או כלי אחר של תיעוד ג'ל Visualize.
  5. לחתוך החוצה את הלהקה ~ 150-bp באמצעות סכין גילוח נקי ולמקם אותו לתוך צינור 1.7 mL-
  6. לחלץ את הדנ א באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפי הוראות יצרן.
  7. לבדוק את התפלגות גודל הספרייה הסופי עם assay DNA מסחרי רגישות גבוהה וריכוז עם וזמינותו המסחרית dsDNA לכל היצרנים ' הוראות.
  8. מאגר של הספריות עבור הגברה ורצף עוקבות לרוץ עם מערכת רצף ה-DNA תפוקה גבוהה מסחרי לכל היצרן ' פרוטוקולים s.
  9. Demultiplex עם CASAVA כדי ליצור את קובץ fastq עבור כל דגימה לפי היצרן ' פרוטוקולים s.
  10. לניתוח קטן RNA-seq של כל דגימה, להשתמש הבהוב ליישור RNA קטנים לכל היצרן ' s פרוטוקולים.
    1. להסיר קריאות כי מיושרים מזהמים, כמו המיטוכונדריה, rRNA, תחל וכן הלאה.
    2. ליישר את הנתונים להבשיל רצפים miRNA.
    3. ליישר את הנתונים כדי סיכת ראש לולאה רצפים (קודמן miRNA).
    4. יישור נתונים אחרים רצפים (באמצעות מסד הנתונים fRNA) קטן RNA 15.
  11. אחרי כל דוגמאות הן לכמת, להגדיר את miRNAs ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות שונות/דוגמאות. לחזות miRNAs המספקים לקהלי היעד הנבחר mRNAs או mRNAs זה ניתן לפלח מאת miRNA סלקטיבית באמצעות כלים חיזוי מקוון miRNA היעד, כגון TargetScan 16, מיקרוקוסמוס 17 PicTar 18 .
  12. אם אנליזה פונקציונלית ביאור או מסלול יש צורך, להגיש את הגנים החזוי תחכום מסלול לניתוח (IPA) או דוד.

4. כמותיים RT-PCR (לרביעיית-PCR) של mRNAs ושל miRNAs

  1. ניתוח לרביעיית-PCR של mRNA
    1. RNA לחלץ מ 0.2-5 × 10 תאים 6 שימוש מסחרי הכולל RNA בידוד ערכה לשחזור RNA קטנים, בעקבות יצרן ' s הוראות. כוללים DNase אני שלב הטיפול.
    2. לסנתז cDNA של RNA הכולל עם מערכת סינתזה הראשון-strand cDNA באמצעות פריימר oligo-dT-
    3. לכמת cDNA מאת לרביעיית-PCR עם תחל המתאים באמצעות 2 x מיקס מאסטר בזמן אמת של PCR עם פרוטוקול הבאים: 95 ° C 15 s, 40 מחזורי 94 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 ס
    4. לבצע רכישת נתונים במהלך השלב סיומת 72 ° C ולבצע ניתוח עקומת ההיתוך מ- 72 עד 95 מעלות צלזיוס
  2. ניתוח לרביעיית-PCR של miRNA
    1. Aliquot RNA מדגימות מוכן בשלב 4.1.1.
    2. הפוכה-לתמלל הרנ א לתוך cDNA. להשתמש ערכת שעתוק במהופך microRNA מסחרי, בעקבות היצרן ' הוראות s.
    3. לבצע PCR בזמן אמת עבור microRNA באמצעות שילוב SYBR Green מאסטר PCR בזמן אמת עם 250 ננומטר miRNA בוגרת קדימה תחל בשיתוף עם פריימר הפוכה אוניברסלי. פריימר
      1. הפשרה 2 x מיקס מאסטר PCR miRNA ספציפיים פריימר לפנים, לאחור אוניברסלי בטמפרטורת החדר. לערבב את הפתרונות בודדים.
      2. להכין תערובת התגובה כדלקמן עבור אמצעי אחסון 25 תגובה µL-לכל-ובכן (בשימוש 96-ובכן PCR צלחות):
        2 x 12.5 מיקס מאסטר PCR µL
        miRNA קדימה תחל (2.5 μM) 2.5 µL
        יוניברסל הפוך פריימר (2.5 μM) 2.5 µL
        RN ללא ase water5 µL
      3. 22.5 להוסיף μL של התגובה שילוב צלחת PCR 96-ובכן. להוסיף 2.5 µL של תבנית cDNA (ng pg-3 50) הבארות צלחת בודדים.
      4. חותם בחוזקה את הצלחת הסרט. Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 1,000 x g וטמפרטורת החדר.
      5. למקם את הצלחת הצנטרפוגה בזמן אמת, הפעלת התוכנית אופניים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 40 מחזורי 94 ° C 15 s, 55 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 ס
    4. להשתמש בשיטת ΔΔCt לניתוח נתונים לרביעיית-PCR עם גיליון אלקטרוני. לנרמל את הביטוי של miRNAs רלוונטי ביטוי קטן גרעיני/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 ו- Snord70/SNORD70.
  3. ניתוח סטטיסטי
    1. לבצע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע הערכים p על ידי לזווג אינטראקצית סטודנט ' s t - לבדוק בעזרת גיליון אלקטרוני, שקול ערכים p < 0.05 כמו משמעותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול שלנו לטהר בתאי B להניח LPS (3 µg/mL) ו- IL-4 (5 ng/mL) עבור 96 h יכול לגרום 30-40% CSR כדי IgG1 ו ~ 10% של התמיינות תאים פלזמה. לאחר טיפול עם HDI (500µM VPA), נציג שירות הלקוחות כדי IgG1 ירד ל 10-20%, בעוד התמיינות תאים פלזמה ירד ל ~ 2% (איור 1). בתיווך HDI עיכוב של CSR אושר עוד יותר ע י מספרי ירידה של פוסט-רקומבינציה Iμ-Cγ1 ו- V בוגרHDJH-Cγ1 תעתיקים, אשר הם גולת הכותרת של CSR שהושלמו. כפי שהיא נמדדת לרביעיית-PCR, הביטוי של Aicda, אשר הוא קריטי עבור נציג שירות הלקוחות/SHM, ו Prdm1 ו Xbp1, אשר חשובים עבור פלזמה תאית התמיינות, הוכחו להיות מעוכבים על ידי VPA (איור 2).

אפנון mRNA הביטוי על-ידי HDI בתאי B היה סלקטיבי מאוד. כפי שהיא נמדדת mRNA-seq בתאי B, מגורה עם LPS ו- IL-4, רק 0.3% של אלה mRNAs ביטוי מאוד היו upregulated על ידי HDI יותר כפולה ו 0.36% בלבד של ביטוי מאוד (> 20 עותקים התא בתאי B ללא טיפול HDI) mRNAs, כולל Aicda, Prdm1, Xbp1, היו מופחת על ידי HDI יותר מ- 50% (איור 3).

Downregulation של Aicda, Prdm1ו Xbp1 ביטוי יכול באופן פוטנציאלי בתיווכו miRNAs, אשר הם שליליים הרגולטורים של ביטוי גנים. על ידי שימוש miRNA מיקוד כלי חיזוי (TargetScan.org, miRNA.org ו miRbase.org), זיהינו miRNAs מרובים שיכולות היעד שעשויות להיות Aicda או Prdm1. ניתוח miRNA-seq miRNA פרופיל בתאי B שטופלו HDI או אפס הראה כי HDIs באופן סלקטיבי upregulate Aicda - ו Prdm1 -מיקוד miRNAs (איורים 4-6).

Figure 1
איור 1. ביטוי פני השטח של תאי B סמן B220, משטח נוגדן IgG1 תאים פלזמה סמן CD138 נותחו על ידי cytometry זרימה.
B220+ IgG1+ היו תאים בתאי B החליפו IgG1. B220נמוךCD138+ היו תאים תאים פלזמה. אחוז תאים ממותגים IgG1 B ותאי פלזמה מתאי B, מגורה LPS ו- IL-4 בנוכחות אפס או HDI (VPA, 500 מ') עבור 96 h מסומנים כמו המספרים בתוך השערים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. ביטוי של המחפשים CSR הושלמה; בוגר V-H-DJ-H-Cγ1 תמלילים וגיליון הציונים פוסט-רקומבינציה Iμ-Cγ1; Aicda, Prdm1ו Xbp1 היו נותחו על ידי לרביעיית-PCR מנורמל ל Cd79b תעתיקים, שמוצג בהיסטוגרמה.
ביטוי גנים בתאי B, מגורה עם LPS ו- IL-4 בנוכחות 500 מיקרומטר VPA ורלוונטי בביטוי הגן ב B תאים עם הגירויים באותה בנוכחות אפס מתוארים כבעלי 1. הנתונים הם 3 ניסויים עצמאית. ערכי p , tמזווג-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. בתאי B היו מגורה עם LPS ו- IL-4 ו שטופלו HDI (VPA, 500 מיקרומטר) או אפס עבור 60 ה mRNA ביטוי נותחה על ידי ה-mRNA-תת סעיף.
(א) ממוצע רמות הביטוי mRNA בניסויים עצמאית שלוש (קורא לכל kilobase לכל מיליון קריאות ממופה, RPKMs) מתוארים בפיזור החלקות. כל מגרש מקביל ברמת הביטוי mRNA בודדות אחת. שני קווים מקווקווים הם קווים כפולה. פיזור החלקות ממוקם מעל קו מקווקו העליון או מתחת לתחתית קו מקווקו לציין mRNAs לבטא יותר מפעמיים או פחות מחצי כאשר שנגזרות VPA, אפס, בהתאמה. (ב) מגרפים מתארים את השינוי הממוצע ב- mRNA רמות הביטוי (ממוצע RPKMs מ 3 ניסויים עצמאית) LPS ו B IL-4-גירוי תאים שטופלו HDI, לעומת הילדים בתאי B שטופלו אפס. רק mRNAs-RPKM הממוצע > 20 ב- LPS ו- IL-4-גירוי B תאים שטופלו אפס נכללים. הביטוי mRNA ניסוי בודדים, כפי שמוצג על ידי פיזור מגרש (C) או גרף עמודות (D), מתוארים באותה דרך כמו ב (א) ו (ב). ערכי p , tמזווג-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. בתאי B היו מגורה עם LPS ו- IL-4 ו שטופלו HDI (VPA, 500 מיקרומטר) או אפס עבור ה 60 miRNA ביטוי נותחה על ידי miRNA-תת סעיף.
(א) שינוי רמות הביטוי miRNA הממוצע בתאי B שטופלו HDI בהשוואה בתאי B מטופלים עם אפס מתוארים על ידי תרשימי עמודות הפוכות. (B) שינוי רמות הביטוי miRNA B תאים שטופלו HDI בהשוואה בתאי B מטופלים עם אפס בתוך 3 עצמאית ניסויים מתוארים על ידי תרשימי עמודות הפוכות. רק miRNAs במהירות ממוצעת של סל ד > 0.5 LPS ו B IL-4-גירוי תאים שטופלו אפס נכללים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. HDI מגביר את הביטוי של Aicda -מיקוד miRNAs, כפי שהראה miRNA-תת סעיף.
(א) עימוד רצפים את miRNAs ואתרים היעד שלהם ב 3' UTR של Aicda mRNAs. (ב) B תאים היו תרבותי עם LPS ו- IL-4 ב נוכחות או היעדרות של HDI (VPA, 500 מ') עבור 60 h. הביטוי של miRNAs זה כהכרחיים היעד Aicda 3' UTR נותחו על ידי miRNA-seq, ו"כדור סל ד. ערכי p , tמזווג-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure alt=
איור 6. HDI מגביר את הביטוי של Prdm1 -מיקוד miRNAs, כפי שהראה miRNA-תת סעיף.
(א) עימוד רצפים את miRNAs ואתרים היעד שלהם ב 3' UTR של Prdm1 mRNAs. (ב) B תאים היו תרבותי עם LPS ו- IL-4 ב נוכחות או היעדרות של HDI (VPA, 500 מ') עבור ה 60 ביטוי miRNAs זה כהכרחיים למטרה Prdm1 3' UTR היו נותחו על ידי miRNA-seq, ו"כדור סל ד. ערכי p , tמזווג-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מספק גישות מקיף לזירוז תא B class מיתוג ובידול תאים פלזמה; כדי לנתח את השפעתם על ידי epigenetic מאפננים, כלומר HDI; כדי לזהות את ההשפעה של HDI על mRNA והביטוי miRNA בתאים אלה. רוב הגישות הללו יכולים לשמש גם כדי לנתח את השפעת גורם epigenetic על הביטוי mRNA/miRNA והפונקציה B-cell האנושי. לרביעיית-PCR וגישות mRNA-seq/miRNA-seq יכול לשמש גם כדי לנתח בתאי B מבודד עכברים שטופלו epigenetic מאפננים, כגון HDIs.

לווסת epigenetic עשוי להשפיע תא אחר פונקציות רבות כגון התפשטות תאים ואת הכדאיות, אשר יכול להשפיע על בידול CSR ותא פלזמה. לכן, התפשטות תאים הכדאיות, את מחזורי תאים של תאי B, עם או בלי טיפול HDI, צריך להיות מנותח. אחד האתגרים לניתוח של האפנון של mRNA והביטוי miRNA על ידי HDI או אחרים הרגולטורים epigenetic מאת לרביעיית-PCR היא בחירת של משק בית מתאים ג'ין או RNA קטנים. גנים רבים משק בית משותף יכול להשתנות בדרגות מאת מאפננים epigenetic. רמות הביטוי של גנים שונים משק רבים צריך להיות נמדד והמשמש לנרמל את הביטוי של גנים ספציפיים לרביעיית-PCR. בעיה זו ניתן להתייחס גם על ידי ה-mRNA-seq miRNA-seq, שבו הביטוי של mRNAs בודדים או miRNAs יכול להיות מנורמל לפי רמות ה-mRNA או miRNA הגנום כולו.

mRNA-seq לא להגדיר ביטוי mRNA הפרופיל עם צינור ביואינפורמטיקה המתאים, אך גישה זו ניתן גם להגדיר את הפרופיל RNA (lncRNA) זמן noncoding. mRNA-seq כוללת בדרך כלל את העשרת של poly(A) + RNAs לפי בחירה oligo(dT). כמו מספר lncRNA ידועים חוסר poly(A) זנבות, הגישה mRNA-seq מעורבים הבחירה oligo (dT) אין אפשרות לקבוע את המידע המלא lncRNA הביטוי. על מנת להשיג כיסוי מלא של ה-mRNA והן lncRNA פרופילי ביטוי, גישה RNA-seq מעורבים rRNA דלדול אמור לשמש. ברוב הניסויים שלנו, אנו משתמשים ערכת מסחרית כדי לחלץ את הרנ א הכולל, לרבות miRNA, עבור miRNA-seq, mRNA-seq לרביעיית-PCR. לפני בניית ספריה רצף תפוקה גבוהה, איכות RNA הכולל תאומת על-ידי פועל aliquot של RNA DNA, חלבונים דוגמת QC מערכת אוטומטית. מומלץ שיש RNA דגימות של רין מספר 7.0 ומעלה אם הם רוצים לשמש הכנה ספריית ה-RNA קטנים. דגימות עם מספרים נמוכים רין יש אחוז גבוה יותר של מוצרי ה-RNA מפורק בטווח גודל של RNA קטנים מינים (15-30 נוקלאוטידים). כאשר מספר רין מתחת 7.0, הכיסוי לא יהיה טוב. אפשרות נוספת עבור דגימות RNA פחות אידיאליים כדי לבצע גישה דלדול rRNA ולא בגישה בידוד ה-mRNA, אבל זה דורש כי הדגימות להיות לפחות 10 ng/mL.

הפרוטוקולים עבור ה-mRNA-seq המשמש כאן ממוטבים עבור 100-1, 000 ng של RNA הכולל. עבור miRNA-seq באמצעות פחות מ 100 ננוגרם של RNA הכולל, הכנה ספריית ה-RNA-seq קטן צריך לעקוב אחר רגיש יותר קטן RNA-seq הכנת פרוטוקול, אשר מנצל מבנה טבעי נפוץ כדי רוב המולקולות microRNA ידוע. MiRNAs הכי בוגרת יש 5'-פוספטים, קבוצה 3'-הידרוקסיל כתוצאה שלהם מסלול להן. מסיבה זו, המתאמים 3' ו 5' שבערכה זו ישירות מאתרים כדי miRNAs.

כדי לנתח את השפעת HDI ב B-cell mRNA, miRNA ביטוי ויוו, עכברים יכולים להיות מטופלים עם VPA או אחרים HDIs על-ידי הוספת הזה HDI המים לשתייה, הזרקה בקרום הבטן של אלו עכברים עם תלויי-T אנטיגן NP-CGG או T-עצמאי אנטיגן NP-LPS יכולה להתבצע. בתאי B יכול להיטהר מן הטחול 10 ימים לאחר חיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH AI 105813 ו- AI 079705 (למחשב), הברית לזיהוי לופוס מחקר היעד בלופוס גרנט ALR 295955 (למחשב), המחקר דלקת מפרקים קרן מחקר לאומי להעניק (HZ). TS נתמכה על ידי ברפואת ילדים במרכז הרפואי, החולים Xiangya השנייה, אוניברסיטת דרום סנטרל, צ'אנגשה, סין, בהקשר של התוכנית הביקור של סטודנט לרפואה Xiangya-UT הספר של רפואה סן אנטוניו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific - Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
  2. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
  3. Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
  4. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
  5. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
  6. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  7. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
  8. White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
  9. Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
  10. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
  11. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
  12. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
  13. Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
  14. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
  15. Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
  17. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  18. Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 127 תא B מחלקה-switch DNA רקומבינציה cytometry זרימה מעכבי היסטון deacetylase (HDAC) (HDIs) mRNA microRNA mRNA-seq miRNA-seq התמיינות תאים פלזמה
הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia,… More

Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter