Summary
Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.
Abstract
Antikor yanıt somatik Hipermutasyon (SHM), sınıf-anahtarı DNA rekombinasyon (CSR) ve Plazma hücre farklılaşma da dahil olmak üzere birkaç kritik B hücre-içsel süreçleri gerçekleştirilir. Son yıllarda epigenetik değişiklikler veya faktörlere Histon deasetilasyonu ve mikroRNA (miRNAs), B hücreli genetik programlar şekil antikor yanıt,'epigenetik faktörler disfonksiyon neden tespit edilmiştir iken etkileşimde gösterilmiştir antikor yanıt. B hücreleri epigenetik modülatörler cevaben genom çapında miRNA ve mRNA ifade analiz B hücreli işlev ve antikor yanıtı epigenetik Yönetmeliği anlamak için önemlidir. Burada, biz KSS ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi B hücreleri inducing, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri (HDIs) ile bu B hücreleri tedavi ve mRNA ve mikroRNA ifade analiz için bir protokol göstermek. Bu protokol için doğrudan yeni nesil mRNA sıralama (mRNA-seq) ve miRNA-seq teknolojileri, nasıl yapılacağını eşleme okur genom ve nicel ters transkripsiyon (qRT) kullanarak Tamamlayıcı DNA (cDNA) dizileri analiz-PCR. Bu yaklaşımlar ile CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi indüklenen B hücrelerde HDI, epigenetik bir regülatör, seçmeli olarak miRNA ve mRNA ifade modüle ve CSR ve Plazma hücre farklılaşması değiştirir, tanımladınız.
Introduction
Epigenetik işaretleri veya DNA metilasyonu, Histon ardından değişiklikler ve kodlamayan RNA'ların (mikroRNA'lar da dahil olmak üzere), gibi faktörler, hücre işlevi gen ifade1değiştirerek modüle. Epigenetik değişiklikler immünglobulin sınıf--düğme DNA rekombinasyon (CSR), somatik Hipermutasyon (SHM) ve bellek B hücreleri veya plazma hücreleri antikor ve antikor böylece oransal, farklılaşma gibi B lenfosit fonksiyon düzenleyen yanıt-e doğru2,3. CSR ve SHM eleştirel Etkinleştirme indüklenen sitidin birdeaminaz (yardım, Aicdakodlanmış), son derece B hücreleri T-bağımlı ve T-bağımsız antijenleri4yanıt indüklenen olduğu gerektirir. Sınıf-açık/hypermutated B hücreleri daha fazla 1 (Blimp1, Prdm1kodlanmış)5plazma hücrelerine antikorlar olgunlaşma B lenfosit kaynaklı protein eleştirel bağımlı bir biçimde büyük miktarda salgılar ayırt etmek. B hücreleri anormal epigenetik değişiklikleri Alerjik reaksiyon veya otoimmünite1,4yol açabilir anormal antikor/antikor yanıt neden olabilir. Nasıl epigenetik faktörleri anlama, miRNAs gibi B hücre içsel modüle gen ekspresyonu sadece aşı geliştirme için önemli değildir, ama aynı zamanda potansiyel anormal antikor/antikor yanıt mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.
Histon asetilasyon ve deasetilasyonu değişimleri genellikle Histon asetiltransferaz (şapka) ve Histon deacetylase (HDAC) tarafından katalize Histon proteinleri üzerinde lizin arasında vardır. Bu değişiklikler Kromatin artan veya azalan erişilebilirlik kurşun ve daha fazla izin vererek veya bağlama transkripsiyon faktörleri veya proteinler DNA ve tadilat gen ifade5,6, için 7 , 8. HDAC inhibitörleri (HDI) bir sınıf HDACs fonksiyonu ile müdahale bileşikleri vardır. Burada, HDI (VPA) iç gen ifade profil B hücreleri ve onun mekanizma HDAC Yönetmeliği gidermek için kullanılan.
miRNAs çeşitli aşamalarından oluşturulan küçük, kodlamayan RNA'ların yaklaşık 18-22 nükleotid uzunluğunda vardır. miRNA ana bilgisayar genlerin transkripsiyonu ve saç tokası birincil mikroRNA (PRI-miRNAs) oluşturur. Onlar nerede PRI-miRNAs daha da habercisi miRNAs (pre-miRNAs) işlenir sitoplazma, ihraç edilmektedir. Son olarak, olgun miRNAs pre-miRNAs bölünme meydana gelir. miRNAs onların hedef mRNA'ların6,7' nin 3' Çevrilmeyen bölgesi içindeki tamamlayıcı dizileri tanıdım. Çoğu susturmak aracılığıyla miRNAs yayılması, farklılaşma ve Apoptozis10,11gibi hücresel aktivite düzenleyen. Birden fazla miRNAs aynı mRNA hedefleyebilir ve bir tek miRNA potansiyel olarak birden çok mRNA'ların hedefleyebilirsiniz beri miRNA ifade profil bireysel değerini ve miRNAs toplu etkisini anlamak için bir içerik görünümünü olması önemlidir. miRNAs B-hücre gelişimi ve periferik farklılaşma, hem de B hücreli sahne özgü farklılaşma, antikor yanıt ve otoimmünite1,4,9dahil olduğu gösterilmiştir. 3' UTR'nin Aicda ve Prdm1, miRNAs8tarafından hedeflenen birkaç doğrulanmış veya tahmin edilen evrimsel korunmuş siteleri vardır.
Epigenetik modülasyon Histon sonrası transkripsiyon değişiklik ve miRNAs, dahil olmak üzere, hücre tipi ve hücre sahne özel düzenleme desen gen ifade9görüntüleyin. Burada, HDI aracılı modülasyon miRNA ve mRNA ifade, CSR ve Plazma hücre farklılaşması tanımlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bunlar B hücreleri CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi için ikna için protokol B hücreleri HDI ile tedavi etmek için; ve qRT-PCR, miRNA-seq ve mRNA seq10,11,12,8,13tarafından miRNA ve mRNA ifade analiz etmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokol kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler San Antonio, Teksas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi hayvan bakımı kuralları izler.
1. CSR, Plazma hücre farklılaşma ve HDI tedavi için fare B hücre stimülasyon
- dalak hücre süspansiyonlar hazırlanması
Not: laminar akış kukuIeta fare hariç tüm adımları uygulayın ötenazi ve diseksiyonu.- Belirli patojen-Alerjik C57BL/6J fare (8-12 hafta-in yaş) CO 2 inhalasyon tarafından Euthanize.
- Fare yukarı bakacak şekilde karın ile parçalanmış tahta üzerinde yatıyordu. Fare 18'lik, 1.5 - inç Hipodermik iğneler ile tüm dört metrelik pin.
- % 70 etanol bulanmış mendil kullanarak cilt sterilize.
- Autoclaved cerrahi araç (forseps ve diseksiyon makası) sadece dalak (karaciğer hemen altından karın sol tarafında) görselleştirmek için göğüs kafesi altındaki deri yoluyla kesmek için kümesinin kullanın.
- Başka bir steril forseps kullanın ve dalak yavaşça Forseps ile sıkma ve anatomi ile bağlanan tüm doku kapalı kesim tarafından mide daha fazla eğrilik altında yatıyor dalak ayıklamak için makas makas. Bağlantı doku kaldırdığınızdan emin olun.
- Tam RPMI1640 orta 1.000 µL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüpüne dalak yerleştirin (RPMI 1640 orta takviye ile % 10 ısı inaktive fetal buzağı serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 µg/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 0,25 µg/mL Amfoterisin B ve 50 µM β-mercaptoethanol).
- 50 mL polipropilen koni santrifüj tüpüne 70 µm hücre süzgeç koyun ve dalak microcentrifuge tüp hücre süzgeç üzerine dökün. 15 mL polipropilen koni santrifüj tüpü ucu hafifçe dalak süzgeç aracılığıyla püre için kullanın. 15-20 mL tam orta ile hücre süzgeç durulayın.
- 350 x g 5 min ve atma süpernatant için de hücreleri aşağı spin.
- Kırmızı kan hücreleri dalak hücre süspansiyonlar kaldırın. Hücre Pelet ACK lizis arabelleği (dalak başına 5 mL) resuspend. Ara sıra sallayarak ile oda sıcaklığında 4 dk için kuluçkaya ve tam orta 25 mL ile yavaşlaması.
- Spin 350 x g 5 min için de hücreleri aşağı ve süpernatant atın. Hücre Pelet tam orta 1 ya da 10 mL resuspend. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak.
- B-hücre izolasyon
Not: izole B hücreleri tarafından negatif seçim üretici takip ' s yönergeleri. Sigara-B hücreleri B hücreleri (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6 C/G (Gr-1) ve TER119) ve manyetik parçacıklar streptavidin kaplı karşı yönetmen biotinylated antikorlar ile kaldırılması için hedeflenir.- Hazırla 1 x 10 8 hücre/mL steril 5 mL (12 x 75 mm) polistiren tam ortamda bir 0,25-2 mL hücre süspansiyon yuvarlak alt tüp. Normal fare serum (50 µL/mL) için örnek ekleyin.
- Ekle 50 µL/mL yalıtım örnek için kokteyl. Hücreleri nazikçe pipetting tarafından mix yukarı ve aşağı 2 - 3 kat ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya
- 75 µL/mL streptavidin kaplı manyetik parçacıklar için örnek ekleyin. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix 2 - 3 kat ve oda sıcaklığında 2.5 min için kuluçkaya.
- Tam RPMI 1640 orta ekleyin. Hücreleri yukarı ve aşağı 2 - 3 kez hafifçe pipetting tarafından mix.
- (Olmadan kapağı) tüp mıknatıs yerleştirin ve 2.5 dk. Pour kapalı bir yeni 15 mL konik tüp içine el değmemiş B hücreleri içeren süpernatant için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Bir hemasitometre ve Trypan mavi leke kullanarak canlı hücreleri saymak. Akış Sitometresi Analizi B220 ve CD19 gibi B-hücre yüzey işaretlerinin tarafından B hücreleri saflığı değerlendirmek.
- B-hücre stimülasyon ve HDI tedavi
- tam RPMI 1640 orta 10 6 hücre/mL x 0,3 son bir konsantrasyon, saflaştırılmış B hücrelerinde Resuspend.
- 48-şey hücre kültür plaka hücre kültürü için kullanın. Her şey için saf B-hücre süspansiyon (10 6 hücre/mL x 0.3), Escherichia coli, Il-4 (5 ng/mL nihai toplama) ve 0 LPS (3 µg/mL son konsantrasyonu) veya 500 µM HDI (Valproik asit; 1 mL ekleyin VPA).
- Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO 2 60 h qRT-PCR ve yüksek üretilen iş mRNA ve miRNA sıralama çözümleme veya Akış Sitometresi Analizi için 96 h için kuluçkaya.
- Akış Sitometresi Analizi CSR ve Plazma hücre farklılaşması
- Hücreleri yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından kültür 96 h sonra her şey hücrelerden bağlantısını kesin. Hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Spin aşağı 350 x g 5 min bir tezgah üstü santrifüj kullanarak için de hücreleri ve süpernatant atın.
- Resuspend % 1 BSA ve 0,5 ng/mL floresein (FITC) - içeren HBSS arabelleği 100 µL hücrelerle konjuge keçi - fare IgM antikor (Ab) , 0.2 ng/mL allophycocyanin (APC) anti-konjüge fare Anti-fare Igg1 monoklonal Ab (mAb), 0.2 ng/mL phycoerythrin (PE)-Birleşik fare Anti-fare B220 mAb, 0.2 ng/mL PE-Cy7-Birleşik fare Anti-fare CD138 mAb ve 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Floresans Birleşik antikorlar (Adım 1.4.2), oda sıcaklığında 30 dakika süreyle karanlıkta hücrelerle kuluçkaya
- HBSS % 1 BSA ile 1 mL hücrelerle yıkayın.
- 1500 x g 5 min bir benchtop santrifüj ve atma süpernatant kullanarak için de hücreleri aşağı spin.
- HBSS % 1 BSA ile 300 µL hücrelerde resuspend ve hücre süspansiyon yuvarlak alt polistren tüp aktarın. Işığa maruz önlemek için folyo ile tüp kapak.
- Bir tek hücre süspansiyon gerçekleştir Akış Sitometresi Analizi. Her tazminat örnek için 50.000 olaylar ve diğer örnekleri için 250.000 olayları toplamak. Ekipman yazılım kullanarak veri analiz.
- Bir darbe geometri kapı (FSC-Y FSC-A ve SSC-H SSC-A x x) kullanarak enkaz ve birini ortadan kaldırmak. Uygun şekilde ölü hücreleri dışlamak için arsa üzerinde 7-AAD kapısı.
2. Yüksek işlem hacmi mRNA-Seq
- sonra 60 h kültür, ayıklamak toplam RNA küçük RNA üretici takip kurtarabilirsiniz bir toplam RNA izolasyon kit kullanarak 2-4 × 10 6 hücrelerden ' s yönergeleri. Bir Dnaz dahil ben tedavi adım.
- Üretici takip bir bioanalyzer kullanarak RNA bütünlüğünü ' s yönergeleri.
- Yüksek kaliteli toplam RNA'ın 500-1000 ng kullanın (RNA bütünlük numarası RIN > 8.0) RNA-seq için ticari bir RNA ile kütüphane hazırlık örnek pÜretici takip temsilcisi kiti ' s yönergeleri.
- Bağdaştırıcıları onların anılan sıraya göre 6-bp dizin bölümlerini dayalı bireysel mRNA-seq kitaplıkları havuz ve kütüphaneler, 50 bp/sıra sıra. Üreticiye göre yüksek üretilen iş DNA sistemi kullanmak ' s protokolleri.
- Her örnek için fastq dosyası oluşturmak için CASAVA ile sıralama çalıştırdıktan sonra demultiplex. Eşleme okuma ve Biyoinformatik analizi, Önceden Seviyelendirilmiş 11 olarak gerçekleştirmek.
- Tüm sıralama okuma TopHat2 varsayılan ayarları 14 kullanarak kendi başvuru genleri (UCSC fare genom yapı mm9) ile hizalayın. Gene tüm örneklerinde başına sayıları elde etmek için HTSeq-count kullanarak hizalama bam dosyalarından işlemek.
3. Yüksek işlem hacmi miRNA-Seq
- kullanımı 100 ng-1 µg yüksek kaliteli toplam RNA, hazırlanan gibi adım 2.1, ticari bir küçük RNA-seq kit kullanarak küçük RNA-seq Kütüphane hazırlık için.
- Ligate dejenere 3 ' bağdaştırıcısı 5 üzerine ′ başlangıç küçük RNA molekülleri bir ticari tüp ligasyonu kiti ile biter. Dejenere 5 ligate ' bağdaştırıcısı üzerine 3 ′ başlangıç küçük RNA molekülleri bir ticari tüp ligasyonu kiti ile biter. RNA tarafından ters transkripsiyon cDNA için dönüştürmek ve PCR güçlendirme ticari kitleri ile tarafından küçük RNA-seq Kütüphane yükseltmek.
- % 6 TBE yerel sayfa jel son küçük RNA-seq kitaplığı belirlemek için kullanın. Bromophenol boya izleme mavi bant jel (0.5 - 1 cm) sonuna yaklaştıkça kadar jel 200 V 1 X TBE arabellek ile çalıştırmak.
- Jel cam plakanın kaldır ve leke etidyum bromür (0,5 µg/mL suda) ile 2-3 dk. Visualize jel bantları UV transilluminator veya başka bir jel dokümantasyon araç temiz bir kapta.
- Kesme dışarı temiz jilet kullanarak ~ 150 bp bant ve 1.7 mL tüp içine yerleştirin.
- Bir jel ekstraksiyon kiti için üreticinin yönergelerini kullanarak DNA ayıklamak.
- Ticari bir yüksek-duyarlı DNA tahlil son kitaplıkla ve konsantrasyon üreticileri başına bir ticari dsDNA tahlil ile boyutu dağıtımını kontrol ' yönergeleri.
- Güçlendirme ve bir sonraki sıralamanın başına üreticinin ticari bir yüksek üretilen iş DNA sıralama sistemi ile çalıştırmak için kitaplıklarına havuz ' s protokolleri.
- Demultiplex üretici başına her örnek için fastq dosyası oluşturmak için CASAVA ile ' s protokolleri.
- Her örnek küçük RNA-seq analiz için üretici başına küçük RNA hizalama için titreme kullanmanız ' s iletişim kuralları.
- Kaldırmak rRNA, astar, mitokondri gibi kirletici için hizalı ve benzeri okuma.
- MiRNA dizileri olgun verileri hizalama.
- Saç tokası döngü sıraları (öncü miRNA) verileri hizalama.
- Hizala veri için diğer küçük RNA (fRNA veritabanı kullanılır) dizileri 15.
- Sonra tüm örneklerini sayılabilir, farklı gruplar/örnekler arasındaki fark ifade miRNAs tanımlarsınız. Hedef seçilen mRNA'ların veya TargetScan 16, evren 17 ve PicTar gibi online miRNA hedef tahmin araçları kullanarak bir seçici miRNA tarafından hedef mRNA'ların miRNAs tahmin 18 .
- Fonksiyonel ek açıklama veya yolu analizi gereklidir, marifet yolu analizi (IPA) için tahmin edilen genlerin gönderin veya DAVID.
4. Kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) mRNA'ların ve miRNAs
- mRNA qRT-PCR analizi
- ayıklamak RNA 0,2-5 × 10 üzerinden 6 hücreleri aşağıdaki küçük RNA kurtarabilirsiniz bir ticari toplam RNA izolasyon kit kullanarak Üretici ' s yönergeleri. Bir Dnaz dahil ben tedavi adım.
- Oligo-dT astar kullanarak bir ilk-strand cDNA sentez sistemiyle cDNA üzerinden toplam RNA sentez.
- QRT-PCR ile 2 x gerçek zamanlı PCR ana karışımı ile aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak uygun astar tarafından cDNA ölçmek: 15 95 ° C s, 40 devredir 10 94 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 30 s.
- Veri toplama sırasında 72 ° C uzantısı adım gerçekleştirmek ve 95'e 72 erime eğrisi çözümlemesi ° C.
- miRNA qRT-PCR analizi
- Aliquot RNA 4.1.1 adımda hazırlanan örneklerinden.
- Ters-uyarlamak RNA cDNA içine. Üretici takip bir ticari mikroRNA ters transkripsiyon setini kullanın ' s yönergeleri.
- Gerçek zamanlı PCR ile 250 nM olgun miRNA ileri astar birlikte evrensel bir ters astar ile SYBR yeşil gerçek zamanlı PCR ana hamuru kullanılarak mikroRNA gerçekleştirir.
- Tezcan 2 x PCR Master Mix, miRNA özgü ileri astar ve evrensel ters astar, oda sıcaklığında. Bireysel çözümler karıştırın.
- Hazırlamak bir reaksiyon karışım aşağıdaki gibi bir 25 µL-başına-da tepki birim (96-şey PCR levha kullanılır) için:
2 x PCR Master Mix 12.5 µL
miRNA ileri astar (2,5 μM) 2.5 µL
evrensel ters astar (2,5 μM) 2.5 µL
RN ASE-Alerjik water5 µL - tepki Mix bir 96-şey PCR plakasına eklemek 22,5 μL. Şablon cDNA (50 pg-3 ng) 2.5 µL bireysel plaka wells ekleyin.
- Sıkıca tutkal plaka film. 1 dk 1000 x g ve oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.
- Plaka gerçek zamanlı cycler yerleştirin ve Bisiklete binme aşağıdaki programı Başlat: 95 ° C 5 min, 40 devredir 15 94 ° c için s, 30 55 ° C s ve 72 ° C 30 s.
- Bir elektronik tabloyla qRT-PCR veri analizi için ΔΔCt yöntemini kullanın. İfade küçük nükleer/genelde RNA'ların Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 ve Snord70/SNORD70 ilgili miRNAs ifade normalleştirmek.
- İstatistiksel analiz
- p değerleri ile eşleştirilmiş ve öğrenci unpaired belirlemek için istatistiksel analiz ' s t - bir elektronik tablo kullanarak test etmek ve p değerleri göz önünde < 0,05 olarak önemli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim iletişim kuralını kullanarak saf LPS ile yerleştirilen B hücreleri (3 µg/mL) ve Il-4 (5 ng/mL) CSR Igg1 için % 30-40 ve Plazma hücre farklılaşma ~ %10 96 h neden olabilir için. Plazma hücre farklılaşması % ~ 2'ye düştü iken HDI (500µM VPA) ile tedavi sonrası CSR Igg1 için 10-%20 Için azalmıştır (şekil 1). CSR HDI aracılı inhibisyonu daha düşük sayıda sonrası rekombinasyon Iμ-Cγ1 ve olgun VHDJHtarafından doğruladı-tamamlanmış CSR işaretlerinden vardır Cγ1 transkript. QRT-PCR tarafından ölçülen CSR/SHM ve Prdm1 ve Xbp1, için Plazma hücre farklılaşması için önemli olan kritik olan Aicda, ifade VPA (Şekil 2) tarafından inhibe olabilir için gösterildi.
MRNA ifade HDI B hücreleri tarafından modülasyon çok seçici. MRNA-seq B hücreleri LPS ve Il-4 ile uyarılmış tarafından ölçülen bu son derece ifade mRNA'ların sadece % 0.3 upregulated HDI fazla iki kat tarafından ve sadece %0,36 son derece ifade vardı (> 20 kopya/hücreye B hücreleri HDI tedavi olmadan) mRNA'ların de dahil olmak üzere, Aicda, Prdm1, ve Xbp1, HDI (şekil 3) % 50 daha fazla tarafından azaltılmış.
Aicda, Prdm1ve Xbp1 ifade downregülasyon potansiyel olarak gen ekspresyonu negatif düzenleyiciler olan miRNAs tarafından aracılık. MiRNA tahmin araçları (TargetScan.org, miRNA.org ve miRbase.org) hedefleme kullanarak, potansiyel olarak Aicda veya Prdm1hedefleyen birden çok miRNAs tespit edilmiştir. MiRNA B hücreleri profil oluşturma miRNA-seq analiz HDI ile tedavi veya nil göstermiştir ki HDIs seçmeli olarak upregulate Aicda - ve miRNAs (şekil 4-6) hedefleme Prdm1 -.
Şekil 1. B-hücre marker B220, yüzey antikor Igg1 ve plazma hücreli işaret CD138 yüzey ifade Akış Sitometresi tarafından analiz.
B220+ Igg1+ hücreleri B hücreleri Igg1 için açık olduğunu. B220düşükCD138+ hücreler plazma hücreleri vardı. Igg1-anahtarlı B hücreleri ve plazma hücreleri B hücrelerinin LPS ve Il-4 nil varlığında veya HDI (VPA, 500 M) ile 96 h için uyarılmış yüzdesi kapıları içinde sayı olarak gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tamamlanan CSR işaretlerinden ifadesidir; VHDJHolgun-Cγ1 transkriptler ve sonrası rekombinasyon Iμ-Cγ1 transkript; ve Aicda, Prdm1ve Xbp1 qRT-PCR tarafından analiz, Cd79b transkript için normalleştirilmiş ve bir çubuk grafik gösterilmiştir.
B hücreleri 500 µM VPA huzurunda LPS ve Il-4 ile uyarılan gen ekspresyonu ve gen ekspresyonu ile ilgili B hücreleri ile aynı uyaranlara nil huzurunda 1 tasvir. Üç bağımsız deneylerden verilerdir. p değerleri, eşleştirilmiş t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. B hücreleri LPS ve Il-4 ile uyarılmış ve HDI (VPA, 500 µM) ile tedavi veya nil 60 h. mRNA ifade için mRNA-seq. tarafından analiz edildi
(A) ortalama mRNA ifade üç bağımsız deneyler (okuma kilobaz milyon eşlenen okuma, RPKMs başına başına) seviyelerinde scatter araziler içinde tasvir. Her çizim bir bireysel mRNA ifade düzeye karşılık gelir. İki kesik çizgiler iki kat çizgilerdir. Üst Kesikli çizgi bulunan araziler dağılım veya alt Kesikli çizgi olmadığını iki kat daha fazla hızlı mRNA'ların veya az yarısı zaman sırasıyla VPA ve nil, tarafından indüklenen. (B) çubuk grafikler mRNA ifade düzeyleri (üç bağımsız deneyler ortalama RPKMs) LPS ortalama değişikliği tasvir ve IL 4 uyarılmış B hücreleri ile karşılaştırıldığında bu B hücreleri HDI ile tedavi tedavi ile nil. Ortalama bir RPKM, mRNA'ların > 20 LPS ve IL 4 uyarılmış B nil ile tedavi hücreler dikkate alınır. Her bireysel deney, mRNA ifadede bir dağılım çizim (C) veya çubuk grafik (D), tarafından gösterildiği gibi tasvir olarak aynı şekilde (A) ve (B). p değerleri, eşleştirilmiş t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. B hücreleri LPS ve Il-4 ile uyarılmış ve HDI (VPA, 500 µM) ile tedavi veya nil 60 h. miRNA ifade için miRNA-seq. tarafından analiz edildi
(A) bu B hücreleri sıfır ile tedavi göre için HDI ile tedavi B hücreleri ortalama miRNA ifade seviyelerinde değişiklik çubuk grafikler tarafından tasvir. B hücrelerdeki sıfır içinde üç bağımsız deneyler ile tedavi göre için HDI ile tedavi (B) değişiklik miRNA ifade düzeylerinde b hücreleri çubuk grafikler tarafından tasvir. Sadece miRNAs ortalama rpm'de > 0,5 LPS ve IL 4 uyarılmış B nil ile tedavi hücreler dikkate alınır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. MiRNA-seq. tarafından gösterildiği gibi bir ifade miRNAs, hedefleme Aicda -HDI artırır
(A) miRNAs ve onların hedef siteleri içinde 3' UTR Aicda mRNA'ların, dizi hizalaması. (B) B hücreleri LPS ve Il-4 ile HDI (VPA, 500 M) içinde için 60 h kültürlü. Aicda 3' UTR hedeflemek için miRNA-seq tarafından analiz ve RPM tasvir tahmin miRNAs ifadesidir. p değerleri, eşleştirilmiş t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. MiRNA-seq. tarafından gösterildiği gibi bir ifade miRNAs, hedefleme Prdm1 -HDI artırır
(A) miRNAs ve onların hedef siteleri içinde 3' UTR Prdm1 mRNA'ların, dizi hizalaması. (B) B hücreleri LPS ve Il-4 ile varlığı veya yokluğu HDI (VPA, 500 M) 60 h. Prdm1 3' UTR hedeflemek için miRNA-seq tarafından analiz ve RPM tasvir tahmin miRNAs ifade için kültürlü. p değerleri, eşleştirilmiş t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı B hücre sınıf anahtarlama ve Plazma hücre farklılaşması ikna etmek için kapsamlı yaklaşım sağlar; epigenetik modülatörler tarafından Yani HDI etkisini analiz etmek; ve bu hücreler HDI etkisini mRNA ve miRNA ifadesine algılamak için. Bu yaklaşımların çoğu insan B hücreli işlev ve mRNA/miRNA ifade epigenetik faktör etkisini analiz etmek için kullanılabilir. QRT-PCR ve mRNA-seq/miRNA-seq yaklaşımlar fareler gibi HDIs epigenetik modülatörler ile tedavi dan izole B hücreleri analiz etmek için kullanılabilir.
Epigenetik modulate hücre çoğalması ve canlılığı, CSR ve Plazma hücre farklılaşması etkileyebilecek gibi birçok farklı hücre fonksiyon etkileyebilir. Bu nedenle, hücre çoğalması, canlılık ve hücre döngüsü B hücreleri ile ya da ezelî HDI tedavi, analiz edilmelidir. Bir mRNA ve miRNA ifade HDI tarafından veya diğer epigenetik düzenleyiciler tarafından qRT-PCR modülasyon analiz etmek için zor bir uygun temizlik gen veya küçük RNA seçmektir. Birçok ortak temizlik genlerin farklı derecelerde epigenetik modülatörler tarafından değiştirilebilir. Birçok farklı temizlik genlerin ifade düzeyleri ölçülebilir ve belirli bir gen ifade normalize etmek qRT-PCR tarafından kullanılan. Bu sorun ayrıca mRNA seq ve miRNA-seq, nerede bireysel mRNA'ların veya miRNAs ifade genom çapında mRNA veya miRNA düzeyleri tarafından normalleştirilmiş tarafından ele alınması.
mRNA seq yalnızca uygun Biyoinformatik boru hattı ile mRNA ifade profil tanımlayabilirsiniz değil ama bu yaklaşım aynı zamanda uzun kodlamayan RNA (lncRNA) profil tanımlayabilirsiniz. mRNA seq genelde zenginleştirme Poli(a) + RNA'ların oligo(dT) seçime göre içerir. LncRNA bir dizi bilinen gibi Poli(a) kuyruğu yetersizliği, oligo (dT) seçimi içeren mRNA seq yaklaşım lncRNA ifade tam bilgiler belirlenemiyor. MRNA ve lncRNA ifade profilleri tam kapsama elde etmek için rRNA tükenmesi içeren bir RNA-seq yaklaşım kullanılmalıdır. Deneylerimiz çoğunda, miRNA miRNA-seq, mRNA seq ve qRT-PCR için de dahil olmak üzere toplam RNA ayıklamak için bir ticari seti kullanın. Yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı oluşturmak yoluyla önce toplam RNA kalite bir aliquot bir otomatik RNA, DNA ve protein örnek QC sistemde çalışan tarafından doğrulanır. RNA örnekleri bir RIN sayı 7.0 veya daha yüksek eğer onlar küçük RNA Kütüphane hazırlık için kullanılacak olması önerilir. Örnekleri alt RIN numaraları ile küçük RNA türler (15-30 nukleotid) boyutu aralığı bozulmuş RNA ürünleri daha yüksek bir yüzdesi var. RIN 7.0 altında olduğunda, kapsama kadar iyi olmayacaktır. Az daha ideal RNA örnekleri için başka bir seçenek bir mRNA yalıtım yaklaşım yerine bir rRNA tükenmesi yaklaşım gerçekleştirmek için ama bu örnekler en az 10 ng/mL olmasını gerektirir.
MRNA seq burada kullanılan protokollerde toplam RNA'ın 100-1000 ng için optimize edilmiştir. MiRNA-seq 100'den küçük kullanarak için ng toplam RNA, küçük RNA-seq Kütüphane hazırlık için en bilinen mikroRNA moleküller doğal yapısı ortak yararlanır bir daha duyarlı küçük RNA-seq hazırlık protokol, takip etmeli. En olgun miRNAs bir 5'-fosfat ve onların Biyogenez yolu sonucunda 3'-hidroksil grubu var. Bu nedenle, bu seti 3' ve 5' bağdaştırıcıları doğrudan miRNAs için tane.
B-hücre mRNA ve miRNA ifade içinde vivoHDI etkisini analiz etmek için fareler VPA veya diğer HDIs ile içme suyu ve bu fareler T-bağımlı antijen NP-CGG veya T-bağımsız mayi enjeksiyon bu HDI ekleyerek tedavi edilebilir antijen NP-LPS gerçekleştirilebilir. B hücreleri dalak 10 gün sonra aşılama saf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser NIH hibe AI 105813 ve AI 079705 (PC için) tarafından desteklenen, Lupus araştırma hedef tanımlama Lupus Grant ALR 295955 (PC için) için İttifak ve artrit Ulusal Araştırma Vakfı araştırma (HZ) verin. TS desteklenen Pediatri Tıp Merkezi, ikinci Xiangya hastane, Merkezi Güney üniversite, Changsha, Çin, tarafından Xiangya-UT okul tıp San Antonio tıbbi öğrenci ziyaret programı bağlamında.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
