Summary
Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.
Abstract
Antilichaam reacties zijn bereikt door verschillende kritische B-cel-intrinsieke processen, met inbegrip van somatische hypermutation (SHM), klasse-switch DNA recombinatie (CSR) en plasma celdifferentiatie. In de afgelopen jaren is epigenetische veranderingen of factoren, zoals Histon deacetylation en microRNAs (miRNAs), gebleken om te interageren met de B-cel genetische programma's vorm antilichaam reacties, terwijl de disfunctie van epigenetische factoren blijkt te leiden tot autoantibody reacties. Het analyseren van genoom-brede miRNA en mRNA uitdrukking in B cellen in reactie op de epigenetische modulatoren is belangrijk voor het begrijpen van de Epigenetische regulatie van de B-cel functie en antilichaam reactie. Hier tonen we een protocol voor inducerende B cellen ondergaan van MVO en plasma cel differentiatie, behandelen deze B-cellen met histone deacetylase (HDAC) remmers (Hotel) en analyseren van mRNA en microRNA expressie. In dit protocol, analyseren we rechtstreeks aanvullende opeenvolgingen van DNA (cDNA) met behulp van volgende-generatie mRNA sequencing (mRNA-seq) en miRNA-seq technologieën, in kaart brengen van de volgorde leest aan het genoom, en kwantitatieve omgekeerde transcriptie (qRT)-PCR. Met deze aanpak, die we hebben gedefinieerd dat in B cellen geïnduceerde ondergaan MVO en plasma celdifferentiatie, HDI, een epigenetische regulator, selectief miRNA en mRNA uitdrukking moduleert en verandert van MVO en plasma cel differentiatie.
Introduction
Epigenetische merken of factoren, zoals methylation van DNA, histone posttranslationele modificaties en niet-coderende RNAs (inclusief microRNAs), moduleren functie cel door gene expression1te wijzigen. Epigenetische aanpassingen reguleren B-lymfocyt functie, zoals immunoglobulin klasse-switch DNA recombinatie (CSR), somatische hypermutation (SHM) en differentiatie geheugencellen B of plasmacellen, waardoor het moduleren van het antilichaam en autoantibody Reacties2,3. MVO en SHM vereisen kritisch activering-geïnduceerde cytosinetrifosfaat Dipyridamol (steun, gecodeerd als Aicda), die zeer wordt geïnduceerd in B cellen in reactie op T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigenen4. Klasse-geschakeld/hypermutated B cellen verder differentiëren tot plasmacellen, die grote volumes van antilichamen in een mode kritisch afhankelijk van rijping B-lymfocyt-geïnduceerde proteïne afscheiden 1 (Blimp1, gecodeerd als Prdm1)5. Abnormale epigenetische veranderingen in de B-cellen kunnen leiden tot afwijkende antilichaam/autoantibody reacties, die tot allergische reactie of autoimmuniteit1,4 leiden kunnen. Begrijpen hoe epigenetische factoren, zoals miRNAs, moduleren B-cel-intrinsieke genexpressie is niet alleen belangrijk voor de ontwikkeling van een vaccin, maar is ook essentieel om te onthullen van de mechanismen van potentieel abnormale antilichaam/autoantibody reacties.
Histon acetylation en deacetylation zijn wijzigingen van de lysine residuen op Histon eiwitten meestal gekatalyseerd door Histon acetyltransferase (hoed) en histone deacetylase (HDAC). Deze wijzigingen leiden tot de toenemende of dalende toegankelijkheid van de chromatine en verdere toestaan of voorkomen van de binding van transcriptiefactoren of proteïnen aan DNA en de wijziging van gen expressie5,6, 7 , 8. HDAC-remmers (HDI) vormen een klasse van verbindingen die met de functie van HDACs interfereren. Hier, we gebruikten HDI (VPA) inspelen op de regulering van HDAC op de intrinsieke genexpressie profiel van B-cellen en zijn mechanisme.
miRNAs zijn kleine, niet-coderende RNAs ongeveer 18 tot en met 22 nucleotiden in lengte die worden gegenereerd door verschillende stadia. miRNA host genen worden getranscribeerd en vormen haarspeld primaire microRNAs (pri-miRNAs). Ze worden geëxporteerd naar het cytoplasma waar pri-miRNAs verder worden verwerkt tot voorloper miRNAs (pre-miRNAs). Ten slotte, volwassen miRNAs worden gevormd door de splitsing van de pre-miRNAs. miRNAs herkennen de aanvullende reeksen binnen de 3' niet-vertaalde regio van hun doel mRNAs6,7. Via post-transcriptional tot zwijgen brengen, regelen miRNAs cellulaire activiteit, zoals de proliferatie en differentiatie apoptosis10,11. Aangezien meerdere miRNAs zich op de dezelfde mRNA richten kunt en één enkele miRNA mogelijk meerdere mRNAs kunt richten, is het belangrijk dat een weergave van de in het kader van de miRNA expressie profiel te begrijpen de waarde van het individu en het collectief effect van miRNAs. miRNAs is aangetoond te worden betrokken bij de ontwikkeling van de B-cel en perifere differentiatie, evenals fase-specifieke B-celdifferentiatie, antistofrespons tegen en autoimmuniteit1,4,9. In de 3' UTR van Aicda en Prdm1zijn er verschillende gevalideerde of voorspelde evolutionair geconserveerde sites die kunnen worden gericht door miRNAs8.
Epigenetische modulatie, met inbegrip van Histon na transcriptie wijziging en miRNAs, een celtype en cel fase-specifieke reglementering patroon van gen expressie9weergeven We beschrijven hier, methoden om te definiëren van de HDI-gemedieerde modulatie van miRNA en mRNA uitdrukking, MVO en plasma celdifferentiatie. Deze omvatten protocollen voor inducerende B cellen ondergaan van MVO en plasma celdifferentiatie; voor de behandeling van de B-cellen met HDI; en voor het analyseren van miRNA en mRNA uitdrukking door qRT-PCR, miRNA-seq en mRNA-seq10,11,12,8,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
het protocol volgt de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de institutionele zorg van het dier en gebruik commissies van de University of Texas Health Science Center in San Antonio.
1. stimulatie van de muis B cellen voor MVO, Plasma celdifferentiatie en HDI behandeling
- voorbereiding van milt cel schorsingen
Opmerking: alle stappen in een laminaire flow-kap met uitzondering van de muis euthanasie en dissectie.- De specifieke pathogenen vrije C57BL/6J muis (8-12 weken oud) CO 2 inademing euthanaseren.
- Leg de muis op ontleden bord met de buik naar boven gericht. PIN alle vier voeten van de muis met 18-gauge, 1,5 - in injectienaalden.
- De huid met behulp van 70% ethanol doordrenkte doekjes steriliseren.
- Gebruik van een set van gesteriliseerde met autoclaaf chirurgische instrumenten (pincet en ontleden schaar) te snijden door de huid net onder de ribbenkast te visualiseren de milt (aan de linkerkant van de buik, net onder de lever).
- Gebruiken een ander steriel pincet en schaar om uit te pakken van de milt, die onder de grotere kromming van de maag, ligt door klemmen van de milt zachtjes met een tang en het afsnijden van alle het aansluitende weefsel met het ontleden van scharen. Zorg ervoor dat alle de aansluitende weefsel verwijderen.
- Plaatst de milt in een buis van de 1.5-mL microcentrifuge met 1.000 µL van volledige RPMI1640 medium (RPMI 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 µg/mL penicilline, 100 µg Mn/mL streptomycine, 0,25 µg/mL amfotericine B en 50 µM β-mercaptoethanol).
- Plaats een 70-µm cel zeef in een 50 mL polypropyleen conische centrifugebuis en giet de milt van de buis van de microcentrifuge op de zeef van de cel. Hiermee kunt u dat het puntje van een tube van 15 mL polypropyleen conische centrifuge zachtjes Prak de milt door de zeef. Spoel de cel zeef met volledige gemiddeld 15 tot 20 mL.
- Spin down de cellen bij 350 x g gedurende 5 min en negeren het supernatant.
- Verwijder de rode bloedcellen uit de milt cel schorsingen. Resuspendeer de pellet cel in ACK lysis-buffermengsel (5 mL per milt). Incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur met af en toe schudden en vervolgens doven met 25 mL van volledige medium.
- Spin down de cellen bij 350 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 1 of 10 mL volledige voedingsbodem. Tellen de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer.
- B-cel isolatie
Opmerking: isoleren B cellen door negatieve selectie na de fabrikant ' s instructies. Niet-B-cellen zijn gericht voor verwijdering met biotinyleerd antilichamen gericht tegen niet-B cellen (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) en TER119) en daar beklede magnetische deeltjes.- Voorbereiden een 0.25 tot 2 mL celsuspensie van 1 x 10 8 cellen/mL in volledige medium in een steriele 5 mL (12 x 75 mm) polystyreen ronde onderkant buis. Normale rat serum (50 µL/mL) Voeg aan het monster.
- Toevoegen 50 µL/mL isolatie cocktail aan het monster. Meng de cellen door zachtjes pipetting op en neer 2 - 3 keer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
- Voeg 75 µL/mL daar beklede magnetische deeltjes aan het monster. Meng het mengsel zachtjes op en neer waarbij 2 - 3 keer en incubeer gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur.
- Toevoegen volledige RPMI 1640 medium. Meng de cellen door pipetteren zachtjes op en neer 2 - 3 keer.
- Plaats van de buis (zonder de deksel) in de magneet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2,5 minuten Pour uit het supernatant met ongerepte B-cellen in een nieuwe conische buis van 15 mL.
- Rekenen de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en Trypan Blue vlek. Beoordelen van de zuiverheid van de B-cellen door stroom cytometry analyse van B-cel oppervlakte markers, zoals B220 en CD19.
- B-cel stimulatie en HDI behandeling
- resuspendeer de gezuiverde B-cellen in volledige RPMI 1640 medium bij een eindconcentratie van 0,3 x 10 6 cellen/mL.
- Voor cultuur van de cel een 48-well cel cultuur plaat gebruiken. Voor elk putje, voeg 1 mL van gezuiverde B-celsuspensie (0.3 x 10 6 cellen/mL), LPS (eindconcentratie 3 µg/mL) van Escherichia coli, IL-4 (eindconcentratie 5 ng/mL) en 0 of 500 µM HDI (valproic zuur; VPA).
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 60 h voor qRT-PCR en high-throughput mRNA - en miRNA-sequencing analyse of 96 uur stroom cytometry p.a..
- Stroom cytometry analyse van MVO en plasma celdifferentiatie
- na 96 h van de cultuur, de cellen van elk putje loskoppelen door de cellen op en neer meermaals pipetteren. Breng de celsuspensie in een 1.5-mL microcentrifuge buis. Spin down de cellen bij 350 x g gedurende 5 min met behulp van een centrifuge Bank-top en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen met 100 µL van HBSS buffer met 1% BSA en 0,5 ng/mL fluoresceïne (FITC) - geconjugeerd geit anti - muis IgM-antistoffen (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-geconjugeerd rat-antimuis IgG1 Monoclonal Ab (mAb), 0,2 ng/mL phycoerythrin (PE)-geconjugeerd rat anti-muis B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-geconjugeerde rat anti-muis CD138 mAb en 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Incubeer de cellen met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (stap 1.4.2) in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten
- Wassen van de cellen met 1 mL HBSS met 1% BSA.
- Spin down de cellen bij 1.500 x g gedurende 5 min met behulp van een benchtop centrifuge en negeren het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 300 µL van HBSS met 1% BSA en de celsuspensie overbrengen in een polystyreen ronde-onderkant-buis. Dekking van de buis met folie om te voorkomen dat blootstelling aan licht.
- Stroom cytometry-analyses uitvoeren op een eencellige suspensie. 250.000 en 50.000 gebeurtenissen voor elk monster vergoeding voor de overige monsters verzamelen. Analyseren van de gegevens met behulp van apparatuur software.
- De puin en de paren elimineren met behulp van een puls-meetkunde gate (FSC-H x FSC-A en WS-H x SSC-A). Poort op de juiste wijze de plot op 7-AAD uit te sluiten van de dode cellen.
2. High-Throughput mRNA-Seq
- na 60 h van cultuur, extract het totaal RNA van 2-4 × 10 6 cellen met behulp van een totale isolatie kit voor RNA die kleine RNA na de fabrikant kan herstellen ' s instructies. Omvatten een DNase ik behandeling stap.
- Verifiëren van de integriteit van de RNA met behulp van een bioanalyzer, na de fabrikant ' s instructies.
- Gebruik 500-1000 ng van kwalitatief hoogwaardige totaal RNA (RNA integriteit nummer RIN > 8.0) voor RNA-seq sample bibliotheek voorbereiding met een commerciële RNA prep kit na de fabrikant ' s instructies.
- Pool van de individuele mRNA-seq-bibliotheken op basis van hun respectieve 6-bp index gedeelten van de adapters en volgorde van de bibliotheken op 50 bp/volgorde. Gebruik van een high-throughput DNA systeem volgens de fabrikant ' s protocollen.
- Na de sequencing run, demultiplex met CASAVA voor het genereren van het bestand fastq voor elk monster. Uitvoeren van leest mapping en bioinformatica analyse, zoals eerder beschreven 11.
- Alle sequencing leest met hun referentie genomen (UCSC muis genoom bouwen mm9) met behulp van TopHat2 standaard instellingen 14 uitlijnen Verwerken van de bam-bestanden uit met behulp van HTSeq-graaf te verkrijgen van de graven per gen in alle monsters uitlijning.
3. High-Throughput miRNA-Seq
- gebruik 100 ng-1 µg totaal RNA van hoge kwaliteit, zoals voorbereid stap 2.1, voorbereiding kleine RNA-seq bibliotheek met behulp van een commerciële kit voor kleine RNA-seq.
- Ligate de ontaarde 3 ' adapter op de 5 ′ uiteinden van de startende kleine molecules van RNA met een commerciële afbinding kit. De ontaarde 5 afbinden ' adapter op de 3 ′ uiteinden van de startende kleine molecules van RNA met een commerciële afbinding kit. Het RNA omzetten in cDNA door omgekeerde transcriptie en versterken van de kleine RNA-seq-bibliotheek door PCR versterking met commerciële kits.
- Gebruik een 6% TBE inheemse pagina gel te isoleren van de laatste kleine RNA-seq-bibliotheek. De gel worden uitgevoerd met 1 X TBE buffer bij 200 V totdat de band bromophenol-blauwe kleurstof bijhouden de onderkant van de gel (0.5 - 1 cm nadert).
- Verwijderen van de gel uit de glazen platen en vlek met ethidiumbromide (0,5 µg/mL in water) in een schone container voor 2-3 min. visualiseren de gel bands op een UV-transilluminator of een ander gel documentatie instrument.
- Gesneden uit de ~ 150-bp-band met behulp van een schone scheermes en leg deze in een tube van 1,7 mL.
- Extract van het DNA met behulp van een gel extractie kit per fabrikant instructies.
- Check de grootteverdeling van de definitieve bibliotheek met een commerciële ultragevoelige DNA test en de concentratie met een commerciële dsDNA test per de fabrikanten ' instructies.
- Pool van de Bibliotheken, versterking en een daaropvolgende sequencing uitgevoerd met een high-throughput DNA sequencing handelsstelsel per de fabrikant ' s protocollen.
- Demultiplex met CASAVA voor het genereren van het bestand fastq voor elk monster per de fabrikant ' s protocollen.
- Voor kleine RNA-seq analyse van elk monster, flikkering te gebruiken voor kleine RNA uitlijning per de fabrikant ' s protocollen.
- Verwijderen leest die zijn uitgelijnd op verontreinigingen, zoals mitochondriën, rRNA, primers, enzovoort.
- De gegevens om oudere miRNA sequenties uitlijnen.
- De gegevens uitlijnen op haarspeld lus sequenties (voorloper van miRNA).
- Uitlijnen de gegevens tot en met andere kleine RNA-sequenties (met behulp van de fRNA database) 15.
- Nadat alle monsters worden gekwantificeerd, definiëren de differentiële uitgedrukt miRNAs tussen verschillende groepen/samples. Voorspellen van miRNAs die gericht zijn op geselecteerde mRNAs of mRNAs die kunnen worden gericht door een selectieve miRNA hulpprogramma's online miRNA doel voorspelling, zoals PicTar, TargetScan 16 en 17 van de microkosmos 18 .
- Als aantekening of traject functionaalanalyse nodig is, dienen de voorspelde genen aan vindingrijkheid Pathway analyse (IPA) of DAVID.
4. Kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) van mRNAs en miRNAs
- qRT-PCR analyse van mRNA
- Extract RNA van 0.2-5 × 10 6 cellen met behulp van een commerciële totaal RNA isolatie kit die van kleine RNA herstellen kan, na de fabrikant ' s instructies. Omvatten een DNase ik behandeling stap.
- CDNA uit totaal RNA met een eerste fronten cDNA synthese systeem met behulp van oligo-dT primer synthetiseren.
- Kwantificeren van cDNA door qRT-PCR met passende primers, 2 x real-time PCR master mix met het volgende protocol: 95 ° C gedurende 15 s, 40 cycli van 94 ° C voor 10 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s.
- Het uitvoeren van data-acquisitie tijdens de stap van de uitbreiding 72 ° C en smeltende kromme analyse uitvoeren van 72 naar 95 ° C.
- qRT-PCR analyse van miRNA
- aliquoot RNA van de monsters bereid in stap 4.1.1.
- Reverse-transcriberen het RNA in cDNA. Gebruik een commerciële microRNA omgekeerde transcriptie kit, na de fabrikant ' s instructies.
- PCR in real time voor microRNA met behulp van een SYBR groen real-time PCR master mix met 250 nM volwassen miRNA voorwaartse inleidingen in combinatie met een universele omgekeerde primer uitvoeren.
- Dooi 2 x universele omgekeerde PCR Master Mix en miRNA-specifieke voorwaartse primer primer op kamertemperatuur. Vermeng de individuele oplossingen.
- Voorbereiden op een mix van de reactie als volgt een volume van 25 µL-per-well reactie (gebruikt in 96-wells-platen voor PCR):
2 x µL van het PCR Master Mix 12,5
miRNA toekomen inleidingen (2,5 μM) 2.5 µL
universele primer (2,5 μM) reverse 2.5 µL
RN ASE-vrije water5 µL - toevoegen 22,5 μL van reactie mix aan een 96-Wells PCR plaat. 2.5 µL van sjabloon cDNA (50 ng van de pg-3) toevoegen aan de afzonderlijke plaat putjes.
- Strak afdichting van de plaat-film. Centrifugeer de plaat voor 1 min op 1000 x g en kamertemperatuur.
- Plaats van de plaat in de real-time cycler en beginnen de volgende fietsen programma: 95 ° C gedurende 5 min, 40 cycli van 94 ° C voor 15 s, 55 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s.
- De ΔΔCt-methode voor data-analyse qRT-PCR met een werkblad gebruiken. Normaliseren van de uitdrukking van de relevante miRNAs uitdrukking van kleine nucleaire/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2 Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68, en Snord70/SNORD70.
- Statistische analyse
- uitvoeren van statistische analyse om te bepalen van de p-waarden door gekoppeld en ongepaarde Student ' s t - test met behulp van een werkblad en overwegen van p-waarden < 0,05 zoals aanzienlijke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van onze protocol, gezuiverd B cellen geplaatst met LPS (3 µg/mL) en IL-4 (5 ng/mL) voor 96 h 30-40% van MVO te IgG1 en ~ 10% van plasma celdifferentiatie kan veroorzaken. Na behandeling met HDI (500µM VPA), de CSR aan IgG1 verlaagd naar 10-20%, terwijl plasma celdifferentiatie tot ~ 2 daalde % (Figuur 1). HDI-gemedieerde remming van MVO was verder bevestigd door verminderde aantallen na recombinatie Iμ-Cγ1 en volwassen VH-DJH-afschriften van de Cγ1, die de stempels van voltooide MVO. Zoals gemeten door qRT-PCR, de uitdrukking van Aicda, die is van cruciaal belang voor MVO/SHM, Prdm1 en Xbp1, die belangrijk voor plasma celdifferentiatie zijn, werden getoond te worden geremd door VPA (Figuur 2).
De modulatie van mRNA uitdrukking door HDI in B cellen was zeer selectief. Zoals gemeten door de mRNA-seq in B cellen gestimuleerd met LP's en IL-4, slechts 0,3 procent van deze zeer uitgesproken mRNAs waren upregulated door HDI meer dan twee-voudige en slechts 0.36% van de zeer uitgesproken (> 20 kopieën/cel in B cellen zonder HDI behandeling) mRNAs, met inbegrip van Aicda, Prdm1, en Xbp1, werden gereduceerd door HDI meer dan 50% (Figuur 3).
De Downregulatie van Aicda, Prdm1en Xbp1 uitdrukking konden potentieel worden gemedieerd door miRNAs, die negatieve van genexpressie regulatoren. We geïdentificeerd met behulp van miRNA gericht voorspelling-tools (TargetScan.org, miRNA.org en miRbase.org), meerdere miRNAs die potentieel zijn op Aicda of Prdm1 gericht kunnen. De analyse van de miRNA-seq van miRNA profilering in B cellen behandeld met HDI of nihil is gebleken dat Hotel selectief upregulate Aicda - en Prdm1-gericht op miRNAs (figuren 4-6).
Figuur 1. Oppervlakte expressie van B-cel marker B220 oppervlakte antilichaam IgG1 en plasma-cel marker CD138 werden geanalyseerd door stroom cytometry.
B220+ IgG1+ cellen werden B cellen overgeschakeld naar IgG1. B220lageCD138+ cellen werden plasmacellen. Het percentage IgG1-switched B-cellen en plasmacellen van B-cellen gestimuleerd met LPS en IL-4 in het bijzijn van nihil of HDI (VPA, 500 M) voor 96 uur worden aangeduid als de nummers binnen de poorten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Expressie van kenmerken van voltooide MVO; oudere VHDJH-Cγ1 transcripties en recombinatie na Iμ-Cγ1 transcripten; en Aicda, Prdm1en Xbp1 werden geanalyseerd met qRT-PCR, genormaliseerd Cd79b uitgeschreven in een histogram getoond.
Genexpressie in B cellen gestimuleerd met LP's en IL-4 in het bijzijn van 500 µM VPA en relevant zijn voor de genexpressie in B cellen met de zelfde stimuli in het bijzijn van nihil werden afgebeeld als 1. De gegevens zijn afkomstig van drie onafhankelijke experimenten. p -waarden, gepaarde t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. B cellen werden gestimuleerd met LP's en IL-4 en behandeld met HDI (VPA, 500 µM) of nihil voor 60 h. mRNA uitdrukking werd geanalyseerd door mRNA-seq.
(A) de gemiddelde niveaus van de expressie van de mRNA in drie onafhankelijke experimenten (leest per kilobase per miljoen toegewezen leest, RPKMs) werden afgebeeld op de scatter percelen. Elk perceel komt overeen met één individuele mRNA uitdrukking niveau. De twee stippellijnen zijn dubbele lijnen. Scatter percelen gelegen boven de bovenste stippellijn of onder de onderste stippellijn aangeven mRNAs die uitdrukking geven aan meer dan twee keer of minder dan de helft als geïnduceerd door VPA en nil, respectievelijk. (B) de staafdiagrammen tonen de gemiddelde verandering in mRNA uitdrukking niveaus (gemiddelde RPKMs uit drie onafhankelijke experimenten) in LPS en IL-4-gestimuleerd B cellen HDI, behandeld in vergelijking met die in de B-cellen behandeld met nihil. Alleen de mRNAs op een gemiddelde RPKM > 20 LP's en IL-4-gestimuleerd B cellen behandeld met nihil zijn opgenomen. De uitdrukking van mRNA in elk afzonderlijk experiment, zoals blijkt uit een scatterplot (C) of een staafdiagram (D), zijn afgebeeld in de dezelfde manier als in (A) en (B). p -waarden, gepaarde t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. B cellen werden gestimuleerd met LP's en IL-4 en behandeld met HDI (VPA, 500 µM) of nul voor 60 h. miRNA expressie werd geanalyseerd door miRNA-seq.
(A) de verandering in de gemiddelde miRNA expressie niveaus in de B-cellen behandeld met HDI vergeleken met die in de B-cellen behandeld met nihil werden afgebeeld door staafdiagrammen. (B) de wijziging in de miRNA expressie niveaus in B-cellen behandeld met HDI vergeleken met die in de B-cellen behandeld met nihil in drie onafhankelijke experimenten werden afgebeeld door staafdiagrammen. Alleen de miRNAs bij gemiddelde RPM > 0,5 LP's en IL-4-gestimuleerd B cellen behandeld met nihil zijn opgenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. HDI verhoogt de uitdrukking van Aicda-gericht op miRNAs, zoals blijkt uit de miRNA-seq.
(A) sequentie alignering van de miRNAs en hun doel-sites in de 3-' UTR van Aicda mRNAs. (B) B-cellen werden gekweekt met LP's en IL-4 in de aanwezigheid of afwezigheid van HDI (VPA, 500 M) voor 60 h. De expressie van de miRNAs die zijn voorspeld te richten Aicda 3' UTR werden geanalyseerd door miRNA-seq en afgeschilderd als RPM. p -waarden, gepaarde t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. HDI verhoogt de uitdrukking van Prdm1-gericht op miRNAs, zoals blijkt uit de miRNA-seq.
(A) sequentie alignering van de miRNAs en hun doel-sites in de 3-' UTR van Prdm1 mRNAs. (B) B-cellen werden gekweekt met LP's en IL-4 in de aanwezigheid of afwezigheid van HDI (VPA, 500 M) voor 60 h. uitdrukking van de miRNAs die zijn voorspeld te richten Prdm1 3' UTR werden geanalyseerd door miRNA-seq en afgeschilderd als RPM. p -waarden, gepaarde t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt uitgebreide benaderingen om te induceren van B-cel klasse schakelen en plasma celdifferentiatie; voor het analyseren van de gevolgen daarvan door epigenetische modulatoren, namelijk HDI; en het effect van HDI op mRNA en miRNA expressie in deze cellen worden opgespoord. De meeste van deze benaderingen kan ook worden gebruikt voor het analyseren van de impact van epigenetische factor op menselijke expressie van B-cel functie en mRNA/miRNA. De qRT-PCR en mRNA-seq/miRNA-seq benaderingen kunnen ook worden gebruikt voor het analyseren van B-cellen die geïsoleerd van muizen met epigenetische modulatoren, zoals Hotel behandeld.
De epigenetische modulate mogelijk van invloed op veel verschillende cel-functies, zoals de celproliferatie en haalbaarheid, die invloed kan hebben op MVO en plasma cel differentiatie. Daarom, celproliferatie, levensvatbaarheid en de cel cycli van de B-cellen, met of zonder HDI behandeling, moet worden geanalyseerd. Een van de uitdagingen voor het analyseren van de modulatie van mRNA en miRNA expressie door HDI of andere epigenetische toezichthouders door qRT-PCR is het kiezen van een geschikte huishouding gen of kleine RNA. Vele gemeenschappelijke huishouding genen kunnen in verschillende mate worden gewijzigd door epigenetische modulatoren. De niveaus van de expressie van vele verschillende huishouding genen moeten worden gemeten en gebruikt om te normaliseren van de specifieke genexpressie door qRT-PCR. Dit probleem kan ook worden aangepakt door de mRNA-seq en miRNA-seq, waar de uitdrukking van individuele mRNAs of miRNAs kan worden genormaliseerd door de genoom-brede mRNA of miRNA niveaus.
mRNA-seq kan niet alleen het definiëren van het mRNA uitdrukking profiel met een passende bioinformatics pijpleiding, maar deze benadering kunt ook definiëren het lang noncoding RNA (lncRNA)-profiel. mRNA-seq betekent meestal dat de verrijking van poly(A) + RNAs door oligo(dT) selectie. Genoemd een aantal lncRNA zijn het ontbreken van poly(A) staarten, bepalen niet de aanpak van de mRNA-seq oligo (dT) selectie waarbij de volledige informatie van lncRNA expressie. Met het oog op een volledige dekking van zowel de lncRNA als de mRNA expressieprofielen, moet een benadering van de RNA-seq rRNA uitputting waarbij worden gebruikt. In de meeste van onze experimenten, we gebruiken een commerciële kit om het extract van de totale RNA, met inbegrip van miRNA, voor miRNA-seq, mRNA-seq en qRT-PCR. Voorafgaand aan de bouw van een high-throughput sequencing-bibliotheek, wordt de totale kwaliteit van RNA gevalideerd door een aliquoot gedeelte waarop een geautomatiseerd RNA, DNA en proteïne monster QC systeem. Het is aanbevolen dat RNA monsters een RIN aantal 7.0 of hoger als ze moeten worden gebruikt voor kleine RNA bibliotheek voorbereiding. Monsters met een lagere RIN nummers hebben een hoger percentage van aangetaste RNA-producten in de groottewaaier soorten kleine RNA (15-30 nucleotiden). Wanneer de RIN-nummer lager dan 7.0 is, de dekking niet zo goed zal zijn. Een andere optie voor minder-dan-ideale RNA samples is voor het uitvoeren van een rRNA uitputting aanpak in plaats van een benadering van de isolatie van mRNA, maar dit vereist dat de monsters ten minste 10 ng/mL worden.
De protocollen voor mRNA-seq hier gebruikt zijn geoptimaliseerd voor 100-1000 ng van totale RNA. Voor miRNA-seq met behulp van minder dan 100 ng van totale RNA, kleine bibliotheek voorbereiding van het RNA-seq moet volgen een gevoeliger kleine RNA-seq voorbereiding protocol, die van de natuurlijke structuur gemeenschappelijk voor de meeste bekende microRNA moleculen profiteert. Meest volwassen miRNAs hebben een 5'-fosfaat en een 3'-hydroxylgroep als gevolg van hun biogenese traject. Vanwege dit, de 3' en 5' adapters in deze kit ligatuur zijn rechtstreeks verbonden aan miRNAs.
Voor het analyseren van de impact van HDI op B-cel mRNA en miRNA expressie in vivo, kunnen muizen worden behandeld met VPA of andere Hotel door deze HDI toevoegen aan het drinkwater, en het intraperitoneaal injecteren van deze muizen met T-afhankelijke antigeen NP-CGG- of T-zelfstandige antigeen NP-LP's kan worden uitgevoerd. De B-cellen gezuiverd kunnen worden van de milt 10 dagen na vaccinatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH grants AI 105813 en AI 079705 (op PC), toekennen het Bondgenootschap voor Lupus onderzoek Target identificatie in Lupus Grant ALR 295955 (op PC), en het onderzoek van de artritis National Research Foundation (HZ). TS werd gesteund door de kindergeneeskunde Medical Center, tweede Xiangya ziekenhuis, centrale Zuid-Universiteit, Changsha (China), in het kader van het Xiangya-UT School van geneeskunde San Antonio medisch student bezoekende programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
