Summary
Des facteurs épigénétiques peuvent interagir avec les programmes génétiques de moduler l’expression des gènes et de réguler la fonction des cellules B. En combinant la stimulation in vitro de cellules B, qRT-PCR et haut débit micro-ARN-séquence et ordre d’ADN messagère approches, nous pouvons analyser la modulation épigénétique de miRNA et l’expression génique dans les cellules de B.
Abstract
Production d’anticorps est effectuées par plusieurs processus intrinsèques critique les lymphocytes B, dont le hypermutation somatique (SHM), classe-commutateur de recombinaison de l’ADN (RSE) et la différenciation des cellules de plasma. Ces dernières années, les modifications épigénétiques ou des facteurs tels que la désacétylation des histones et microARN (miARN), ont démontré d’interagir avec les programmes génétiques de cellules B pour la production d’anticorps forme, tandis que le dysfonctionnement des facteurs épigénétiques a été trouvé pour conduire à réponses d’auto-anticorps. Analysant le génome-large ARNm et miRNA expression dans les lymphocytes B en réponse aux modulateurs épigénétiques est importante pour comprendre la régulation épigénétique de la réponse anticorps et la fonction des lymphocytes B. Ici, nous démontrons un protocole pour induire des cellules B subissent une différenciation RSE et plasmocyte, traitant ces cellules B avec inhibiteurs d’histone désacétylase (HDAC) (IDH) et analyser l’expression d’ARNm et de micro-ARN. Dans ce protocole, nous analysons directement des séquences d’ADN (cDNA) complémentaires à l’aide de séquençage d’ADN messagère nouvelle génération (ARNm-seq) et technologies de miRNA-seq, cartographie du séquençage lit au génome et transcriptase inverse quantitative (qRT)-PCR. Avec ces approches, nous avons défini que, dans les cellules de B amenées à subir la RSE et la différenciation des cellules de plasma, HDI, un régulateur de l’épigénétique, sélectivement module l’expression de l’ARNm et miRNA et altère la différenciation RSE et plasmocyte.
Introduction
Marques épigénétiques ou facteurs tels que la méthylation de l’ADN et ARN non codants (y compris les microARN), modifications post-traductionnelles histone modulent la fonction des cellules en modifiant l' expression de gène1. Modifications épigénétiques régulent la fonction des lymphocytes B, tels que la recombinaison de l’ADN-l’interrupteur de la classe immunoglobuline (RSE), hypermutation somatique (SHM) et la différenciation de cellules B mémoire ou plasmocytes, modulant ainsi les anticorps et les auto-anticorps réponses2,3. RSE et SHM critique nécessitent déaminase cytidine induite par l’activation (aide, codé comme Aicda), qui est fortement induite dans les cellules en réponse à T-dépendante et d’antigènes T-indépendants4B. Cellules de B classe-commuté/hypermutated encore différencient en plasmocytes, qui sécrètent de grandes quantités d’anticorps de façon critique dépendante de la protéine induite par le lymphocyte B maturation 1 (Blimp1, codé comme Prdm1)5. Les changements épigénétiques anormaux dans les cellules de B peuvent entraîner des réponses anticorps/auto-anticorps aberrants, qui peuvent conduire à une réaction allergique ou d’auto-immunité1,4. Comprendre comment épigénétiques facteurs, tels que les miARN, moduler intrinsèques cellules B l’expression des gènes n’est pas seulement importante pour le développement de vaccins, mais il est également essentielle de révéler les mécanismes de réactions anticorps anormaux/auto-anticorps potentielles.
Désacétylation et l’acétylation des histones sont des modifications des résidus lysine sur histones généralement catalysées par acétyltransférase d’histone (HAT) et histone désacétylase (HDAC). Ces modifications conduisent à l’accessibilité croissante ou décroissante de la chromatine et encore autoriser ou empêchent la fixation de facteurs de transcription ou des protéines à l’ADN et l’altération du gène expression5,6, 7 , 8. inhibiteurs d’HDAC (HDI) sont une classe de composés qui interfèrent avec la fonction de HDACs. Ici, nous avons utilisé le HDI (APV) d’aborder la réglementation des HDAC sur le profil d’expression génique intrinsèque des cellules B et sur son mécanisme.
miARN est petites, non codantes RNAs environ 18 à 22 nucléotides de longueur qui sont générés par plusieurs étapes. miRNA hôte gènes sont transcrits et forment en épingle à cheveux microARN primaire (pri-miARN). Ils sont exportés vers le cytoplasme, où les pri-miARN est transformés en précurseur miARN (pré-miARN). Enfin, les miARN matures est formés par le clivage de la pré-miARN. miARN reconnaître les séquences complémentaires dans la région 3' non traduite de leurs cibles ARNm6,7. Par le biais de silence post-transcriptionnelle, miRNAs réguler l’activité cellulaire, tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose10,11. Étant donné que plusieurs miARN peut cibler le même ARNm, et un seul miRNA peut potentiellement cibler plusieurs ARNm, il est important d’avoir une vue dans le contexte du profil de l’expression de miRNA pour comprendre la valeur de l’individu et l’effet combiné des miARN. miARN ont été démontré d’être impliqués dans le développement des cellules B et différenciation des périphérique, ainsi que différenciation des lymphocytes B spécifiques au stade, réaction immunitaire et auto-immunité1,4,9. Dans la région 3' UTR de Aicda et Prdm1, il y a plusieurs sites évolutivement conservés validés ou prévisible pouvant être ciblées par les miARN8.
Modulation épigénétique, y compris la modification post-transcriptionnelle d’histone et miARN, afficher un modèle de règlement spécifique au stade de type cellulaire et cellules de gene expression9. Nous décrivons ici les méthodes pour définir la modulation induite par l’IDH de miRNA et expression ARNm, la RSE et la différenciation des cellules de plasma. Il s’agit de protocoles permettant d’induire des cellules B à subir la RSE et la différenciation des cellules de plasma ; pour traiter les cellules B avec HDI ; et pour analyser l’expression de l’ARNm et miRNA par qRT-PCR, miRNA-seq et ARNm-seq10,11,12,8,13.
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Protocol
le protocole suit les directives de protection des animaux de l’Institutional Animal soins et utilisation des comités de l’Université du Texas Health Science Center à San Antonio.
1. stimulation de cellules B de souris pour la RSE, la différenciation des cellules de Plasma et le traitement de HDI
- préparation des suspensions de cellules de rate
Remarque : Exécutez toutes les étapes dans une hotte à flux laminaire à l’exception de la souris l’euthanasie et la dissection.- Euthanasier le spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes C57BL/6J de souris (8-12 semaines d’âge) par inhalation de CO 2.
- Poser la souris sur dissection Conseil avec l’abdomen vers le haut. Épingler les quatre pattes de la souris avec aiguilles hypodermiques de calibre 18, 1,5 po.
- Stériliser la peau à l’aide de lingettes imbibées d’éthanol de 70 %.
- Utiliser un ensemble des outils chirurgicaux stérilisés à l’autoclave (pinces et ciseaux de dissection) pour couper à travers la peau juste en dessous de la cage thoracique pour visualiser la rate (sur le côté gauche de l’abdomen, juste en dessous du foie).
- Utiliser un autre pince stérile et ciseaux ciseaux pour extraire la rate, qui se trouve sous la grande courbure de l’estomac, de la rate de serrage doucement avec une pince et en coupant tout le tissu social avec dissection. N’oubliez pas d’enlever tout le tissu social.
- Placer la rate dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 1 000 µL de milieu RPMI1640 complet (milieu RPMI 1640 additionné de sérum de veau foetal inactivés par la chaleur de 10 % (SVF), 2 mM de L-glutamine, 100 µg/mL de pénicilline, 100 µg/mL streptomycine, 0,25 µg/mL d’amphotéricine B et 50 µM β-mercaptoéthanol).
- Placer une crépine de cellule de 70 µm dans un tube à centrifuger coniques en polypropylène 50 mL et versez la rate du tube microcentrifuge sur la crépine de la cellule. Utilisez la pointe d’un tube à centrifuger conique polypropylène 15 mL à écraser doucement la rate à travers la passoire. Rincer la crépine de la cellule avec 15 à 20 mL de milieu complet.
- Spin down les cellules à 350 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Enlever les globules rouges et les suspensions de cellules de rate. Resuspendre le culot dans tampon de lyse ACK (5 mL / rate). Incuber pendant 4 min à température ambiante en agitant occasionnellement et puis étancher avec 25 mL de milieu complet.
- Spin bas les cellules à 350 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 ou 10 mL de milieu complet. Compter les cellules viables utilisant un hémocytomètre.
- Isolement de cellules B
Remarque : cellules B isoler par sélection négative suivant le fabricant ' instructions de s. Cellules non-B sont destinés à un enlèvement avec anticorps biotinylé dirigés contre les cellules non B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) et TER119) et des particules magnétiques streptavidine. Tube fond rond de- préparer une suspension de cellules de 0,25 à 2 mL de 1 x 10 8 cellules/mL dans le milieu complet dans un polystyrène stériles 5 mL (12 x 75 mm). Ajoute l’échantillon de sérum de rat normal (50 µL/mL).
- Isolation de µL/mL ajouter 50 cocktail à l’échantillon. Les cellules de la composition de pipetage doucement vers le haut et vers le bas de 2 - 3 fois et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Ajouter 75 µL/mL streptavidine particules magnétiques à l’échantillon. Mélanger le mélange de pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois et laisser incuber pendant 2,5 min à température ambiante.
- Ajouter le milieu RPMI 1640 complet. Les cellules de la composition de pipetage doucement et descendre de 2 - 3 fois.
- Placer le tube (sans le couvercle) dans l’aimant et incuber à température ambiante pendant 2,5 min. Pour désactiver le surnageant contenant des cellules de B intactes dans un nouveau tube conique de 15 mL.
- Compter les cellules viables utilisant un hémocytomètre et une tache bleu Trypan. Évaluer la pureté des cellules B par analyse en cytométrie en flux de marqueurs de surface de cellules B, tels que B220 et CD19.
- Stimulation des lymphocytes B et traitement HDI
- remettre en suspension les cellules B purifiées en milieu RPMI 1640 complet à une concentration finale de 0,3 x 10 6 cellules/mL.
- Utiliser une plaque de culture de cellules de 48 puits de culture cellulaire. Pour chaque puits, ajouter 1 mL de suspension de cellules B purifiée (0,3 x 10 6 cellules/mL), LPS (concentration finale de 3 µg/mL) d’Escherichia coli, IL-4 (concentration finale de 5 ng/mL) et 0 ou 500 µM HDI (acide valproïque ; APV).
- Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 60 h pour qRT-PCR et l’analyse de haut débit ARNm et miRNA-séquençage, ou 96 h pour analyse en cytométrie en flux.
- Analyse d’écoulement cytometry de RSE et de la différenciation des cellules de plasma
- après 96 h de culture, détacher les cellules de chaque puits en pipettant également, les cellules de haut en bas plusieurs fois. Transférer la suspension de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Tournez en bas les cellules à 350 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules avec 100 µL de tampon HBSS contenant 1 % de BSA et 0,5 ng/mL (FITC) fluorescéine - chèvre conjugué anti anticorps d’IgM à la souris – (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-anti-souris conjugués rat IgG1 anticorps monoclonal Ab (mAb), 0,2 phycoérythrine ng/mL (PE)-conjugué rat anti-souris B220 mAb, 0,2 ng/mL PE-Cy7-conjugué rat anti-souris CD138 mAb et 2 ng/mL 7-Aminoactinomycine D (7-AAD).
- Incuber les cellules avec l’anticorps conjugué à fluorescence (étape 1.4.2) dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.
- Laver les cellules avec 1 mL de HBSS avec 1 % de BSA.
- Spin down les cellules à 1 500 g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 300 µL d’HBSS avec 1 % de BSA et transférer la suspension cellulaire dans un tube à fond rond en polystyrène. Couvrir le tube d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière.
- Perform analyse en cytométrie en flux sur une suspension de cellules individuelles. Recueillir 50 000 manifestations pour chaque échantillon de compensation et 250 000 pour les autres échantillons. Analyser les données à l’aide de matériel logiciels.
- Éliminer les débris et les doublets en utilisant une grille de géométrie de pouls (FSC-H x FSC-a et SSC-H x SSC-A). Gate convenablement l’intrigue sur 7-AAD pour exclure les cellules mortes.
2. High-Throughput ARNm-Seq
- après 60 h de culture, extraire l’ARN total de 2 à 4 × 10 6 cellules à l’aide d’un kit d’isolement total d’ARN qui peut récupérer les petits ARN suivant le fabricant ' instructions de s. Inclure une DNase I étape traitement.
- Vérifier l’intégrité de RNA à l’aide d’un bioanalyzer, suivant le fabricant ' instructions de s.
- Utiliser 500-1 000 ng d’ARN total de haute qualité (nombre de RNA intégrité RIN > 8.0) pour RNA-seq, préparation de la bibliothèque avec un ARN commercial échantillon pkit REP suivant le fabricant ' instructions de s.
- Mettre en commun les bibliothèques individuelles ARNm-seq issus de leurs portions respectives 6-bp index des cartes et les bibliothèques à 50 bp/séquence de séquences. Utiliser un système d’ADN de haut débit selon le fabricant ' protocoles de s.
- Après la manche de séquençage, démultiplexer avec CASAVA pour générer le fichier fastq pour chaque échantillon. Effectuer des lectures de cartographie et l’analyse bio-informatique, comme précédemment indiqué 11.
- Aligner toutes les lectures de séquençage avec leurs génomes de référence (UCSC souris génome build mm9) à l’aide de paramètres par défaut TopHat2 14. Traiter les fichiers de bam d’alignement à l’aide de HTSeq-comte d’obtenir les coups par gène dans tous les échantillons.
3. High-Throughput miRNA-Seq
- utilisation 100 ng-1 µg d’ARN total de haute qualité, tel qu’établi dans l’étape 2.1, pour petite fabrication de bibliothèque RNA-seq au moyen d’une petite trousse commerciale de RNA-seq.
- Ligate le dégénéré 3 ' adaptateur sur 5 ′ extrémités des petites molécules d’ARN départ avec un kit de ligature commerciales. Ligaturer le dégénéré 5 ' adaptateur sur les 3 ′ extrémités des petites molécules d’ARN départ avec un kit de ligature commerciales. Convertir l’ARN en ADNc par transcription inverse et amplifier la petite bibliothèque de RNA-seq par amplification PCR avec les kits commerciaux.
- Utilisez un gel des PAGE natif de 6 % TBE pour isoler la petite bibliothèque de RNA-seq finale. Exécutez le gel avec 1 tampon X TBE à 200 V, jusqu'à ce que le groupe de suivi de colorant bleu de bromophénol rapproche de l’extrémité du gel (0,5 - 1 cm).
- Retirer le gel sur les plaques de verre et coloration au bromure d’éthidium (0,5 µg/mL dans l’eau) dans un récipient propre pour 2-3 min. visualiser le gel des bandes sur un Transilluminateur UV ou un autre instrument de documentation gel.
- Coupe hors de la bande de ~ 150-bp à l’aide d’un rasoir propre et la placer dans un tube de 1,7 mL.
- Extraire l’ADN à l’aide d’un gel extraction kit selon les instructions du fabricant.
- Vérifier la granulométrie de la bibliothèque finale avec un test d’ADN de haute sensibilité commerciale et de la concentration avec un test d’ADN double brin commercial par les fabricants ' instructions.
- Mettre en commun les bibliothèques par amplification et un séquençage ultérieur exécutés avec un système commercial de séquençage de l’ADN de haut-débit par le fabricant ' protocoles de s.
- Démultiplexer avec CASAVA pour générer le fichier fastq pour chaque échantillon par le fabricant ' protocoles de s.
- Pour petite analyse de RNA-seq de chaque échantillon, utilisez scintillement pour petit alignement de RNA par le fabricant ' protocoles de s.
- Enlever les lectures qui sont alignées sur les contaminants, tels que les mitochondries, ARNr, apprêts, etc..
- Aligner les données pour mûrir des séquences de miRNA.
- Aligner les données à des séquences de boucle en épingle à cheveux (précurseur miRNA).
- Aligner les données à d’autres petits RNA séquences (en utilisant la base de données fRNA) 15.
- Une fois que tous les échantillons sont quantifiés, définir les miARN différentielle exprimée entre différents groupes/échantillons. Prévoir des miARN qui ciblent certains ARNm ou ARNm peut être ciblées par une miRNA sélectif à l’aide des outils de prédiction de cible en ligne miRNA, comme PicTar TargetScan 16 et microcosme 17 18 .
- Si l’annotation ou la voie de l’analyse fonctionnelle est nécessaire, soumettre les gènes prédits à l’analyse Ingenuity Pathway (IPA) ou DAVID.
4. RT-PCR quantitative (qRT-PCR) de l’ARNm et miRNAs
- qRT-PCR analyse d’ADN messagère
- ARN extrait de 0,2 à 5 × 10 6 cellules à l’aide d’un commercial kit d’isolement total d’ARN qui peut récupérer les petits ARN, suite à la Référence du fabricant ' instructions de s. Inclure une DNase I étape traitement.
- Faire la synthèse de cDNA de l’ARN total avec un système de synthèse de cDNA de premier-brin à l’aide d’amorces oligo-dT.
- Chiffrer cDNA par qRT-PCR avec des amorces appropriées, à l’aide de 2 x en temps réel mélange maître PCR avec le protocole suivant : 95 ° C pendant 15 s, 40 cycles de 94 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s.
- D’acquisition de données pendant l’étape de 72 ° C extension et effectuer l’analyse des courbes de fusion de 72 à 95 ° C.
- qRT-PCR analyse de miRNA
- RNA aliquote de l’échantillon préparé à l’étape 4.1.1.
- Reverse-transcrire l’ARN en ADNc. Utiliser un kit de transcription inverse commerciale microARN, suivant le fabricant ' instructions de s.
- Effectuer la PCR en temps réel pour les micro-ARN, à l’aide d’un mélange maître de SYBR Green sur PCR en temps réel avec 250 nM miARN matures avant des amorces en conjonction avec une amorce universelle inverse.
Apprêt
- dégel 2 x PCR Master Mix, miRNA spécifiques apprêt avant et arrière universel à température ambiante. Mélanger les solutions individuelles.
- Préparer un mélange de réaction comme suit pour un volume de 25 µL par puits réaction (utilisé en plaques PCR 96 puits) :
2 x PCR Master Mix 12,5 µL
miRNA transmettre amorces (2,5 μM) 2,5 µL
Universal reverse primer (2,5 μM) 2,5 µL
RN exempte d’ASE water5 µL - Ajouter 22,5 μl du mélange réactionnel à une plaque PCR 96 puits. Ajouter 2,5 µL de modèle cDNA (50 pg-3 ng) dans les puits individuels plaque.
- Sceller hermétiquement le film de la plaque. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 1 000 x g et la température de la pièce.
- Placer la plaque dans le cycler en temps réel et démarrer le programme de cyclisme suivant : 95 ° C pendant 5 min, 40 cycles de 94 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s.
- Utiliser la méthode ΔΔCt pour l’analyse de données qRT-PCR avec une feuille de calcul. Normaliser l’expression de la miARN pertinentes à l’expression des petit nucléaire/nucléolaire RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 et Snord70/SNORD70.
- Analyse statistique
- effectuer une analyse statistique pour déterminer les valeurs de p par appariés et non appariés étudiant ' s t - test à l’aide d’un tableur et prendre en considération les valeurs p < 0,05 comme significative.
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Representative Results
En utilisant notre protocole, purifié des cellules B placés au LPS (3 µg/mL) et IL-4 (5 ng/mL) pour 96 h peut induire des 30 à 40 % de la RSE à IgG1 et environ 10 % de la différenciation des cellules de plasma. Après le traitement avec l’IDH (500µM APV), la RSE à IgG1 a diminué de 10 à 20 %, tandis que la différenciation des cellules de plasma a diminué à environ 2 % (Figure 1). Inhibition de la RSE par HDI a été confirmée par une diminution après recombinaison Iμ-Cγ1 et mature VHDJH-des transcriptions de Cγ1, qui sont les maîtres mots de la RSE dûment rempli. Tel que mesuré par qRT-PCR, l’expression Aicda, ce qui est essentiel pour la RSE/SHM et Prdm1 et Xbp1, qui sont importantes pour la différenciation des cellules de plasma, se sont révélés être inhibée par l’APV (Figure 2).
La modulation de l’expression de l’ARNm par HDI dans les cellules de B a été très sélective. Tel que mesuré par l’ARNm-seq dans les cellules de B stimulées par LPS et IL-4, seulement 0,3 % de ces ARNm fortement exprimés étaient surexprimés par HDI plus de deux fois et seulement 0,36 % de la fortement exprimée (> 20 copies/cellulaire dans les cellules de B sans traitement HDI) mRNA, y compris Aicda, Prdm1, et Xbp1, ont été réduites de HDI plus de 50 % (Figure 3).
La diminution de l’expression de Aicda, Prdm1et expression Xbp1 pourrait potentiellement être médiée par miARN, qui est des régulateurs négatifs de l’expression génique. À l’aide de miRNA ciblant les outils de prédiction (TargetScan.org, miRNA.org et miRbase.org), nous avons identifié plusieurs miARN pouvant potentiellement cibler Aicda ou Prdm1. L’analyse de miRNA-seq de miRNA profilage en cellules B traités avec HDI ou Néant a montré qu’IDH sélectivement réguler positivement Aicda - et Prdm1 -ciblage des miARN (Figures 4 à 6).
Figure 1. Expression à la surface des cellules B marqueur B220, surface anticorps IgG1 et marqueur plasmocyte CD138 ont été analysés par cytométrie en flux.
B220+ IgG1+ les cellules sont des cellules de B passés à IgG1. B220faibleCD138+ les cellules sont des cellules plasmatiques. Le pourcentage de cellules de commutation IgG1 B et les plasmocytes de cellules de B stimulées par LPS et IL-4, en présence du néant ou HDI (APV, 500 M) pendant 96 h sont indiquées par les chiffres dans les portes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Expression des caractéristiques de la RSE dûment rempli ; mature VHDJH-Cγ1 relevés de notes et relevés de notes après recombinaisons Iμ-Cγ1 ; et Aicda, Prdm1, Xbp1 ont été analysés par qRT-PCR, normalisée à Cd79b transcriptions et montré dans un histogramme.
L’expression des gènes dans les cellules de B stimulées par LPS et IL-4 en présence de 500 µM APV et pertinents pour l’expression du gène b cellules avec les mêmes stimuli en présence du néant sont dépeints comme 1. Les données proviennent de trois expériences indépendantes. les valeurs de p , appariés t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Cellules B ont été stimulées par LPS et IL-4 et traitement avec HDI (APV, 500 µM) ou zéro pour l’expression de l’ARNm h. 60 a été analysée par l’ARNm-suiv.
(A) moyenne taux d’ARNm expression trois expériences indépendantes (lectures par kilobases par million mappés lectures, RPKMs) est représentées dans les diagrammes de dispersion. Chaque parcelle correspond à un niveau individuel d’expression des ARNm. Les deux lignes en pointillés sont double lignes. Disperser les parcelles situées au-dessus de la ligne en pointillés haut ou du bas pointillés indiquent les ARNm qui expriment deux fois plus ou moins de la moitié quand induit par l’APV et le néant, respectivement. (B) les graphiques à barres montrant la variation moyenne des taux de l’expression d’ARNm (moyennes RPKMs de trois expériences indépendantes) LPS ou stimulée par IL-4 B traités avec HDI, comparativement à ceux des cellules B des cellules traitées avec néant. Seulement les ARNm à une moyenne RPKM > 20 en LPS et stimulée par IL-4 B, les cellules traitées avec le néant sont inclus. L’expression de l’ARNm dans chaque expérience individuelle, tel qu’illustré par un nuage de points (C) ou un graphique à barres (D), sont représentés de la même manière comme dans (A) et (B). les valeurs de p , appariés t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Cellules B ont été stimulées par LPS et IL-4 et traitement avec HDI (APV, 500 µM) ou zéro pour l’expression de 60 h. miRNA a été analysée par miRNA-suiv.
(A) le changement dans les niveaux d’expression de miRNA moyenne B cellules traitées avec HDI par rapport à qui, dans les cellules de B, traitée avec zéro sont dépeints par les graphiques à barres. (B) le changement dans les niveaux d’expression de miRNA b cellules traitées avec HDI par rapport dans les cellules B traitées avec néant en trois expériences indépendantes sont représentées par des graphiques à barres. Seulement les miARN au moyen tr/min > 0,5 en LPS et stimulée par IL-4 B, les cellules traitées avec le néant sont inclus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 5. IDH augmente l’expression de Aicda -ciblant les miARN, tel qu’illustré par miRNA-suiv.
(A) alignement de séquence le miARN et leurs sites cibles dans la région 3' UTR des ARNm Aicda . (B) lymphocytes B ont été cultivés avec LPS et IL-4, en présence ou en absence de HDI (APV, 500 M) pour 60 h. L’expression de la miARN qui ont été prédites pour cibler Aicda 3' UTR ont été analysés par miRNA-seq et dépeinte comme tr/min. les valeurs de p , appariés t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 6. IDH augmente l’expression de Prdm1 -ciblant les miARN, tel qu’illustré par miRNA-suiv.
(A) séquence alignement les miARN et leurs sites cibles dans la région 3' UTR des ARNm de Prdm1 . (B) lymphocytes B ont été cultivées avec LPS et IL-4 en présence ou en absence de HDI (APV, 500 M) pour 60 h. Expression de la miARN qui ont été prédites pour cibler les Prdm1 3' UTR ont été analysés par miRNA-seq et dépeinte comme tr/min. les valeurs de p , appariés t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole prévoit des approches globales pour induire la commutation de classe B cellulaire et la différenciation des cellules de plasma ; d’analyser leur impact par des modulateurs épigénétiques, nommément HDI ; et pour détecter l’effet du HDI sur l’expression de l’ARNm et miRNA dans ces cellules. La plupart de ces approches permet également d’analyser l’impact des facteurs épigénétiques sur expression humaine de B-cellule fonction et ARNm/miRNA. Les qRT-PCR et les approches de l’ARNm-seq/miRNA-seq peuvent également servir à analyser B cellules isolées de souris traitées avec des modulateurs épigénétiques, tels que l’IDH.
Le modulate épigénétiques peut-être avoir un impact beaucoup de fonctions cellulaires, tels que la prolifération cellulaire et de la viabilité, qui pourrait affecter la différenciation RSE et plasmocyte. Par conséquent, la prolifération cellulaire, la viabilité et les cycles cellulaires des cellules B, avec ou sans traitement de HDI, doivent être analysées. Un des défis pour l’analyse de la modulation de l’expression de l’ARNm et miRNA par HDI ou autres régulateurs épigénétiques par qRT-PCR est de choisir un gène de ménage adapté ou un petit ARN. De nombreux gènes communs de ménage peuvent être modifiées à des degrés divers par des modulateurs épigénétiques. Les niveaux d’expression de nombreux gènes de ménage différents devraient être mesurées et utilisées pour normaliser l’expression de gènes spécifiques par qRT-PCR. Ce problème peut également être adressé par l’ARNm-seq et miRNA-seq, où l’expression des ARNm individuels ou miARN peut être normalisée par les niveaux d’ARNm ou miRNA Génome-large.
ARNm-seq peut définir pas uniquement le profil d’expression ARNm avec un pipeline de bioinformatique approprié, mais cette approche peut également définir le profil de RNA (lncRNA) longtemps non codant. ARNm-seq implique généralement l’enrichissement de l’ARN poly (a) + par oligo (décollement) sélection. Qu’un certain nombre de lncRNA sont connues à l’absence de queue poly (a), l’approche de l’ARNm-seq impliquant la sélection oligo (dT) ne peut pas déterminer l’ensemble des informations d’expression lncRNA. Afin d’obtenir une couverture complète des profils d’expression des ARNm et de lncRNA, une approche de RNA-seq impliquant l’appauvrissement ARNr doit être utilisée. Dans la plupart de nos expériences, nous utilisons une trousse commerciale pour extraire l’ARN total, y compris de miRNA, miRNA-seq, ARNm-seq et qRT-PCR. Avant la construction d’une bibliothèque de séquençage haut débit, la qualité totale de RNA est validée en exécutant une partie aliquote sur un ARN, ADN et protéines échantillon QC automatisme. Il est recommandé que les échantillons d’ARN ont une RIN numéro de 7.0 ou plu si elles doivent être utilisées pour la préparation de bibliothèque petite ARN. Échantillons avec un plus faible nombre RIN ont un pourcentage plus élevé de produits dégradés de RNA dans la gamme des petites espèces d’ARN (15-30 nucléotides). Lorsque le nombre RIN est inférieur à 7,0, la couverture ne sera pas aussi bonne. Une autre option pour les échantillons d’ARN de moins-que-idéal est d’effectuer une approche de l’appauvrissement des ARNr plutôt qu’une approche d’isolement d’ARNm, mais cela exige que les échantillons soient au moins 10 ng/mL.
Les protocoles des ARNm-seq utilisés ici sont optimisés pour 100-1 000 ng d’ARN total. Pour miRNA-seq en utilisant moins de 100 ng d’ARN total, petite préparation de bibliothèque de RNA-seq doit se conformer un plus sensible petit RNA-seq préparation protocole, qui tire profit de la structure naturelle commune à la plupart des molécules connues de micro-ARN. MiARN plus matures ont une 5'-phosphate et un groupe hydroxyle en 3' par suite de leur voie de biogenèse. Pour cette raison, les adaptateurs de 3' et 5' de ce kit sont directement ligaturés à miARN.
Pour analyser l’impact du HDI sur la B-cellule de l’ARNm et miRNA expression in vivo, les souris peuvent être traitées avec APV ou autres HDIs en ajoutant ce HDI à l’eau potable et l’injection intrapéritonéale de ces souris avec l’antigène T-dépendante NP-CGG ou T-indépendants antigène NP-LPS peut être effectuée. Les cellules de B peuvent être purifiés de la rate, 10 jours après la vaccination.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH subventions 105813 AI et AI 079705 (pour PC), l’Alliance pour l’Identification des cibles recherche Lupus dans le Lupus Grant ALR 295955 (pour PC) et la recherche de l’arthrite National Research Foundation accorde (à HZ). TS a été soutenu par le centre médical de pédiatrie, Université de South Central, seconde Xiangya hôpital, Changsha (Chine), dans le cadre du programme visite Xiangya-UT l’école de médecine San Antonio étudiant en médecine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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