Summary
Epigenetic faktorer kan samhandle med genetiske programmer å modulere genuttrykk og regulere B celle-funksjonen. Ved å kombinere i vitro B-celle stimulering, qRT PCR, og høy gjennomstrømming microRNA-sekvens og mRNA-sekvens tilnærminger, kan vi analysere epigenetic modulering av miRNA og gene uttrykk i B-celler.
Abstract
Antistoff svar er oppnådd gjennom flere kritiske B celle-innebygde prosesser, inkludert somatisk hypermutation (SHM), klasse-bryteren DNA rekombinasjon (CSR) og plasma celledifferensiering. De siste årene, har epigenetic endringer eller faktorer, som histone deacetylation og microRNAs (miRNAs), vist å samhandle med B-celle genetiske programmer til å forme antistoff reaksjoner, mens dysfunction epigenetic faktorer har funnet for å føre til autoantibody svar. Analysere genomet hele miRNA og mRNA uttrykk i B-celler svar epigenetic modulatorer er viktig for å forstå epigenetic regulering av B-celle funksjon og antistoff respons. Her viser vi en protokoll for inducing B celler gjennomgå CSR og plasma celle differensiering, behandle disse B-cellene med histone deacetylase (HDAC) hemmere (HDIs) og analysere mRNA og microRNA. I denne protokollen, vi direkte analyserer komplementære DNA (cDNA)-sekvenser med neste generasjons mRNA sekvensering (mRNA-seq) og miRNA-seq teknologier, kartlegging av sekvensering leser til Genova og kvantitative omvendt transkripsjon (qRT)-PCR. Med disse tilnærmingene, har vi definert, B celler overtalt til å gjennomgå CSR og plasma celledifferensiering, HDI, en epigenetic regulator, selektivt modulerer miRNA og mRNA uttrykk og endrer CSR og plasma celle differensiering.
Introduction
Epigenetic merker eller faktorer, slik som DNA metylering, histone posttranslational modifikasjoner og ikke-koding RNAs (inkludert microRNAs), modulerer funksjonen celle ved å endre gene expression1. Epigenetic endringer regulere B-lymfocytt funksjon, for eksempel immunglobulin klasse-bryteren DNA rekombinasjon (CSR), somatisk hypermutation (SHM) og differensiering minne B-celler eller plasma celler, og dermed modulerende antistoff og autoantibody svar2,3. CSR og SHM krever kritisk aktivering-indusert cytidine deaminase (AID, kodes som Aicda), som er svært indusert i B-celler som svar på T-avhengige og T-uavhengig antigener4. Klasse-byttet/hypermutated B celler ytterligere skille ut plasma celler, som skiller ut store mengder av antistoffer i mote kritisk avhengig av B-lymfocytt-indusert modning protein 1 (Blimp1, kodes som Prdm1)5. Unormal epigenetic endringer i B celler kan føre avvikende antistoff/autoantibody svar, som kan føre til allergisk reaksjon eller autoimmunitet1,4. Forstå hvordan epigenetic faktorer, for eksempel miRNAs, modulerer B celle-innebygde genuttrykk er ikke bare viktig for vaksine, men er også viktig å avsløre mekanismer for potensielle unormal antistoff/autoantibody svar.
Histone acetylation og deacetylation er modifikasjoner av lysin rester på histone proteiner vanligvis katalysert av histone acetyltransferase (HAT) og histone deacetylase (HDAC). Disse endringene føre til økende eller fallende tilgjengeligheten av chromatin og videre tillate eller forby binding av transkripsjonsfaktorer eller proteiner DNA og endring av gene expression5,6, 7 , 8. HDAC hemmere (HDI) er en klasse av stoffer som forstyrrer funksjonen til HDACs. Her brukte vi HDI (VPA) for å ta regulering av HDAC på profilen for expression iboende genet av B-celler og dens mekanikk.
miRNAs er små, ikke-koding RNAs ca 18 til 22 nukleotider i lengde som genereres gjennom. miRNA vert gener er transkribert og danne hårnål primære microRNAs (pri-miRNAs). Eksporteres til cytoplasma, der pri-miRNAs behandles videre til forløperen miRNAs (pre-miRNAs). Til slutt, eldre miRNAs er dannet gjennom i spalting av pre-miRNAs. miRNAs gjenkjenner den komplementære sekvenser i 3 uoversatt regionen deres mål mRNAs6,7. Gjennom post-transcriptional stanse, regulere miRNAs cellular aktivitet, for eksempel spredning og differensiering apoptose10,11. Siden flere miRNAs kan målrette den samme mRNA, og én enkelt miRNA kan potensielt målrette flere mRNAs, er det viktig å ha en i kontekst visning av miRNA uttrykk profilen å forstå verdien av individuelle og kollektive effekten av miRNAs. miRNAs har vist seg å være involvert i B-celle utvikling og eksterne differensiering, som B-celle scenen-spesifikke differensiering, antistoffet svaret og autoimmunitet1,4,9. I den 3' UTR Aicda og Prdm1finnes det flere validert eller spådd evolusjonært konserverte områder som kan målrettes av miRNAs8.
Epigenetic modulasjon, herunder histone etter transkripsjon endring og miRNAs, vise en celle-type og celle scenen-spesifikke regulering mønster av gene expression9. Her beskriver vi metoder for å definere HDI-mediert modulering miRNA og mRNA uttrykk, CSR, og plasma celledifferensiering. Disse inkluderer protokoller for inducing B celler gjennomgå CSR og plasma celledifferensiering; for behandling av B-celler med HDI; og for å analysere miRNA og mRNA uttrykk av qRT PCR og miRNA-seq mRNA-seq10,11,12,8,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollen følger retningslinjene som dyr omsorg The institusjon dyr og bruk komiteer ved University of Texas Health Science Center til San Antonio.
1. stimulering av musen B celler for CSR, plasmacelle differensiering og HDI behandling
- utarbeidelse av milten celle suspensjoner
Merk: alle trinnene i laminær strømning hette bortsett fra musen Eutanasi og disseksjon.- Euthanize bestemt patogen-fri C57BL/6J mus (8-12 ukens av alderen) av CO 2 innånding.
- Lå musen dissecting ombord med magen vendt oppover. Feste alle fire feet av musen med 18-gauge, 1.5 - i sprøyte nåler.
- Sterilisere huden med 70% etanol-gjennomvåt kluter.
- Bruke ett sett autoklaveres kirurgiske verktøy (tang og dissecting saks) for å skjære gjennom huden rett under brystkasse å visualisere milten (på venstre side av magen, rett under leveren).
- Bruker en annen sterilt tang og saks å trekke milten, som ligger under større kurvatur av magen, ved clamping milten forsiktig med tang og kutte av alle tilkobling vev med dissekere saks. Sørg for å fjerne alle tilkobling vev.
- Plasser milten i en 1.5-mL microcentrifuge rør som inneholder 1000 µL av komplett RPMI1640 medium (RPMI 1640 medium supplert med 10% inaktivert fosterets kalv serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 µg/mL penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 0,25 µg/mL amfotericin B og 50 µM β-mercaptoethanol).
- Plasserer en 70-µm celle sil i en 50-mL polypropylen konisk sentrifuge rør og hell milten fra microcentrifuge røret på cellen silen. Bruk spissen av en 15 mL polypropylen konisk sentrifuge tube å forsiktig mash milten gjennom silen. Skyll celle silen med 15 til 20 mL komplett medium.
- Nedspinning cellene på 350 x g for 5 min og Forkast nedbryting.
- Fjerne røde blod celler fra milt celle suspensjoner. Resuspend celle pellet i ACK lyseringsbuffer (5 mL per milt). Ruge for 4 min ved romtemperatur med sporadiske risting og deretter slukke med 25 mL komplett medium.
- Spinn ned cellene på 350 x g i 5 min og forkaste nedbryting. Resuspend celle pellet i 1 eller 10 mL av komplett medium. Telle levedyktig celler ved hjelp av en hemocytometer.
- B-celle isolasjon
Merk: isolere B celler av negative utvalg etter produsenten ' s instruksjoner. Non-B-celler er målrettet for fjerning med biotinylated antistoffer rettet mot ikke-B celler (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) og TER119) og streptavidin-belagt magnetiske partikler.- Forberede en 0,25 til 2 mL celle suspensjon av 1 x 10 8 celler/mL i fullstendig medium i et sterilt 5 mL (12 x 75 mm) isopor runde bunn tube. Legge vanlig rotte serum (50 µL/mL) til prøven.
- Legge til 50 µL/mL isolasjon cocktail til prøven. Bland cellene ved forsiktig pipettering opp og ned 2 - 3 ganger og ruge ved romtemperatur for 10 min.
- Legge til 75 µL/mL streptavidin-belagt magnetiske partikler til prøven. Bland blandingen av pipettering forsiktig opp og ned 2 - 3 ganger og Inkuber for 2,5 min ved romtemperatur.
- Legge til fullstendig RPMI 1640 medium. Bland cellene ved forsiktig pipettering opp og ned 2 - 3 ganger.
- Sett røret (uten lokk) i magneten og Inkuber ved romtemperatur for 2,5 min. hell av nedbryting som inneholder urørt B-celler i en ny 15-mL konisk tube.
- Telle levedyktig celler ved hjelp av en hemocytometer og Trypan blå flekken. Vurdere renheten av B-cellene ved flyt cytometri analyse av B-celle overflate markører, som B220 og CD19.
- B-celle stimulering og HDI behandling
- Resuspend renset B-cellene i fullstendig RPMI 1640 medium i en siste konsentrasjon av 0.3 x 10 6 celler/mL.
- Bruker en 48-vel celle kultur plate for cellekultur. For hver brønn, legge 1 mL av renset B-celle suspensjon (0,3 x 10 6 celler/mL), plater (3 µg/mL siste konsentrasjon) fra Escherichia coli, IL-4 (5 ng/mL siste konsentrasjon) og 0 eller 500 µM HDI (valproic acid; VPA).
- Ruge cellene på 37 ° C og 5% CO 2 for 60 h for qRT PCR og høy gjennomstrømming mRNA - og miRNA-sekvensering analyse eller 96 h for flyt cytometri analyse.
- Flow cytometri analyse av CSR og plasma celle differensiering
- etter 96 h kultur, koble cellene fra hver brønn av pipettering cellene opp og ned flere ganger. Overføre celle suspensjon i en 1.5-mL microcentrifuge tube. Nedspinning cellene på 350 x g i 5 min med en benk toppen sentrifuge og kast nedbryting.
- Resuspend cellene med 100 µL HBSS bufferen som inneholder 1% BSA og 0,5 ng/mL fluorescein (FITC) - konjugert geit anti - mus IgM antistoffer (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-konjugert rotte anti-musen IgG1 monoklonale Ab (mAb), 0,2 ng/mL phycoerythrin (PE)-konjugert rotte anti-musen B220 mAb og 0,2 ng/mL PE-Cy7-konjugerte rotte anti-musen CD138 mAb 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Inkuber cellene med fluorescens-konjugerte antistoffer (trinn 1.4.2) i mørket ved romtemperatur for 30 min.
- Vask cellene med 1 mL av HBSS med 1% BSA.
- Nedspinning cellene på 1500 x g i 5 min bruker Borstemmaskin sentrifuge og Forkast nedbryting.
- Resuspend cellene i 300 µL av HBSS med 1% BSA og overføre celle suspensjon slik runde bunn polystyren. Dekke røret med folie å unngå lyseksponering.
- Utføre flyt cytometri analyse av en enkeltcelle suspensjon. Samle 50.000 hendelser for hver erstatning prøve og 250.000 hendelser for andre prøvene. Analysere dataene med utstyr programvare.
- Eliminere rusk og doublets ved hjelp av en puls geometri gate (FSC-H x FSC-A og SSC-H x SSC-A). Riktig gate plottet på 7-AAD utelate døde celler.
2. Høy gjennomstrømming mRNA-Seq
- etter 60 h av kultur, pakke ut den totale RNA fra 2-4 × 10 6 celler med en total RNA isolering kit som kan gjenopprette liten RNA etter produsenten ' s instruksjoner. Inkluderer en DNase jeg behandling trinn.
- Kontrollere RNA integriteten ved hjelp av en bioanalyzer, etter produsenten ' s instruksjoner.
- Bruke 500-1000 ng av høy kvalitet totalt (RNA integritet nummer RIN > 8.0) for RNA-seq biblioteket forberedelser med en kommersiell RNA prøve pRep kit etter produsenten ' s instruksjoner.
- Pool personlige mRNA-seq bibliotekene basert på sine respektive 6-bp indeks deler av kortene og sekvens bibliotekene på 50 bp/sekvens. Bruke en høy gjennomstrømming DNA ifølge produsenten ' s protokoller.
- Etter sekvensering kjøre, demultiplex med Casanova generere filen fastq for hvert utvalg. Utføre leser kartlegging og bioinformatikk analyse, som tidligere beskrevet 11.
- Justerer alle sekvensering leser med deres referanse genomer (UCSC musen genomet bygge mm9) bruk TopHat2 standard innstillinger 14. Bam filene fra justering bruker HTSeq-antall hente teller per genet i alle prøvene.
3. Høy gjennomstrømming miRNA-Seq
- Bruk 100 ng-1 µg av høy kvalitet totale som utarbeidet i trinn 2.1, for små RNA-seq biblioteket forberedelse ved hjelp av en kommersiell liten RNA-seq kit.
- Ligate degenerert 3 ' kortet på 5 ′ endene av starter små RNA molekyler med en kommersiell ligation kit. Ligate degenerert 5 ' kortet på 3 ′ endene av starter små RNA molekyler med en kommersiell ligation kit. Konvertere RNA til cDNA med omvendt transkripsjon og forsterke det lille RNA-seq-biblioteket av PCR forsterkning med kommersielle kits.
- Bruker en 6% TBE innfødt siden gel for å isolere det siste lille RNA-seq-biblioteket. Kjøre gel med 1 X TBE buffer 200 V til bromophenol blå sporing fargestoff bandet nærmer seg bunnen av gel (0,5 - 1 cm).
- Fjern gel fra glassplater og flekker med ethidium bromide (0,5 µg/mL i vann) i en ren beholder for 2-3 min. Visualiser gel band på en UV-transilluminator eller en annen gel dokumentasjon instrument.
- Kutte ut ~ 150-bp bandet med en ren barberhøvel og legg den i en 1,7 mL tube.
- Ekstra DNA ved hjelp av en gel utvinning kit per instruksjonene fra produsenten.
- Sjekk størrelsesDistribusjon av siste biblioteket med en kommersiell høy følsomhet DNA analyse og konsentrasjonen med en kommersiell dsDNA analysen per produsenter ' instruksjoner.
- Pool bibliotekene for forsterkning og en påfølgende sekvensering kjører med en kommersiell høy gjennomstrømming DNA sekvensering system per produsenten ' s protokoller.
- Demultiplex med Casanova generere filen fastq for hvert utvalg per produsenten ' s protokoller.
- For små RNA-seq analyse av hver prøve, bruker flimmer for små RNA justeringen per produsenten ' s protokoller.
- Fjerne leser som er justert til forurensning, for eksempel mitokondriene, rRNA, primere, og så videre.
- Juster data modne miRNA sekvenser.
- Justere data til hårnål loop sekvenser (forløper miRNA).
- Juster data til andre små RNA-sekvenser (gjennom fRNA databasen) 15.
- Etter alle prøvene er kvantifisert, definere differensial uttrykt miRNAs mellom ulike grupper/samples. Forutsi miRNAs som mot valgte mRNAs eller mRNAs som kan målrettes etter en selektiv miRNA bruke online miRNA målet prediksjon verktøy som TargetScan 16, mikrokosmos 17 og PicTar 18 .
- Hvis merknaden eller sti funksjonsanalyse kreves, sende spådd genene oppfinnsomhet sti analyse (IPA) eller DAVID.
4. Kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) av mRNAs og miRNAs
- qRT PCR analyse av mRNA
- ekstra RNA fra 0,2-5 × 10 6 celler ved hjelp av en kommersiell totale RNA isolering kit som kan gjenopprette liten RNA, etter den produsenten ' s instruksjoner. Inkluderer en DNase jeg behandling trinn.
- Syntetisere cDNA fra totalt RNA med en første-strand cDNA syntese bruker oligo-dT primer.
- Kvantifisere cDNA av qRT PCR med riktig primer, 2 x sanntid PCR master blanding med følgende protokollen: 95 ° C i 15 s, 40 sykluser av 94 ° C for 10 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C for 30 s.
- Utføre datainnsamling i 72 ° C forlengelsen trinn og utføre smeltende curve analyse fra 72 til 95 ° C.
- qRT PCR analyse av miRNA
- Aliquot RNA fra prøvene i trinn 4.1.1.
- Omvendt-transkribere RNA i cDNA. Bruk en kommersiell microRNA omvendt transkripsjon kit, etter produsenten ' s instruksjoner.
- Utføre sanntid PCR for microRNA med en SYBR grønn sanntid PCR master mix med 250 nM modne miRNA frem primere i forbindelse med en universell omvendt primer.
- Tøvær 2 x PCR Master Mix, miRNA-spesifikke frem primer og universell omvendt primer ved romtemperatur. Bland de individuelle løsningene.
- Forberede en reaksjonen blanding som følger et 25 µL-per-godt reaksjon volum (brukt i 96-brønnen PCR plater):
2 x PCR Master Mix 12,5 µL
miRNA videresende primere (2,5 μM) 2.5 µL
Universal reversere primer (2,5 μM) 2.5 µL
RN ASE-fri water5 µL - legge 22,5 μL reaksjonen blanding til en 96-brønns PCR plate. Legge til 2,5 µL av malen cDNA (50 pg-3 ng) personlige plate brønnene.
- Sel tett plate filmen. Sentrifuge platen i 1 min på 1000 x g og romtemperatur.
- Plasser platen i sanntid cycler og starte følgende sykling program: 95 ° C i 5 min, 40 sykluser av 94 ° C for 15 s, 55 ° C for 30 s og 72 ° C for 30 s.
- Bruke metoden ΔΔCt for qRT PCR dataanalyse i et regneark. Normalisere uttrykk for den aktuelle miRNAs til uttrykk for små kjernefysiske/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 og Snord70/SNORD70.
- Statistisk analyse
- utføre statistiske analyser for å avgjøre p-verdier sammen og unpaired Student ' s t - test bruker et regneark og vurdere p verdiene < 0,05 som betydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker våre protokollen, renset B celler plassert med LPS (3 µg/mL) og IL-4 (5 ng/mL) for 96 h kan indusere 30-40% av CSR til IgG1 og ~ 10% av plasma celledifferensiering. Etter behandling med HDI (500µM VPA), CSR til IgG1 redusert til 10-20%, mens plasma celledifferensiering redusert til ~ 2% (figur 1). HDI-mediert hemming av CSR ble ytterligere bekreftet av redusert antall etter rekombinasjon Iμ-Cγ1 og modne VHDJH-Cγ1 transkripsjonene, som er kjennemerkene til ferdigutfylte CSR. Målt ved qRT PCR, uttrykk for Aicda, som er avgjørende for CSR/SHM, og Prdm1 og Xbp1, som er viktig for plasma celledifferensiering, ble vist å være hemmet av VPA (figur 2).
Modulering av mRNA uttrykk av HDI i B-cellene var svært selektive. Målt ved mRNA-seq i B celler stimulert med plater og IL-4, bare 0,3% av disse svært uttrykt mRNAs var upregulated av HDI mer enn to ganger, og bare 0,36% av svært uttrykt (> 20 Kopier/cell i B-celler uten HDI behandling) mRNAs, inkludert Aicda, Prdm1, og Xbp1, ble redusert med HDI mer enn 50% (Figur 3).
Downregulation av Aicda, Prdm1og Xbp1 uttrykk kan potensielt være formidlet av miRNAs, som er negativ regulatorer av genuttrykk. Ved å bruke miRNA målretting prediksjon verktøy (TargetScan.org, miRNA.org og miRbase.org), identifiserte vi flere miRNAs som kan potensielt mot Aicda eller Prdm1. MiRNA-seq analyse av miRNA profilering i B-cellene behandlet med HDI eller null viste at HDIs selektivt upregulate Aicda - og Prdm1 -målretting miRNAs (tall 4-6).
Figur 1. Overflate uttrykk for B-celle trådkorsmarkør B220, overflate antistoff IgG1 og plasmacelle CD138 ble analysert av flowcytometri.
B220+ IgG1+ celler var B celler byttet til IgG1. B220lavCD138+ celler var plasma celler. Prosentandelen av IgG1-byttet B celler og plasma celler fra B-celler stimulert med plater og IL-4 i nærvær av null eller HDI (VPA, 500 M) 96 h angis som tallene innenfor portene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Uttrykk for kjennemerkene til ferdigutfylte CSR; eldre VHDJH-Cγ1 utskrifter og etter rekombinasjon Iμ-Cγ1 utskrifter; og Aicda, Prdm1og Xbp1 ble analysert av qRT PCR normalisert til Cd79b utskrifter og vises i et histogram.
Genuttrykk i B celler stimulert med plater og IL-4 i nærvær av 500 µM VPA og relevant for genuttrykk B celler med samme stimuli i nærvær av null ble avbildet som 1. Dataene er fra tre uavhengige eksperimenter. p -verdier, parvise t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. B celler stimulert med plater og IL-4 og behandlet med HDI (VPA, 500 µM) eller null for 60 h. mRNA uttrykket ble analysert av mRNA-seq.
(A) gjennomsnittlig mRNA uttrykk nivåer i tre uavhengige eksperimenter (leser per kilobase per million tilordnet leser, RPKMs) ble avbildet scatter tomter. Hver tomt tilsvarer ett personlige mRNA uttrykk nivå. De to stiplede linjene er todelt linjer. Scatter tomter over øverste stiplet linje eller under bunnen stiplet linje angir mRNAs som uttrykker mer enn dobbelt eller mindre enn halvparten når indusert av VPA og null, henholdsvis. (B) søylediagrammer viser gjennomsnittlig endringen i mRNA uttrykk nivåer (gjennomsnittlig RPKMs fra tre uavhengige eksperimenter) i LPS og IL-4-stimulert B-cellene behandlet med HDI, i forhold til de i B-cellene behandlet med null. Bare mRNAs på en gjennomsnittlig RPKM > 20 i LPS og IL-4-stimulert B-cellene behandlet med null er inkludert. MRNA uttrykket i hver enkelt eksperiment, som vist av et spredningsdiagram (C) eller stolpediagram (D), er avbildet i samme måte som i (A) og (B). p -verdier, parvise t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. B celler stimulert med plater og IL-4 og behandlet med HDI (VPA, 500 µM) eller null for 60 h. miRNA uttrykket ble analysert av miRNA-seq.
(A) endringen i gjennomsnittlig miRNA uttrykk nivåer i B-cellene behandlet med HDI sammenlignet i B-cellene behandlet med null ble avbildet av søylediagrammer. (B) endringen i miRNA uttrykk nivåer i B-cellene behandlet med HDI sammenlignet som i B-cellene behandlet med null i tre uavhengige forsøk ble avbildet av søylediagrammer. Bare miRNAs på gjennomsnittlig RPM > 0,5 LPS og IL-4-stimulert B-cellene behandlet med null er inkludert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. HDI øker uttrykk for Aicda -målretting miRNAs, som vist av miRNA-seq.
(A) rekkefølge justering av miRNAs og deres målområder i den 3-' UTR i av Aicda mRNAs. (B) B celler ble kultivert LPS og IL-4 i tilstedeværelse eller fravær av HDI (VPA, 500 M) 60 h. Uttrykk for miRNAs som ble spådd å målrette Aicda 3' UTR analysert av miRNA-seq og avbildet som RPM. p -verdier, parvise t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. HDI øker uttrykk for Prdm1 -målretting miRNAs, som vist av miRNA-seq.
(A) rekkefølge justering av miRNAs og deres målområder i den 3-' UTR i av Prdm1 mRNAs. (B) B celler ble kultivert LPS og IL-4 i tilstedeværelse eller fravær av HDI (VPA, 500 M) for 60 h. uttrykk for miRNAs som ble spådd å målrette Prdm1 3' UTR ble analysert av miRNA-seq og avbildet som RPM. p -verdier, parvise t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir omfattende tilnærminger til å indusere B celle klasse veksling og plasma celledifferensiering; analysere effekten av epigenetic modulatorer, nemlig HDI; og for å oppdage effekten av HDI på mRNA og miRNA uttrykk i disse cellene. De fleste av disse metodene kan også brukes til å analysere virkningen av epigenetic faktor på menneskelig B-celle funksjon og mRNA/miRNA uttrykk. QRT PCR og mRNA-seq/miRNA-seq tilnærminger kan også brukes til å analysere B celler isolert fra mus behandlet med epigenetic modulatorer, som HDIs.
Epigenetic modulate kan påvirke mange ulike celle-funksjoner, for eksempel celle spredning og levedyktighet, som kan påvirke CSR og plasma celle differensiering. Derfor skal celle spredning, levedyktighet og cellen sykluser av B celler, med eller uten HDI behandling, analyseres. En av utfordringene for å analysere modulering av mRNA og miRNA uttrykk av HDI eller andre epigenetic regulatorer av qRT PCR er å velge en passende housekeeping genet eller liten RNA. Mange vanlige housekeeping gener kan endres i varierende grad av epigenetic modulatorer. Uttrykket nivåene av mange forskjellige housekeeping gener bør målt og brukes til å normalisere den bestemte genuttrykk qRT PCR. Dette problemet kan også løses ved mRNA-seq og miRNA-seq, der uttrykk for individuelle mRNAs eller miRNAs kan være normalisert av genomet hele mRNA eller miRNA.
mRNA-seq kan ikke bare definere profilen for expression mRNA med en passende bioinformatikk rørledning, men denne tilnærmingen kan også definere lenge noncoding RNA (lncRNA) profilen. mRNA-seq innebærer vanligvis anriking av poly(A) + RNAs oligo(dT) utvalg. Som mange lncRNA er kjent mangel poly(A) haler, finner mRNA-seq tilnærming som involverer oligo (dT) utvalg fullstendig informasjon lncRNA uttrykk. For å oppnå fullstendig dekning av både mRNA og lncRNA uttrykket profiler, bør RNA-seq tilnærming som involverer rRNA uttømming brukes. I de fleste av våre eksperimenter bruker vi en kommersiell kit for å trekke det totale RNA, inkludert miRNA, for miRNA-seq, mRNA-seq og qRT PCR. Før konstruere en høy gjennomstrømming sekvensering bibliotek, valideres totale RNA kvaliteten ved å kjøre en aliquot på et automatisert RNA og DNA protein eksempel QC system. Det anbefales at RNA utvalg har en RIN på 7.0 eller høyere hvis de skal brukes for små RNA biblioteket utarbeidelse. Prøver RIN tallene har en høyere prosent av degradert RNA produkter i området størrelse liten RNA arter (15-30 nukleotider). Når RIN-nummer er under 7.0, vil dekningen ikke være så god. Et annet alternativ for mindre-enn-ideelle RNA prøver er å utføre en rRNA uttømming tilnærming i stedet for en mRNA isolasjon tilnærming, men dette krever at prøvene er minst 10 ng/mL.
Protokollene for mRNA-seq her er optimalisert for 100-1000 ng av totalt. For miRNA-seq bruker mindre enn 100 ng av totale liten RNA-seq biblioteket forberedelse bør følge en mer følsomme liten RNA-seq forberedelse protokoll, som utnytter den naturlige strukturen felles til de fleste kjente microRNA molekyler. De fleste eldre miRNAs har en 5'-fosfat og en 3-hydroksyl gruppe som følge av deres biogenesis sti. Derfor er 3 og 5' kortene i pakken direkte samskrevet til miRNAs.
Analysere virkningen av HDI på B-celle mRNA og miRNA uttrykk i vivo, kan mus bli behandlet med VPA eller andre HDIs ved å legge til denne HDI drikkevann og intraperitoneal injeksjon av disse musene med T-avhengig antigen NP-CGG eller T-uavhengig antigen NP-plater kan utføres. B-cellene kan bli renset fra milten 10 dager etter immunisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd AI 105813 og AI 079705 (som PC), gi Alliansen for Lupus forskning Target identifikasjon i Lupus Grant ALR 295955 (som PC), og leddgikt National Research Foundation forskningen (HZ). TS ble støttet av Pediatrics Medical Center, andre Xiangya Hospital, Central Sør University, Changsha, Kina, i sammenheng med Xiangya-UT skolen av medisin San Antonio medisinstudent besøke programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
