Summary
Her præsenterer vi en protokol til at designe og fabrikere brugerdefinerede mikrofluidisk enheder med minimal finansiel og tidsinvestering. Målet er at lette indførelsen af mikrofluidiske teknologier i biomedicinske forskningslaboratorier og uddannelsesmiljøer.
Abstract
Microfluidic-enheder giver mulighed for manipulation af væsker, partikler, celler, mikro-mellemstore organer eller organismer i kanaler, som spænder fra Nano til submillimeter skalaer. En hurtig stigning i brugen af denne teknologi i de biologiske videnskaber har foranlediget et behov for metoder, der er tilgængelige for en bred vifte af forskningsgrupper. Nuværende fabrikations standarder, såsom PDMS bonding, kræver dyre og tidskrævende litografiske og bonding teknikker. Et levedygtigt alternativ er brugen af udstyr og materialer, der er let overkommelige, kræver minimal ekspertise og giver mulighed for hurtig iteration af designs. I dette arbejde beskriver vi en protokol til design og produktion af PET-laminater (petls), mikrofluidisk enheder, der er billige, nemme at fabrikere, og forbruge betydeligt mindre tid til at generere end andre tilgange til microfluidics teknologi. De består af termisk bundne film plader, hvor kanaler og andre funktioner er defineret ved hjælp af en håndværker cutter. PETLs løser feltspecifikke tekniske udfordringer, samtidig med at hindringerne for adoption reduceres drastisk. Denne fremgangsmåde letter tilgængeligheden af mikrofluidics-enheder i både forsknings-og uddannelsesmiljøer, hvilket giver en pålidelig platform for nye undersøgelsesmetoder.
Introduction
Microfluidics muliggør væskekontrol i små skalaer med volumener, som spænder fra mikroliter (1 x 10-6 l) til picoliters (1 x 10-12 l). Denne kontrol er blevet muliggjort delvis på grund af anvendelsen af mikrofabrikations teknikker lånt fra mikroprocessor industrien1. Brugen af mikro-store netværk af kanaler og kamre giver brugeren mulighed for at drage fordel af de særskilte fysiske fænomener karakteristisk for små dimensioner. For eksempel kan væsker på mikrometer skalaen manipuleres ved hjælp af laminar flow, hvor viskøse kræfter dominerer inerti kræfterne. Som et resultat, åbne systemer transport bliver det fremtrædende træk ved microfluidics, og kan undersøgt kvantitativt og eksperimentelt. Disse systemer kan forstås korrekt ved hjælp af Fick's love, brownian motion teori, varme ligningen, og/eller Navier-Stokes ligninger, som er vigtige afledninger inden for væskemekanik og transport fænomener2.
Fordi mange grupper i de biologiske videnskaber studere komplekse systemer på mikroskopisk niveau, var det oprindeligt troede, at mikrofluidisk enheder ville have en umiddelbar og betydelig indvirkning på forskning applikationer i biologi2,3. Dette skyldes, at Diffusion er dominerende i transporten af små molekyler på tværs af membraner eller i en celle, og dimensionerne af celler og mikroorganismer er et ideelt match for sub-millimeter systemer og anordninger. Derfor var der et betydeligt potentiale for at forbedre den måde, hvorpå cellulære og molekylære eksperimenter udføres. Imidlertid har biologernes brede indførelse af mikrofluidiske teknologier haltet bagud i forventningerne4. En simpel grund til den manglende teknologioverførsel kan være de disciplinære grænser, der adskiller ingeniører og biologer. Custom indretning design og fabrikation er forblevet lige uden for de fleste biologiske forsknings gruppers kapaciteter, hvilket gør dem afhængige af ekstern ekspertise og faciliteter. Manglende kendskab til potentielle applikationer, omkostninger, og den tid, der kræves for design-iteration er også betydelige barrierer for nye adoptører. Det er sandsynligt, at disse barrierer har haft den virkning at forstyrre innovationen og forhindre den udbredte anvendelse af mikrofluidics til at imødegå udfordringerne i de biologiske videnskaber.
Et eksempel: siden slutningen af 1990 ' erne Soft-photolithography har været den foretrukne metode til fremstilling af mikrofluidisk enheder. PDMS (Polydimethylsiloxan, en silikone-baseret organisk polymer) er et almindeligt anvendt materiale på grund af dets fysiske egenskaber, såsom gennemsigtighed, deformabilitet og biokompatibilitet5. Teknikken har haft stor succes, med Lab-on-a-chip og orgel-on-a-chip-enheder, der hele tiden udvikles på denne platform6. De fleste af de grupper, der arbejder på disse teknologier, dog findes i ingeniør afdelinger eller har stærke bånd til dem4. Litografi normalt kræver rene rum til fabrikation af forme og specialiserede bonding udstyr. For mange grupper, dette gør standard PDMS enheder mindre end ideelt på grund af deres kapitalomkostninger og bly-tid, især når der er behov for at foretage gentagne design modifikationer. Desuden er teknologien for det meste utilgængelige for den gennemsnitlige biolog og for studerende uden adgang til specialiserede tekniske laboratorier. Det er blevet foreslået, at for mikrofluidiske anordninger, der skal vedtages bredt, skal de efterligne nogle af de kvaliteter af materialer, der almindeligvis anvendes af biologer. For eksempel, polystyren anvendes til cellekultur og bioassays er billig, engangs, og modtagelig for masseproduktion. Derimod er industriel fremstilling af PDMS-baserede mikrofluidics aldrig blevet realiseret på grund af sin mekaniske blødhed, ustabilitet i overfladebehandling og gaspermeabilitet5. På grund af disse begrænsninger, og med det mål at løse tekniske udfordringer ved hjælp af tilpassede enheder bygget "in-House", vi beskriver en alternativ metode, der udnytter xurografi7,8,9 protokoller og termisk laminering. Denne metode kan vedtages med lidt kapital og tid investeringer.
PETLs er fabrikeret ved hjælp af polyethylenterephthalat (PET) folie, belagt med termo klæbemiddel ethylenvinylacetat (EVA). Begge materialer er meget udbredt i forbrugerprodukter, er biokompatible og er let tilgængelige på minimale omkostninger10. PET/EVA film kan fås i form af laminering poser eller ruller. Ved hjælp af en computerstyret håndværk fræser, der almindeligvis findes i hobbyist eller håndværksbutikker, skæres kanalerne ud af et enkelt film blad for at definere enhedens arkitektur11. Kanalerne forsegles derefter ved at anvende yderligere film (eller glas) lag, der er bundet ved hjælp af en (kontor) termisk Laminator (figur 1A). Perforerede, selvklæbende vinyl kofangere tilsættes for at lette adgangen til kanalerne. Fabrikation gange spænder fra 5 til 15 min, som giver mulighed for hurtig design iteration. Alt udstyr og materialer, der anvendes til at gøre PETLs er kommercielt tilgængelige og overkommelige (< 350 USD startomkostninger, sammenlignet med tusindvis af USDs for litografi). Derfor giver PETLs en ny løsning på to hovedproblemer i forbindelse med konventionelle mikrofluidics: prisoverkommelighed og tidseffektivitet (jf. PDMS/PETL-sammenligning i supplerende tabel 1, 2).
Ud over at give forskerne mulighed for at designe og fabrikere deres egne enheder, kan PETLs nemt vedtages i klasseværelset, fordi de er enkle og intuitive at bruge. PETLs kan medtages i High School og College læseplaner8, hvor de bruges til at hjælpe eleverne til bedre at forstå fysiske, kemiske og biologiske begreber, som diffusion, laminar flow, micromixing, nanopartikel syntese, gradient dannelse og chemotaxis.
I dette arbejde illustrerer vi den overordnede arbejdsgang for fabrikation af model PETLs chips med forskellige niveauer af kompleksitet. Den første anordning bruges til at lette billeddannelse af celler og mikro-organer i et lille kammer. Den anden, mere komplekse enhed består af flere lag og materialer, og bruges til forskning i mechanobiology9. Endelig har vi bygget en enhed, der viser flere flydende dynamik begreber (Hydrodynamisk fokusering, laminar flow, åbne systemer transport og micromixing) til uddannelsesmæssige formål. De arbejdsgange og enheds design præsenteret her kan nemt skræddersys til en lang række formål i både forskning og klasseværelset indstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design
- Identificer en applikation til enhederne, og Angiv de kanal-/kammerets komponenter, der skal bruges.
Bemærk: alle enheder vil kræve input og output kanaler. Enheder, der anvendes til mikroskopi, vil kræve et billed kammer. Mere komplekse enheder vil kræve kanaler og kamre beliggende i flere lag. - Begynd med hånden-tegning hvert lag, i betragtning af hvordan enhedens funktionalitet påvirkes af den superposition af lagene.
- Tegn det endelige design på en computer ved hjælp af software, der giver mulighed for at tegne linjer og figurer.
- Tegn hvert lag separat ved hjælp af sorte, faste streger og former blottet for nuancer. Linjetykkelse på 6 eller flere punkter anbefales. På dette stadium er dimensionerne af kanal og kammer funktioner mindre vigtige end de samlede proportioner.
- Brug kopierings-og indsætnings funktionen, når du opretter funktioner og overlejringen af lag. Se figur 1B for eksempler på lagtegninger.
- Importer hvert lag i Craft cutter software (figur 1C). Gør dette ved at gøre et skærmbillede af det tegnede design og ved hjælp af en træk og slip tilgang.
- Opret et nyt dokument i Craft cutter software (gratis download). Slip billedfilen på måtten, som vises. Softwaren vil genkende de fleste billedfiler.
- Forstørre billedet for at lette behandlingen ved at trække fra et hjørne. Designet kan nu genkendes af softwaren ved hjælp af Trace-funktionen.
Bemærk: brugere kan producere de Novo designs direkte på denne software (brug tegneværktøjer i design palet).
- For at spore designet skal du vælge sporings ikonet (form af en sommerfugl) i højre side af vinduet og helt vælge de importerede designs.
- Vælg indstillingen Trace preview med navnet Disposition. Juster (om nødvendigt) indstillingerne for tærskel og skalering for at justere det gule spor, så det passer til designet.
- Vælg Trace i menuen spor , når det gule spor matcher designet. Kanalerne vises nu som en rød kontur. Hvis den røde kontur matcher designet, kan det importerede billede vælges og slettes. Designet er nu importeret og klar til dimensionering.
- Tilpas størrelsen på enheden ved at vælge det sporede design og ved at bruge det gitter, der leveres af softwaren. Træk for at ændre bredden og længden af kanaler og kamre.
Bemærk: softwaren giver målinger, og små linjer kan trækkes midlertidigt (Brug design palet i venstre side af vinduet) til at måle dimensionerne i enheden. Funktionelle kanal bredde dimensioner spænder fra 100 μm til 900 μm. dimensionerne skal muligvis justeres efter test af de første prototyper. Det er vigtigt, at alle lag er dimensioneret proportionalt for at sikre korrekt justering under samlingen.- Når designet er korrekt dimensioneret, skal du vælge det firkantede værktøj i menuen Figur tegning for at tegne et kvadrat/rektangel omkring hvert lag af enheden. Denne figur skal have samme størrelse for alle lag. Se figur 1C for eksempler.
- Opret et separat toplag med adgangs porte til kanalerne. Simple designs vil bestå af et hoved (midterste) kanallag, et bund tætnings lag (ofte glas) og et toplag, der skal indeholde cirkulære perforeringer for at få adgang til kanalerne (indløb/udtag).
Bemærk: design, der indeholder mere end tre lag, vil kræve indløb/udløb perforeringer i flere lag (Se figur 1C, figur 5A). Disse perforeringer kan allerede indgå i designet, eller kan tilføjes på dette tidspunkt.- Vælg tegneværktøjet i venstre side af skærmen. Tegn cirkler over indløbs-og afgangs portene på designet.
- Kopiér og Indsæt både det oprindelige design og cirklerne. Slet kanalerne fra den underliggende enhed.
Bemærk: dette efterlader indløbs-/afgangs portene i den rigtige position svarende til det oprindelige design. Figurer kan også tilføjes i periferien af hvert lag for at hjælpe med at justere.
- Arranger alle lag, der skal skæres på den viste måtten. Enheden er nu klar til skæring.
2. skæring
- Påfør en enkelt PET/EVA-film (eller andet materiale) af foretrukken tykkelse (3 mil er standard) på den klæbende skæremåtte. Sørg for, at den klæbende (matte) side vender opad, og at plastik (skinnende) side vender nedad.
Bemærk: brug rene handsker for at undgå at introducere olier og mikropartikler til lagene. - Samkopier filmen mod måtten (figur 1D), og Fjern al luft, der kan være blevet fanget. Dette kan gøres ved hjælp af dykkede hænder eller en rulle.
- Juster skærmåtten på den linje, som er angivet på fræseren. Læg måtten ved at trykke på belastnings måtten på fræseren. Hold indstillingen på skærklingen mellem 3 og 5, afhængigt af filmens tykkelse.
- fræseren USB-kablet til computeren.
- Vælg fanen Send , og vælg en skære indstilling.
Bemærk: et væld af indstillinger er tilgængelige i kaskade menuen. Den-sticker papir, Clear-er en indstilling, der fungerer godt med PET/EVA film, der har en tykkelse på 3 – 5 mil (75 – 125 μm). Rediger indstillinger for forskellige materialer, og Gem brugerdefinerede indstillinger til fremtidig brug.
- Vælg fanen Send , og vælg en skære indstilling.
- Klik på Send. Vil begynde at skære (figur 1E). Sørg for, at der er plads nok på bagsiden af fræseren til, at måtten kan bevæge sig uhindret. Når fræseren er færdig, fjernes måtten ved at vælge Fjern på fræseren. Træk ikke måtten ud før aflæsning.
3. tilpasning
- Placer skæremåtten ved siden af en ren overflade. Brug et par pincet til at løfte hvert lag af microfluidics-anordningen ud af klippe måtten (figur 1F) med dykkede hænder. Vær især forsigtig omkring sving og bøjninger i kanalen; disse er særligt sarte og modtagelige for at rive og vridning.
- Placer lagene på mikrofluidics enheden på en ren overflade. Bestil dem i henhold til deres top-til-bundposition i enheden (figur 1G, figur 2a, figur 5a og figur 7a).
- Skær små (~ 3 mm x 10 mm) stykker dobbeltsidet tape, der vil blive brugt til midlertidigt at fastgøre lagene sammen.
- Overpåtvinge lagene en efter en, begyndende med det nederste lag. Tilføj et lille stykke dobbeltsidet tape til et hjørne mellem lagene, væk fra alle kanaler eller indløb/udtag (figur 1G, pil). Båndet, selvom det ikke er nødvendigt, immobiliserer lagene og forsikrer, at de ikke vil skifte under laminering. Brug en wire-Jig til at lette tilpasningen af lag i enheder med mere end 4 lag (supplerende figur 3).
- Sørg for, at den klæbende (matte-EVA) side af filmen altid vender den indvendige del (inden for lag) af enheden.
Forsigtig: udsat lim smelter mod de indvendige dele af laminatoren og overholder dem, hvilket ikke kun resulterer i tab af anordningen, men også påvirker laminatorens fremtidige præstation. - Når alle lag er blevet overlejret, inspicere enheden. Der bør være mindst én EVA side i mellem alle lag, og ingen EVA skal eksponeres. Ved indførelse af ikke-EVA-belagte materialer (f. eks. polyvinylchlorid (PVC) film, glas) kan der være behov for en film, som er belagt med EVA på begge sider, især i tilfælde af mere komplekse anordninger (figur 5).
4. laminering
- Tænd og Indstil laminatoren til den ønskede tykkelses indstilling. Nogle laminatorer tilbyder 3 og 5 mil indstillinger, mens nogle ikke gør. For enhver enhed med 4 eller flere lag skal du bruge indstillingen 5 mil.
- Når laminatoren er klar, skal du køre enheden gennem laminering rullerne (figur 1H – I). Placer den ende, hvor dobbeltsidet tape er blevet tilføjet for de bedste resultater.
Bemærk: når der fremstilles anordninger af fem eller flere lag, kan de køres gennem laminatoren mere end én gang. - Genopret den laminerede anordning.
Bemærk: det er tilrådeligt for enheder at være store nok til at gøre let deres opsving fra laminatoren. Denne overvejelse påvirker ikke størrelsen af kanalerne eller chip arkitekturen, det kræver blot en "Frame", der nemt kan gå gennem laminatoren uden at forblive indeni.
5. indløbs-/afgangs porte
- Brug et roterende værktøj og en 1/32 i. bore bit til at skære et lille hul gennem midten af en møbel kofanger. Alternativt kan du bruge en 1 mm biopsi punch til at perforere kofangere.
Bemærk: et bore tryk anbefales. Selvom størrelserne varierer, anbefales 2 mm x 6 mm-diameter kofangere. Undgå blot "stikkende" kofanger. Medmindre der fjernes materiale, vil kofangeren forsegle igen (supplerende figur 1). Perforeringer som angivet ovenfor er beregnet til grænseflade med polyetheretherketon (Peek) slanger, en pipette og spids, eller en stump nål (16 – 18 G). Større perforeringer kan opnås ved hjælp af revolverende tænger (supplerende figur 1). Disse er nyttige, når kofanger bruges som en "reservoir" for væsker eller andre biologiske. - Sørg for, at åbningen er helt klar ved at fjerne snavs (forårsaget af boring eller stansning) med et par små pincet.
- Når indløbs-/afgangs portene er ryddet, justeres kofangere forsigtigt med indløbs-/afgangs portene på den laminerede enhed (figur 1J – K). Dette trin er afgørende for at have ordentlig strøm af væsker ind og ud af enheden. Hold kofangeren bag enheden, Placer klæbe ansigtet mod den åbne indløb/udløb på enheden, og Juster og klæber derefter. Enheds assemblyen er nu fuldført.
6. afprøvning
- Få adgang til kanal/kammer arkitekturerne gennem de perforerede kofangere (porte). Der er flere muligheder med hensyn til hvordan man introducerer væsker og Biologicals i enhederne.
- Brug laboratorie-eller medicinsk/kirurgisk slange ved at fastgøre den til et plastik stik (f. eks. luer-adaptorer) eller til en stump nål. En standard pipette og spids eller PEEK slange uden adaptere kan også anvendes (supplerende figur 2).
- Udfør infusion eller tegning af væsker med sprøjter og slanger ved hjælp af sprøjter eller peristaltiske pumper.
Bemærk: der er mange muligheder på markedet, startende på ~ 300 USD i skrivende stund. - Indstil forskellige indstillinger for strømningshastighed i henhold til enheden og Eksperimentér.
Bemærk: vi bruger rutinemæssigt flow rate indstillinger i intervallet 0,01-100 μL/min, men andre satser kan anvendes.
Figur 1: fabrikation. (A) en kontor Laminator og en håndværker fræser er de eneste to stykker udstyr, der kræves til fabrikation. Begge er tilgængelige online eller på håndværk/kontorartikler butikker. Andre nødvendige værktøjer omfatter saks og pincet. (B) kanal-og kammer arkitekturer kan komponeres digitalt ved hjælp af ethvert softwareprogram, der omfatter tegneværktøjer (vektorgrafik kan foretrækkes af nogle brugere, men er ikke påkrævet). Streger og figurer tegnes i sort med en hvid baggrund. Filen eller et skærmbillede af designet kan importeres til Craft cutter software ved at trække og slippe. (C) Craft cutter software er tilgængelig gratis at downloade og er forpligtet til at styre fræseren. Softwaren erhverver design og giver mulighed for ændringer, ligesom dimensionering. Det giver også tegneværktøjer. D) skæremåtten bærer filmen til skæring. Det er lidt klæbemiddel, giver mulighed for immobilisering af de materialer, der skal skæres. Figuren viser fire forskellige materialer klar til lastning: 3 mil-tyk PET/EVA film (top), 5 mil-tyk PET/EVA film (midten), 6 mil-tyk EVA/PET/EVA (nederst til venstre) og PVC film (nederst til højre). (E) fræseren er åben for at vise bladet (i sort) enhed og lastet måtte. F) efter opskæring løftes de enkelte lag med en pincet. Udskæringer af kanaler og kamre forbliver fastgjort til måtten og fjernes senere og kasseres. G) individuelle lag er justeret og overlejret til laminering. Små stykker af dobbeltsidet tape (pil) bruges ofte til at hjælpe med at justere og forhindre lag Skift under laminering. (H, I) Enheden fodres øverst på laminatoren og genvindes gennem åbningen. Laminering giver en robust forsegling, der forlader kanal stier åbne. (J, K) For at få adgang til kanalerne, er det nødvendigt at tilføje perforerede, selvklæbende vinyl kofangere. Billede i (J) viser den "omvendte" tilgang til justering, hvor kofangeren er placeret fra bagsiden, hvilket muliggør visuel justering af indløb/udløb med kofanger perforering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ud over lave omkostninger og hurtig iteration, PETL teknologi kan nemt tilpasses til at løse specifikke udfordringer. For det første beskriver vi en simpel anordning bestående af en glas dækseddel, et kammer lag, et kanallag og et indløbs-/udløbs lag (figur 2). Denne enhed er designet til at lette billeddannelse af celler og mikro-organer under konstant flow. Dyrkningsmediet genopfyldes ved lave strømningshastigheder for at tilskynde til udveksling af næringsstoffer og gas. Det runde kammer har en glasbund, som giver mulighed for billeddannelse ved hjælp af et inverteret mikroskop. Der er mindst to grunde til brug af glas i denne enhed. Den første er optik. PET og EVA er termoplast, der anvendes til deres optiske gennemsigtighed og fleksibilitet, og kan bruges som en grænseflade til billeddannelse (især ved lave forstørrelser9. Lystransmission af PET i det synlige spektrum spænder fra 87 til 90%12. Glas har imidlertid bedre optiske egenskaber og er den standard, der anvendes i biologisk billeddannelse. Den anden grund til at bruge glas er, at de celler, der hidtil er testet (pattedyrscelle linjer), har tendens til at vedhæfte mere let til det end til (ubehandlet) PET/EVA.
Figur 2: simpelt kammer til inverteret mikroskopi. A) anordningen består af et glaslag og tre Pet/Eva-lag (3 mil tyk). En glas dækseddel (24 mm x 60 mm) er det nederste lag. Det næste lag har bunden af billed kammeret. Det næste lag har den øverste halvdel af kammeret og forbinder det til in/Outlet-kanalen. Således er højden af kanalen kun 75 μm, mens højden af kammeret er 150 μm. Kanalens bredde bestemmes af brugeren (500 μm vises her). Det øverste lag forsegler kammeret/kanal stien og giver adgang til indløb/udtag. De overlejret lag vises til højre. (B) den færdige anordning er vist inbrugt med rødt farvestof for visualisering. Lastning kan opnås ved hjælp af en mikropipette og spids, laboratorium eller medicinsk/kirurgisk slange udstyret med en stump nål, eller PEEK slange, som vist. (C) kanal/kammer-konstruktionen kan ses i en enkelt anordning (f. eks. for at lette observation af flere individuelle prøver). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Dimensionerne af kanalerne og kammeret i denne enhed er værd at beskrive. Højden i PETLs er altid en funktion af film eller lagtykkelse. Kommercielt tilgængelige PET/EVA har en tykkelse målt i tusindedel af en tomme (1 mil ≈ 25 μm). Derfor er kanal-og kammer højder normalt multipla af 25 μm. standard PETLs er bygget med 3 eller 5 mil PET/EVA film, hvilket resulterer i funktioner med en højde på 75 eller 125 μm. Enheden vist i figur 2 har kanaler med en højde på 75 μm, og et kammer defineret af to lag, med en total højde på 150 μm. Det skal dog bemærkes, at lagene kan bestå af forskellige materialer (f. eks. glas, folie, PVC, papir) og kan udgøre varierende tykkelse, sædvanligvis fra 25 til 250 μm.
Figur 3: celle afbildning. (A) den simple kammer petl kan anvendes til kort sigt kultur af vedlige celler. Cellerne overholder glasset, der er eksponeret i kammeret, og kan observeres ved hjælp af et inverteret mikroskop. B) rotte basofile blev plettet med Hoechst (blå) og plasma membran (rød) fluorescerende farvestoffer til visualisering på et inverteret Konfokal mikroskop. (C) lyse felt billede af celler i en simpel kammer anordning. (D) billede af fasekontrast. Hvid skala bar er 200 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Karakteren af PETL fabrikation giver mulighed for betydelig kompleksitet i væskebane design. Den simple kammer anordning består af fire lag, der indeholder funktioner i to niveauer af z-aksen (kanal og toppen af kammeret i et niveau, bunden af kammeret i andet niveau). En fordel fra PETLs er den lethed, hvormed 3-dimensionelle kanal/kammer arkitekturer kan bygges. Tilsætning af funktioner som køle-eller varmekanaler, dialyse membraner, elektriske kredsløb eller trykledninger (Se figur 5) opnås ved at forbinde flere lag i tre dimensioner. En advarsel hidtil stødt er grænsen for antallet af lag, der kan lamineres. Varmeoverførsel nødvendig for Eva-kuration er fundet utilstrækkelig i enheder med en samlet tykkelse over 800 μm. Denne begrænsning kan løses i nogle enheder. I mange tilfælde er det muligt at laminat hver gang et nyt lag tilsættes. Dette er ikke muligt, når et nyt lag kræver, at termo klæberen (EVA) står udvendigt på enheden.
Figur 4: mikroorgan afbildning. (A) den simple kammer petl bruges til at afbilde en vinge skive af embryonet Drosophila melanogaster (2x forstørrelse). Vinge diskens mål er ca. 90 μm x 250 μm x 500 μm. Et eller flere organer kan imældes gennem dækglas vinduet. Større forstørrelse af en anden vinge skive er vist i (B) 20x/0,75-Air, (C) 40x/1,30-olie, og (D) 100x/1.49-Oil mål ved hjælp af en roterende skive Konfokal mikroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Studiet af celler i kultur nyder godt af værktøjer, der giver dynamiske tilstands forhold som konstant flow eller mekaniske stimuli. Figur 3 giver et eksempel, hvor en pattedyrscellelinje dyrkes og afbildet i en simpel kammer anordning. Medium kan konstant udveksles under billeddannelse, så ikke kun for at opretholde ideelle vækstbetingelser, men også for kontrolleret indførelse af kemiske stimuli mens Imaging i realtid. Dette gælder også for billeddannelse af ex vivo-mikroorganer som vist i figur 4. Kanal-og kammer strukturer kan konstrueres med specifikke dimensioner, så de passer til forskellige biologiske prøver, fra organer eller væv til hele organismer (f. eks. Drosophila -embryoner og imaginal skiver eller C. elegans).
Figur 5: Mechano-PETL. Den simple kammer PETL er modificeret ved at tilføje et kompressionskammer. A) anordningen består af syv lag med fire forskellige materialer: et glasbundlag (dækseddel, ikke vist), fire Pet/Eva 3 mil lag (kanal/kammer lag, spacer lag og indløb/udløb lag), en Eva/Pet/Eva 6 mil lag (kanal/kammer FORSEGLING og PVC vedhæftning) og en deformerbar PVC lag (til komprimering). (B, C) Prøve kanalen/kammer kurven visualiseres ved hjælp af rødt farvestof. Komprimerings kanalen/kammer stien indeholder kun luft. D) lufttrykket påføres manuelt (eller mekanisk) på kompressions banen, hvilket resulterer i en udvidelse af PVC-filmen øverst i kammeret. Ekspansionen forflytter farvestoffet i kammeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Mekanisk forstyrrelse af biologiske prøver forbedrer vores forståelse af cellulær fysiologi og kaster lys over processer som fosterudvikling og differentiering. Figur 5 beskriver en petl-anordning, der består af en enkel kanal/kammer matrix og et kompressionskammer. Den består (i sin enkleste form) af seks lag, hvoraf den ene er en PVC-film. PVC-filmen afbøjer, når lufttrykket påføres, hvilket får den til at komprimere enheder i kammeret. Denne enhed er et eksempel på brugen af andre materialer end PET/EVA, og det er blevet anvendt9 i udskiftning af PDMS/glas enheder udnyttet til at studere mekanisk belastning på Drosophila mikro-organer13 (som vist på figur 6). PETL-enheder er genanvendelige. Men på grund af de lave omkostninger ved fabrikation, reduceret fodaftryk, og potentialet for delaminering efter kontinuerlig manipulation eller vask, anbefaler vi brugen af nye enheder ved starten af hver procedure.
Figur 6: Mechanobiologi Imaging. A) ende-cadherin:: gfp udtrykker Drosophila Wing disc er afbildet i en mekanisk-petl ved hjælp af en roterende skive confokale mikroskop ved 20x forstørrelse. B) tryk gennem membranen over kammeret kan påføres ved at aktivere en luft fyldt sprøjte manuelt eller ved hjælp af en sprøjtepumpe. Den ideelle gaslov bruges til at estimere den mængde kraft, der påføres membranen9. Disc pose område (hvid stiplede linje) steg med ca 30% (rød punkteret linje) med anvendelse af ~ 4 PSI. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
På grund af den lette fabrikation af PETL enheder, har vi udforsket deres brug i uddannelsesmæssige indstillinger som kemi, biologi og ingeniør klasseværelser og undervisningslaboratorier. Et eksempel på en pædagogisk PETL er vist i figur 7. Enheden er designet til at vise nogle af de grundlæggende funktioner i fluid flow i mikro-skalaen (f. eks. laminar flow). Den består af fire lag af 5 mil PET/EVA film (figur 7A) og en kanal arkitektur, der omfatter tre konvergerende indgangskanaler og en Serpentine struktur. Cirkulære "depressioner" eller "ned" trin er blevet føjet til stien for at fremme micromixing14. Ved hjælp af en sprøjtepumpe inbruges phenol-rød opløsning gennem de ydre porte, mens pH 9-opløsningen inbruges gennem midterporten. Hydrodynamisk fokusering15 visualiseres med den ydre væskestrøm, der tvinger det indre flow ind i en mindre strøm (figur 7C). Laminar flow i enheden forhindrer Konvektiv blanding, og gradvis difpulsiv blanding vises langs længden af kanalen (pile). Enheder som den viste kan bruges til at undervise i koncepter (f. eks. diffusion, laminar flow) i væskedynamik og biotran sport. Alternativt kan eleverne blive inviteret til at designe og fabrikere deres egne enheder, et projekt, der kan udføres i en regelmæssig laboratorie session varede to til tre timer8.
Figur 7: PETLs i klasseværelset. (A) enheden er fremstillet ved hjælp af fire lag af 5 mil Pet/Eva film. Det andet lag (fra højre til venstre) har cirkulære kamre, der vil blive placeret under kanalen sti. B) den færdige anordning er blevet lastet med ph-indikatoren phenol rød (2 mm, gul) og en transparent pH 9-opløsning (midterkanal). Phenol røde tænder magenta når de er i kontakt med grundlæggende opløsninger. Kasserne angiver de områder, der er vist under (C) til (F). C) Hydrodynamisk fokusering. (D, E) laminar flow og diffusion. (E, F) mikromixing. Hvid skala bar er 2 mm i alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: perforering af kofanger/port. (A) et bore tryk setup, der holder et rotationsværktøj, letter perforering af kofanger. Bore stumper af størrelserne 1/32 "og 3/64" anvendes. (B) processen er effektiv, og et stort antal kofangere kan behandles på kort tid. (C) biopsi punch perforation er et alternativ til boring. D) der anvendes en dreje tang til større perforeringer. Disse perforeringer kan bruges til at indlæse store prøver (ved væske tilbagetrækning i stedet for infusion) eller som medie reservoirer. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: slanger. (A) laboratorium eller medicinsk/kirurgisk slange (1/32 "ID, 3/32" OD) er den enklere løsning. Den er fleksibel og nem at klippe. Det kræver brug af (18 G) stump nåle. (B) en af Nålene er fastgjort til sprøjten ved hjælp af (Pink) luer-adapteren, som fjernes fra en anden nål, så den kan monteres på slangen. (C) forskere, der allerede er bekendt med Peek tubing (0,010 "ID, 1/32" OD) kan bruge det med petls. (D) Peek fittings. E) sprøjtepumpen er den samme for begge slange typer. (F) laboratorie-eller medicinsk/kirurgisk slange opsætning vil kræve perforeringer med en 3/64 "bore bit, mens Peek Tubing skal bruge 1/32" perforeringer. Perforeringer lavet med en 1 mm biopsi punch kan rumme begge sæt slanger. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 3: justering ved hjælp af en wire-Jig. Indretningen af enheden kan omfatte perforeringer, der kan fungere som guider til justering af flere lag. Wire jigs er kommercielt tilgængelige for omkring 20 USD. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 4: størrelsesbegrænsninger. Selv om håndværk fræsere er i stand til at skære lige kanaler, der er ~ 100 μm i bredden (A), er nøjagtigheden af de skårne mønstre stærkt formindsket for funktioner, der måler 150 μm eller mindre (B). Dimensionerne ud for figurerne angiver kanalbredden. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Supplerende tabel 1: tid og omkostninger ved fremstilling af mikrofluidisk-chip i PDMS. * Fremstilling tid, når wafer/skimmel er let tilgængelige og PDMS kan helbredes ved hjælp af en ovn. Enhver designændring repræsenterer en forsinkelse på flere dage. Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: tid og omkostninger ved fabrikation af petl mikrofluidisk chip. Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens mikrofluidics i stigende grad er til stede i værktøjskassen af laboratorier rundt om i verden, tempoet i vedtagelsen har været skuffende, i betragtning af potentialet for dens positive virkning16. Lave omkostninger og høj effektivitet af mikrofluidic enhed fabrikation er afgørende for at fremskynde vedtagelsen af denne teknologi i det gennemsnitlige forskningslaboratorium. Den metode, der er beskrevet her, bruger flere filmlag til at oprette to-og tredimensionale enheder på en brøkdel af den tid og de omkostninger, der kræves af litografiske metoder. Standard litografi koster tusindvis af dollars (USD) til opstart, og kræver dage til at fabrikere, PETL fabrikation Startup omkostninger er mindre end 350 USD og enheder kan fabrikeres i minutter. Dette letter deres vedtagelse ikke kun i Forskningslaboratoriet, men også i indstillinger, hvor hurtig iteration er fordelagtig (f. eks prototyping for standard PDMS enheder), eller hvor industriel produktion af billige, engangsudstyr er påkrævet. For eksempel kan PETLs være fabrikeret ved hjælp af biologisk nedbrydelige materialer, og kan tilpasses til deres anvendelse på sundhedsområdet, hvilket gør dem ideelle som diagnoseværktøj. De kan bruges i klasseværelset, enten som præfabrikerede undervisningsmaterialer eller som en kreativ udfordring, hvor eleverne designer, fabrikerer og tester deres egne enheder.
PETL fabrikation er beregnet til at være ukompliceret. Det er dog nyttigt at identificere kritiske trin og nuværende begrænsninger af denne teknik. Nogle brugere vil opdage, at gas udveksling i PETL enheder er reduceret i forhold til PDMS enheder, som kompenseres for ved at have kontinuerlig strøm af medier under eksperimenter. En anden begrænsning er dimensionering. Kanaler og andre funktioner, der er mindre end 150 μm, er under fræser Rens opløsnings grænse (supplerende figur 4). Vi anbefaler at arbejde med kanaler med en bredde på mellem 200 og 900 μm. Disse grænser er fleksible og har en tendens til at variere især ved den øvre tærskel. For eksempel vil kanaler med en højde på 75 μm kollapse, når bredden af kanalen er 950 μm eller mere, men forbliver åben, hvis højden stiger. Selvom enhedens arkitektur vil variere afhængigt af applikationen, bruger vi rutinemæssigt kanaler med en højde på 75 eller 125 μm og en bredde på 400 – 600 μm.
Opmærksomhed på detaljer, når du justerer lag og kofangere er vigtigt. De fleste af de få komplikationer som følge af PETL fabrikation er et resultat af tilpasningen spørgsmål. Eksponeret EVA på tidspunktet for laminering kan holde sig til de interne ruller og gøre dem ubrugelige. Væske infusion kan blokeres af en dårligt placeret kofanger. Heldigvis, PETLs er ikke kun billige, men er også hurtigt bygget, derfor defekte enheder kan let udskiftes eller ændres.
Petls kan modstå infusions strømningshastigheder svarende til dem, der anvendes i andre mikrofluidisk-enheder. Selv om 0,01 til 100 μL/min er det område, der anvendes af vores gruppe, kan strømningshastigheder på op til 500 μL/min (og måske højere, når du bruger hånd-aktiverede Mikropipetter) anvendes. Vi har konstateret, at PETLs kan modstå tryk i intervallet 30 til 57 PSI8. Sprøjtepumper anbefales til de fleste eksperimentelle indstillinger, selv om de ikke er et absolut krav. I klasseværelset, buretter blev brugt til at teste elevernes enheder15. Peristaltiske pumper er nyttige i visse indstillinger som cellekultur, især da gasudveksling er begrænset i PETLs. PDMS kan være mere fordelagtigt i denne henseende, selv om udvaskning kan være en bekymring5. Vi har forsøgt at producere hybrid PET/EVA-PDMS, men EVA vil ikke direkte overholde PDMS; Det er muligt, at overflade modifikation af sidstnævnte (f. eks. plasma behandling eller overfladeaktive behandlinger) kan løse dette problem. En anden tilgang, der kan sammenlignes med petls er mikro bearbejdning af kanaler ved hjælp af co2 laser ablation17,18 af PMMA. Vi har konstateret, at laserskæring er uforenelig med PET/EVA film, da den producerede varme har tendens til at helbrede EVA og producere ujævne kanal kanter. Brugen af passende laserudstyr kan også øge fremstillingsomkostningerne betydeligt.
Kort sagt, PETLs tilbyder flere fordele i forhold til de nuværende teknologier: (i) omkostningerne er betydeligt lavere end traditionelle metoder på grund af brugen af forbruger-grade materialer og udstyr, hvilket gør det let tilgængelige for både forskere og studerende. (II) anordninger kan designes, skæres og samles inden for minutter, hvilket giver mulighed for hurtig prototype-gentagelse og letter tidseffektive eksperimenter. (III) flere enheder kan fabrikeres samtidigt, hvilket giver mulighed for høj produktion af gennemløb. (IV) en række forskellige materialer kan inkorporeres, tilføjer alsidighed og giver mulighed for omfattende tilpasning. Den nuværende og fremtidige udvikling af nye funktionaliteter, som anvender denne teknologi, hviler på nye brugeres kreativitet og behov. Bred anvendelse af petl mikrofluidisk enheder vil sandsynligvis resultere i medtagelsen af nye materialer og konfigurationer, som brugere udvikle nye designs og tilgange til deres særlige behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Fernando Ontiveros er i færd med at lancere PETL FLUIDICS (LLC), et selskab, der vil kommercialisere og levere konsulentydelser til denne teknologi. Medforfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet i dette manuskript blev delvist støttet af National Science Foundation (NSF) (Grant No. CBET-1553826) (og tilhørende ROA supplement) og de nationale institutter for sundhed (NIH) (Grant nr. R35GM124935) til J.Z., og Notre Dame Melchor besøger fakultetet fond for at F.O. Vi vil gerne takke Jenna Sjoerdsma og basar Bilgiçer for at levere pattedyrsceller og kultur protokoller og Fabio Sacco for at hjælpe med supplerende tal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and Applications of Microfluidics in Biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 4 (1), 261-286 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3 (1), 335-373 (2001).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224 (2012).
- Zhang, B., Korolj, A., Lai, B. F. L., Radisic, M.
- Bartholomeusz, D. A., Boutte, R. W., Andrade, J. D. Xurography: rapid prototyping of microstructures using a cutting plotter. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (6), 1364-1374 (2005).
- Martínez-Hernández, K. J., Rovira-Figueroa, N. D., Ontiveros, F. Implementation and Assessment of Student-Made Microfluidic Devices in the General Chemistry Laboratory. , (2016).
- Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111 (2019).
- Subramaniam, A., Sethuraman, S. Chapter 18 - Biomedical Applications of Nondegradable Polymers. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , 301-308 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Oya, K., et al. Surface Characteristics of Polyethylene Terephthalate (PET) Film Exposed to Active Oxygen Species Generated via Ultraviolet (UV) Lights Irradiation in High and Low Humidity Conditions. Journal of Photopolymer Science and Technology. 27 (3), 409-414 (2014).
- Narciso, C. E., Contento, N. M., Storey, T. J., Hoelzle, D. J., Zartman, J. J. Release of Applied Mechanical Loading Stimulates Intercellular Calcium Waves in Drosophila Wing Discs. Biophysical Journal. 113 (2), 491-501 (2017).
- Suh, Y. K., Kang, S. A Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Weibel, D., Whitesides, G.
- Chen, X., Li, T., Shen, J. CO2 Laser Ablation of Microchannel on PMMA Substrate for Effective Fabrication of Microfluidic Chips. International Polymer Processing. 31 (2), 233-238 (2016).
- Chen, X., Shen, J., Zhou, M. Rapid fabrication of a four-layer PMMA-based microfluidic chip using CO2-laser micromachining and thermal bonding. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (10), 107001 (2016).
