Summary
Qui presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare dispositivi microfluidici personalizzati con un minimo investimento finanziario e temporale. L'obiettivo è facilitare l'adozione di tecnologie microfluidiche nei laboratori di ricerca biomedica e negli ambienti educativi.
Abstract
I dispositivi microfluidici consentono la manipolazione di fluidi, particelle, cellule, organi di microdimensioni o organismi in canali che vanno dalle scale nano-submillimetri. Un rapido aumento dell'uso di questa tecnologia nelle scienze biologiche ha spinto alla necessità di metodi accessibili a un'ampia gamma di gruppi di ricerca. Gli attuali standard di fabbricazione, come l'incollaggio PDMS, richiedono tecniche litografiche e di incollaggio costose e dispendiose in termini di tempo. Un'alternativa praticabile è l'uso di attrezzature e materiali che sono facilmente accessibili, richiedono competenze minime e consentono la rapida iterazione dei progetti. In questo lavoro descriviamo un protocollo per la progettazione e la produzione di PET-laminati (PETL), dispositivi microfluidici che sono economici, facili da fabbricare e consumano molto meno tempo per generare rispetto ad altri approcci alla tecnologia microfluidica. Sono costituiti da fogli di pellicola legati termicamente, in cui canali e altre caratteristiche sono definiti utilizzando una taglierina artigianale. I PETL risolvono sfide tecniche specifiche sul campo, riducendo drasticamente gli ostacoli all'adozione. Questo approccio facilita l'accessibilità dei dispositivi microfluidici sia in contesti di ricerca che educativi, fornendo una piattaforma affidabile per nuovi metodi di indagine.
Introduction
La microfluidica consente il controllo dei fluidi su piccole scale, con volumi che vanno dai microlitri (1 x 10-6 L) ai picoliri (1 x 10-12 L). Questo controllo è stato reso possibile in parte grazie all'applicazione di tecniche di microfabbricazione prese in prestito dall'industria deimicroprocessori 1. L'uso di reti di micro-dimensioni di canali e camere permette all'utente di sfruttare i fenomeni fisici distinti caratteristici di piccole dimensioni. Ad esempio, su scala micrometrica, i fluidi possono essere manipolati utilizzando il flusso laminare, dove le forze viscose dominano le forze inerziali. Di conseguenza, il trasporto diffuso diventa la caratteristica prominente della microfluidica e può essere studiato quantitativamente e sperimentalmente. Questi sistemi possono essere adeguatamente compresi utilizzando le leggi di Fick, la teoria del movimento browniano, l'equazione termica e/o le equazioni Dier-Stokes, che sono importanti derivazioni nei campi della meccanica dei fluidi e dei fenomeni di trasporto2.
Poiché molti gruppi nelle scienze biologiche studiano sistemi complessi a livello microscopico, originariamente si pensava che i dispositivi microfluidici avrebbero avuto un impatto immediato e significativo sulle applicazioni di ricerca in biologia2,3. Ciò è dovuto al fatto che la diffusione è dominante nel trasporto di piccole molecole attraverso le membrane o all'interno di una cellula, e le dimensioni delle cellule e dei microrganismi sono una corrispondenza ideale per sistemi e dispositivi sub-millimetrici. Pertanto, c'era un potenziale significativo per migliorare il modo in cui viene condotta la sperimentazione cellulare e molecolare. Tuttavia, l'ampia adozione delle tecnologie microfluidiche da parte dei biologi è rimasta indietro rispetto alle aspettative4. Una semplice ragione per la mancanza di trasferimento tecnologico può essere i confini disciplinari che separano ingegneri e biologi. La progettazione e la fabbricazione di dispositivi personalizzati sono rimaste appena al di fuori delle capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca biologici, rendendoli dipendenti da competenze e strutture esterne. La mancanza di familiarità con le potenziali applicazioni, i costi e il tempo necessario per l'iterazione della progettazione sono anche ostacoli significativi per i nuovi utenti. È probabile che queste barriere abbiano avuto l'effetto di interrompere l'innovazione e prevenire la diffusa applicazione della microfluidica per affrontare le sfide nelle scienze biologiche.
Un esempio: dalla fine degli anni '90 la fotolitografia morbida è stata il metodo di scelta per la fabbricazione di dispositivi microfluidici. La PDMS (polydimethylsiloxane, un polimero organico a base di silicone) è un materiale ampiamente utilizzato a causa delle sue proprietà fisiche, come la trasparenza, la deformabilità e la biocompatibilità5. La tecnica ha riscosso un grande successo, con dispositivi lab-on-a-chip e organ-on-a-chip continuamente sviluppati su questa piattaforma6. La maggior parte dei gruppi che lavorano su queste tecnologie, tuttavia, si trovano nei reparti di ingegneria o hanno forti legami con loro4. La litografia di solito richiede camere pulite per la fabbricazione di stampi e attrezzature di incollaggio specializzate. Per molti gruppi, questo rende i dispositivi PDMS standard meno ideali a causa dei loro costi di capitale e lead time, in particolare quando è necessario apportare modifiche di progettazione ripetute. Inoltre, la tecnologia è per lo più inaccessibile al biologo medio e agli studenti senza accesso a laboratori di ingegneria specializzati. È stato proposto che, affinché i dispositivi microfluidici siano ampiamente adottati, devono imitare alcune delle qualità dei materiali comunemente utilizzati dai biologi. Ad esempio, il polistirene utilizzato per la coltura cellulare e i bioasi sono economici, usa e getta e sono suscettibili alla produzione di massa. Al contrario, la produzione industriale di microfluidica basata su PDMS non è mai stata realizzata a causa della sua morbidezza meccanica, dell'instabilità del trattamento superficiale e della permeabilità del gas5. A causa di queste limitazioni, e con l'obiettivo di risolvere le sfide tecniche utilizzando dispositivi personalizzati costruiti "in-house", descriviamo un metodo alternativo che utilizza xurografia7,8,9 protocolli e laminazione termica. Questo metodo può essere adottato con poco capitale e investimenti di tempo.
I PETL sono fabbricati con pellicola in polietilene terephthalate (PET), rivestita con l'acetato di etilene-vinile termoadesivo (EVA). Entrambi i materiali sono ampiamente utilizzati nei prodotti di consumo, sono biocompatibili e sono prontamente disponibili al minimo costo10. La pellicola PET/EVA può essere ottenuta sotto forma di sacchetti o rotoli di laminazione. Utilizzando una fresa artigianale controllata dal computer che si trova comunemente nei negozi di hobbyo o artigianato, i canali sono tagliati da un singolo foglio di pellicola per definire l'architettura del dispositivo11. I canali vengono quindi sigillati applicando strati aggiuntivi di pellicola (o vetro) che vengono incollati utilizzando un laminatore termico (ufficio) (Figura 1A). Perforati, vengono aggiunti paraurti in vinile autoadesivi per facilitare l'accesso ai canali. I tempi di fabbricazione vanno da 5 a 15 min, il che consente una rapida iterazione di progettazione. Tutte le attrezzature e i materiali utilizzati per realizzare i PETL sono accessibili commercialmente e convenienti (<350 USD di costo di partenza, rispetto alle migliaia di USD per la litografia). Pertanto, i PETL forniscono una nuova soluzione a due problemi principali posti dalla microfluidica convenzionale: convenienza ed efficacia temporale (vedere PDMS/PETL confronto nelle tabelle supplementari 1, 2).
Oltre a fornire ai ricercatori l'opportunità di progettare e fabbricare i propri dispositivi, i PETL possono essere facilmente adottati in classe perché sono semplici e intuitivi da usare. I PETL possono essere inclusi nei programmi di scuola superiore e universitaria8, dove vengono utilizzati per aiutare gli studenti a comprendere meglio i concetti fisici, chimici e biologici, come la diffusione, il flusso laminare, la micromixing, la sintesi delle nanoparticelle, la formazione di gradienti e la chemiotassi.
In questo lavoro illustriamo il flusso di lavoro complessivo per la fabbricazione di chip PETL modello con diversi livelli di complessità. Il primo dispositivo viene utilizzato per facilitare l'imaging di cellule e micro-organi in una piccola camera. Il secondo, più complesso dispositivo è costituito da diversi strati e materiali, ed è utilizzato per la ricerca in meccanobiologia9. Infine, abbiamo costruito un dispositivo che mostra diversi concetti di fluidodinamica (messa a fuoco idrodinamica, flusso laminare, trasporto diffuso e micromixing) per scopi educativi. I progetti di flusso di lavoro e dispositivi qui presentati possono essere facilmente adattati per una vasta gamma di scopi sia nel campo della ricerca che in quello della classe.
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Protocol
1. Progettazione
- Identificare un'applicazione per i dispositivi ed elencare i componenti del canale/camera che saranno necessari.
NOTA: tutti i dispositivi richiedono canali di ingresso e di uscita. I dispositivi utilizzati per la microscopia richiederanno una camera di imaging. Dispositivi più complessi richiederanno canali e camere situate in più strati. - Iniziare disegnando a mano ogni livello, considerando il modo in cui la funzionalità del dispositivo è influenzata dalla sovrapposizione dei layer.
- Disegna i disegni finali su un computer utilizzando qualsiasi software che consenta di disegnare linee e forme.
- Disegna ogni livello separatamente utilizzando linee nere, continue e forme prive di sfumature. Si consiglia lo spessore della linea di 6 o più punti. In questa fase, le dimensioni delle caratteristiche del canale e della camera sono meno importanti delle proporzioni complessive.
- Utilizzare la funzione copia e incolla durante la creazione di feature e la sovrapposizione dei layer. Vedere La Figura 1B per esempi di disegni di layer.
- Importare ogni strato nel software di fresa artigianale (Figura 1C). A tale scopo, acquisire una schermata del progetto disegnato e utilizzare un approccio di trascinamento della selezione.
- Creare un nuovo documento nel software di fresa artigianale (download gratuito). Rilasciare il file di immagine sul tappetino visualizzato. Il software riconoscerà la maggior parte dei file di immagine.
- Ingrandire l'immagine per facilitare l'elaborazione tirando da un angolo. Il progetto può ora essere riconosciuto dal software utilizzando la funzione trace.
NOTA: Gli utenti possono produrre disegni de novo direttamente su questo software (utilizzare strumenti di disegno nella tavolozza di progettazione).
- Per tracciare il disegno, selezionare l'icona Traccia (forma di una farfalla) sul lato destro della finestra e selezionare completamente i disegni importati.
- Selezionare l'opzione Anteprima traccia con etichetta contorno. Regolare (se necessario) le impostazioni Soglia e Scala per regolare la traccia gialla in base al progetto.
- Selezionare Traccia dal menu Traccia quando la traccia gialla corrisponde al progetto. I canali sono ora visualizzati come contorno rosso. Se il contorno rosso corrisponde al disegno, l'immagine importata può essere selezionata ed eliminata. Il design è ora importato e pronto per il dimensionamento.
- Ridimensionare il dispositivo selezionando il disegno tracciato e utilizzando la griglia fornita dal software. Tirare per modificare la larghezza e la lunghezza di canali e camere.
NOTA: Il software fornisce misure e piccole linee possono essere disegnate temporaneamente (utilizzare la tavolozza di progettazione sul lato sinistro della finestra) per misurare le dimensioni all'interno del dispositivo. Le dimensioni funzionale della larghezza del canale vanno da 100 m a 900 m. È importante che tutti i layer siano dimensionati proporzionalmente, per garantire un corretto allineamento durante l'assemblaggio.- Dopo aver ridimensionato correttamente il progetto, selezionare lo strumento quadrato nel menu di disegno della forma per disegnare un quadrato/rettangolo intorno a ogni livello del dispositivo. Questa forma deve avere le stesse dimensioni per tutti i livelli. Vedere Figura 1C per esempi.
- Creare un livello superiore separato contenente le porte di accesso ai canali. I disegni semplici saranno costituiti da uno strato di canale principale (centrale), uno strato di sigillamento inferiore (spesso vetro) e uno strato superiore che dovrebbe contenere perforazioni circolari per accedere ai canali (prese/prese).
NOTA: i progetti contenenti più di tre livelli richiederanno perforazioni di insedio in più livelli (vedere Figura 1C, Figura 5A). Queste perforazioni possono essere già incluse nel progetto o possono essere aggiunte in questo momento.- Selezionare lo strumento di disegno sul lato sinistro dello schermo. Disegnare cerchi sulle porte di uscita e di uscita del progetto.
- Copiare e incollare sia il disegno originale che i cerchi. Cancellare i canali dal dispositivo sottostante.
NOTA: In questo modo le porte di uscita/uscita vengono lasciate nella posizione corretta corrispondente al progetto originale. Le forme possono anche essere aggiunte alla periferia di ogni livello per facilitare l'allineamento.
- Disporre tutti i layer da tagliare sul tappetino visualizzato. Il dispositivo è ora pronto per il taglio.
2. Taglio
- Applicare una singola pellicola PET/EVA (o altro materiale) di spessore preferito (3 mil è standard) sul tappetino adesivo. Assicurarsi che il lato adesivo (opaco) faccia verso l'alto e il lato di plastica (lucido) faccia verso il basso.
NOTA: Utilizzare guanti puliti per evitare di introdurre oli e microparticelle negli strati. - Appiattire il film contro il tappetino (Figura 1D), rimuovendo tutta l'aria che potrebbe essere stata intrappolata. Questo può essere fatto con le mani guantate o un rullo.
- Allineare il bordo del tappetino di taglio alla linea indicata sulla fresa. Caricare il tappetino premendo Load Mat sulla fresa. Mantenere l'impostazione sulla lama di taglio tra 3 e 5, a seconda dello spessore della pellicola.
- Collegare il cavo USB della fresa al computer.
- Selezionare la scheda SEND e selezionare un'impostazione di taglio.
NOTA: Una moltitudine di impostazioni sono disponibili nel menu a cascata. La -Sticker Paper, Clear- è un'impostazione che funziona bene con la pellicola PET/EVA che ha uno spessore di 3-5 mil (75-125 m). Modificare le impostazioni per materiali diversi e salvare le impostazioni personalizzate per un utilizzo futuro.
- Selezionare la scheda SEND e selezionare un'impostazione di taglio.
- Fare clic su Invia. Il taglio inizierà (Figura 1E). Assicurarsi che ci sia abbastanza spazio nella parte posteriore della fresa per il tappetino per muoversi senza ostacoli. Al termine, scaricare il tappetino selezionando Scarica sulla fresa. Non estrarre il tappetino prima dello scarico.
3. Allineamento
- Posizionare il tappetino di taglio accanto a una superficie pulita. Con le mani guantate, utilizzare un paio di pinzette per sollevare ogni strato del dispositivo microfluidica dal tappetino di taglio (Figura 1F). Prestare particolare attenzione intorno a curve e curve nel canale; questi sono particolarmente delicati e suscettibili allo strappo e alla deformazione.
- Posizionare gli strati del dispositivo microfluidica su una superficie pulita. Ordinarli in base alla loro posizione dall'alto verso il basso nel dispositivo (Figura 1G, Figura 2A, Figura 5A e Figura 7A).
- Tagliare piccoli pezzi di nastro a doppio lato (3 mm x 10 mm) che verranno utilizzati per collegare temporaneamente gli strati insieme.
- Sovrapporre gli strati uno per uno, iniziando con lo strato inferiore. Aggiungere un piccolo pezzo di nastro a due lati in un angolo tra i livelli, lontano da qualsiasi canale o insenature / prese (Figura 1G, freccia). Il nastro, anche se non richiesto, immobilizza gli strati e assicura che non si sposteranno durante la la mismina. Utilizzare un jig di filo per facilitare l'allineamento dei livelli nei dispositivi con più di 4 strati (Figura supplementare 3).
- Assicuratevi che il lato adesivo (matte-EVA) della pellicola sia sempre rivolto verso l'interno (parte interna a strati interni) del dispositivo.
AVVISO: L'adesivo esposto si scioglierà contro le parti interne del laminatore e le aderisce, causando non solo la perdita del dispositivo, ma influenza anche le prestazioni future del laminatore. - Una volta che tutti i livelli sono stati sovrapposti, ispezionare il dispositivo. Dovrebbe esserci almeno un lato EVA tra tutti gli strati, e nessun EVA dovrebbe essere esposto. Quando si introducono materiali non rivestiti EVA (ad esempio, pellicola di cloruro polivinile (PVC), potrebbe essere necessaria una pellicola rivestita con EVA su entrambi i lati, in particolare nel caso di dispositivi più complessi (Figura 5).
4. Laminazione
- Accendere e impostare il laminatore sull'impostazione dello spessore desiderata. Alcuni laminatori offrono impostazioni da 3 e 5 mil, mentre altri no. Per qualsiasi dispositivo con 4 o più strati, utilizzare l'impostazione 5-mil.
- Una volta che il laminatore è pronto, eseguire il dispositivo attraverso i rulli di laminazione ( Figura1H–I). Posizionare l'estremità su cui è stato aggiunto il doppio nastro laterale per ottenere i migliori risultati.
NOTA: Quando si fabbricano dispositivi di cinque o più strati, possono essere eseguiti attraverso il laminatore più di una volta. - Recuperare il dispositivo laminato.
NOTA: Si consiglia per i dispositivi di essere abbastanza grande da rendere facile il loro recupero dal laminatore. Questa considerazione non influisce sulle dimensioni dei canali o dell'architettura del chip, richiede semplicemente un "frame" che può facilmente passare attraverso il laminatore senza rimanere all'interno.
5. Porte di uscita/uscita
- Utilizzare un utensile rotante e una punta di perforazione da 1/32 per tagliare un piccolo foro attraverso il centro di un paraurti per mobili. In alternativa, utilizzare un punzone biopsia da 1 mm per perforare i paraurti.
NOTA: si consiglia una pressa per fori. Anche se le dimensioni variano, si consigliano paraurti da 2 mm x 6 mm di diametro. Evitare semplicemente di "pugnalare" il paraurti. A meno che il materiale non venga rimosso, il paraurti si sigilla nuovamente (Supplementary Figure 1). Le perforazioni come indicato sopra hanno lo scopo di interfacciarsi con tubi in polietiletofno (PEEK), una pipetta e una punta o un ago smussato (16-18 G). Le perforazioni più grandi possono essere ottenute utilizzando pinze a punzonatura girevoli (Figura supplementare 1). Questi sono utili quando il paraurti viene utilizzato come "riserva" per liquidi o altri aspetti biologici. - Assicurarsi che l'orifizio sia completamente chiaro rimuovendo eventuali detriti (causati dalla foratura o dalla punzonatura) con un paio di piccole pinzette.
- Dopo che le porte di uscita/uscita sono state cancellate con successo, allineare attentamente i paraurti con le porte di uscita/uscita sul dispositivo laminato (Figura 1J–K). Questo passaggio è essenziale per avere un corretto flusso di liquidi dentro e fuori il dispositivo. Tenere il paraurti dietro il dispositivo, posizionare la faccia adesiva rivolta verso l'uscita aperta/uscita sul dispositivo, quindi allineare e aderire. L'assemblaggio del dispositivo è stato completato.
6. Test
- Accedere alle architetture canale/camera tramite i paraurti perforati (porte). Ci sono diverse opzioni per quanto riguarda come introdurre fluidi e biologici nei dispositivi.
- Utilizzare tubi di laboratorio o medicali/chirurgici collegandolo a un connettore di plastica (ad esempio, adattatori Luer) o a un ago contundente. È inoltre possibile utilizzare una pipetta e una punta standard o tubi PEEK senza adattatori (Supplementary Figure 2).
- Eseguire l'infusione o il disegno di fluidi con siringhe e tubi utilizzando siringhe o pompe peristaltiche.
NOTA: Ci sono molte opzioni sul mercato, a partire da 300 USD al momento della scrittura. - Impostare impostazioni di portata diverse in base al dispositivo e all'esperimento.
NOTA: Usiamo regolarmente le impostazioni della portata nell'intervallo di 0,01–100 l/min, ma è possibile utilizzare altre tariffe.
Figura 1: fabbricazione. (A) Un laminatore da ufficio e una fresa artigianale sono gli unici due pezzi di equipaggiamento necessari per la fabbricazione. Entrambi sono disponibili online o presso i negozi di forniture per ufficio. Altri strumenti necessari includono forbici e pinzette. (B) Le architetture di canale e camera possono essere composte digitalmente utilizzando qualsiasi programma software che includa strumenti di disegno (la grafica vettoriale può essere preferita da alcuni utenti, ma non sono necessarie). Le linee e le forme vengono disegnate in nero con uno sfondo bianco. Il file o una cattura dello schermo del progetto può essere importato nel software di fresa artigianale trascinando e rilasciando. (C) Il software della fresa artigianale è disponibile gratuitamente per il download ed è necessario per controllare la fresa. Il software acquisisce il design e consente modifiche, come il dimensionamento. Fornisce anche strumenti di disegno. (D) Il tappetino di taglio trasporta la pellicola per il taglio. È leggermente adesivo, consentendo l'immobilizzazione dei materiali da tagliare. La figura mostra quattro diversi materiali pronti per il carico: 3 pellicole PET/EVA spesse 3 mil (in alto), pellicola PET/EVA spessa 5 mil (al centro), 6 mil-thick EVA/PET/EVA (in basso a sinistra) e pellicola IN PVC (in basso a destra). (E) Cutter è aperto per visualizzare la lama (in nero) unità e tappeto caricato. (F) Dopo il taglio, i singoli strati vengono sollevati utilizzando una pinzetta. I ritagli di canali e camere rimangono attaccati al tappetino e vengono successivamente rimossi e scartati. (G) I singoli strati sono allineati e sovrapposti per la laminazione. Piccoli pezzi di nastro a due lati (freccia) sono spesso utilizzati per facilitare l'allineamento e prevenire lo spostamento dello strato durante la laminazione. (H, I) Il dispositivo viene alimentato nella parte superiore del laminatore e recuperato attraverso lo slot. La laminazione fornisce un sigillo robusto, lasciando aperti i percorsi dei canali. (J, K) Per accedere ai canali, è necessario aggiungere paraurti in vinile perforati e autoadesivi. Image in (J) visualizza l'approccio "inverso" per l'allineamento, in cui il paraurti è posizionato dalla parte posteriore, consentendo l'allineamento visivo dell'insolozione/uscita con la perforazione del paraurti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Oltre al basso costo e alla rapida iterazione, la tecnologia PETL può essere facilmente personalizzata per risolvere problemi specifici. In primo luogo, viene descritto un semplice dispositivo costituito da una vetrina di vetro, uno strato di camera, uno strato di canale e uno strato di ingresso/uscita (Figura 2). Questo dispositivo è stato progettato per facilitare l'imaging di cellule e micro-organi sotto flusso costante. Il mezzo di coltura viene rifornito a basse portate per incoraggiare lo scambio di nutrienti e gas. La camera rotonda è dotata di un fondo di vetro, che consente l'imaging utilizzando un microscopio invertito. Ci sono almeno due motivi per l'uso del vetro in questo dispositivo. La prima è l'ottica. PET ed EVA sono termoplastiche utilizzate per la loro trasparenza ottica e flessibilità, e possono essere utilizzate come interfaccia per l'imaging (in particolare con bassi ingrandimenti9. La trasmissione della luce del PET nello spettro visibile varia da 87 a 90%12. Il vetro, tuttavia, ha migliori proprietà ottiche ed è lo standard utilizzato nell'imaging biologico. Il secondo motivo per usare il vetro è che le cellule finora testate (linee cellulari di mammiferi), tendono ad attaccarsi più facilmente ad esso che a PET/EVA (non trattate).
Figura 2: Camera semplice per microscopia invertita. (A) Il dispositivo è costituito da uno strato di vetro e tre strati PET/EVA (3 mil di spessore). Un coperchio di vetro (24 mm x 60 mm) è lo strato inferiore. Il livello successivo presenta il fondo della camera di imaging. Il layer successivo presenta la metà superiore della camera e lo collega al canale in/outlet. Così, l'altezza del canale è di soli 75 m, mentre l'altezza della camera è di 150 m. La larghezza del canale è determinata dall'utente (500 m è mostrato qui). Il livello superiore sigilla il percorso della camera/canale e fornisce l'accesso all'ingresso/sbocco. I livelli sovrapposti vengono visualizzati a destra. (B) Il dispositivo finito viene visualizzato infuso con tinri rosso per la visualizzazione. Il caricamento può essere ottenuto utilizzando una micropipetta e una punta, tubi di laboratorio o medici/chirurgici dotati di un ago contundente, o tubo PEEK, come mostrato. (C) Il design del canale/camera può essere iterato in un unico dispositivo (ad esempio, per facilitare l'osservazione di diversi campioni individuali). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le dimensioni dei canali e della camera in questo dispositivo sono degne di dettaglio. L'altezza nelle PETL è sempre una funzione dello spessore della pellicola o dello strato. PET/EVA disponibile in commercio ha uno spessore misurato in millesimi di pollice (1 mil e 25 m). Di conseguenza, le altezze dei canali e delle camere sono di solito multipli di 25 m. le PETL standard sono costruite utilizzando pellicole PET/EVA da 3 o 5 mil, il che si traduce in caratteristiche con un'altezza di 75 o 125 m. Il dispositivo illustrato nella Figura 2 presenta canali con un'altezza di 75 m e una camera definita da due strati, con un'altezza totale di 150 m. Va notato, tuttavia, che gli strati possono essere composti da diversi materiali (ad esempio, vetro, stagnola, PVC, carta) e possono presentare spessori variabili, di solito che vanno da 25 a 250 m.
Figura 3: Imaging cellulare. (A) La petL camera semplice può essere utilizzata per la coltura a breve termine di cellule aderenti. Le cellule aderiscono al vetro esposto nella camera e possono essere osservate utilizzando un microscopio invertito. (B) I bacinodi del ratto erano macchiati con colori fluorescenti a membrana di Hoechst (blu) e plasma (rosso) per la visualizzazione su un microscopio confocale invertito. (C) Immagine di campo luminoso delle celle in un semplice dispositivo camera. (D) Immagine a contrasto fase. Barra della scala bianca è 200 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La natura della fabbricazione PETL consente una notevole complessità nella progettazione del percorso fluido. Il semplice dispositivo camera è costituito da quattro strati contenenti caratteristiche in due livelli dell'asse z (canale e parte superiore della camera in un livello, inferiore della camera nel secondo livello). Un vantaggio offerto dai PETL è la facilità con cui è possibile costruire architetture di canali/camere tridimensionali. L'aggiunta di funzioni come canali di raffreddamento o riscaldamento, membrane di dialisi, circuiti elettrici o linee di pressione (vedi Figura 5) si ottiene collegando più strati in tre dimensioni. Un avvertimento finora incontrato è il limite sul numero di strati che possono essere laminati. Il trasferimento di calore necessario per la cura dell'EVA è risultato insufficiente nei dispositivi con uno spessore complessivo superiore a 800 m. Questa limitazione può essere risolta in alcuni dispositivi. In molti casi, è possibile laminare ogni volta che viene aggiunto un nuovo livello. Ciò non è possibile quando un nuovo strato richiede che il termoadesivo (EVA) affronti l'esterno del dispositivo.
Figura 4: Immagini microorganiche. (A) La semplice camera PETL viene utilizzata per immaginare un disco alano dell'embrione di Drosophila melanogaster (2x ingrandimento). Le dimensioni del disco alare sono di circa 90 m x 250 m x 500 m. Uno o più organi possono essere immagine attraverso la finestra coverslip. L'aumento degli ingrandimenti di un altro disco alare è mostrato in (B) 20x/0.75-air, (C) 40x/1.30-oil, e (D)100x/1.49-obiettivi di olio utilizzando una microscopia confocalsa del disco rotante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Lo studio delle cellule in coltura beneficia di strumenti che forniscono condizioni di stato dinamico come flusso costante o stimoli meccanici. Figura 3 fornisce un esempio in cui una linea cellulare di mammiferi viene coltivata e immagine in un semplice dispositivo camera. Il mezzo può essere costantemente scambiato durante l'imaging, consentendo non solo di mantenere condizioni di crescita ideali, ma anche per l'introduzione controllata di stimoli chimici durante l'imaging in tempo reale. Questo vale anche per l'imaging di micro-organi ex-vivo, come mostrato nella Figura 4. Le strutture del canale e della camera possono essere progettate con dimensioni specifiche per adattarsi a diversi campioni biologici, da organi o tessuti a organismi interi (ad esempio, embrioni di Drosophila e dischi immaginari o C. elegan).
Figura 5: Mechano-PETL. La semplice camera PETL viene modificata aggiungendo una camera di compressione. (A) Il dispositivo è costituito da sette strati con quattro diversi materiali: uno strato inferiore in vetro (coverslip, non mostrato), quattro strati PET/EVA 3 mil (strati di canale/camera, strato di distanziatore e strato di ingresso/uscita), uno strato EVA/PET/EVA 6 mil (tenuta canale/camera e adesione in PVC) e uno strato di PVC deformabile (per la compressione). (B, C) Il percorso del canale/camera del campione viene visualizzato utilizzando un tinrirosso rosso. Il percorso del canale/camera di compressione contiene solo aria. (D) La pressione dell'aria viene applicata manualmente (o meccanicamente) al percorso di compressione, con conseguente espansione della pellicola in PVC nella parte superiore della camera. L'espansione sposta il tinrito nella camera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La perturbazione meccanica degli esemplari biologici migliora la nostra comprensione della fisiologia cellulare e fa luce su processi come lo sviluppo embrionale e la differenziazione. Nella Figura 5 viene descritto un dispositivo PETL costituito da un semplice array di canali/camere e da una camera di compressione. Consiste (nella sua forma più semplice) di sei strati, uno dei quali è un film in PVC. La pellicola in PVC devia quando viene applicata la pressione dell'aria, causando la compressione degli esemplari all'interno della camera. Questo dispositivo è un esempio dell'uso di materiali diversi da PET/EVA, ed è stato impiegato con successo9 nella sostituzione di dispositivi PDMS/vetro utilizzati per studiare il carico meccanico sui micro-organi Drosophila 13 (come mostrato nella Figura 6). I dispositivi PETL sono riutilizzabili. Tuttavia, a causa del basso costo di fabbricazione, della riduzione dell'impronta e del potenziale di delaminazione dopo la manipolazione o il lavaggio continui, si consiglia l'uso di nuovi dispositivi all'inizio di ogni procedura.
Figura 6: Imaging meccanobiologia. (A) Un DE-cadherin::GFP che esprime il disco alare della Drosophila è ripreso all'interno di un meccano-PETL utilizzando un microscopio confocale a disco rotante a ingrandimento 20x. (B) La pressione attraverso la membrana sopra la camera può essere applicata azionando una siringa piena d'aria manualmente o utilizzando una pompa di siringa. La legge del gas ideale viene utilizzata per stimare la quantità di forza applicata alla membrana9. L'area del sacchetto del disco (linea tratteggiata bianca) è aumentata di circa il 30% (linea tratteggiata rossa) con l'applicazione di 4 psi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Grazie alla facilità di fabbricazione dei dispositivi PETL, abbiamo esplorato il loro uso in contesti educativi come la chimica, la biologia e le aule di ingegneria e i laboratori didattici. Un esempio di PETL educativo è illustrato nella figura 7. Il dispositivo è progettato per visualizzare alcune delle caratteristiche di base del flusso di fluido su microscala (ad esempio, flusso laminare). È costituito da quattro strati di pellicola PET/EVA da 5 mil (Figura 7A) e un'architettura di canale che include tre canali di input convergenti e una struttura serpentina. Al percorso sono state aggiunte "depressioni" circolari o "giù" al percorso per promuovere il micromixing14. Utilizzando una pompa di siringa, la soluzione fenolo rosso viene infusa attraverso le porte esterne, mentre la soluzione pH 9 viene infusa attraverso la porta centrale. La messa a fuoco idrodinamica15 viene visualizzata con il flusso del fluido esterno che forza il flusso interno in un flusso più piccolo (Figura 7C). Il flusso laminare nel dispositivo impedisce la miscelazione convettiva e la miscelazione graduale di diffusiva viene mostrata lungo la lunghezza del canale (frecce). Dispositivi come quello mostrato possono essere utilizzati per insegnare concetti (ad esempio, diffusione, flusso laminare) in fluidodinamica e biotrasporto. In alternativa, gli studenti possono essere invitati a progettare e fabbricare i propri dispositivi, un progetto che può essere intrapreso in una sessione di laboratorio regolare della durata di due o tre ore8.
Figura 7: PETL in classe. (A) Il dispositivo è fabbricato utilizzando quattro strati di pellicola PET/EVA da 5 mil. Il secondo livello (da destra a sinistra) presenta camere circolari che verranno posizionate sotto il percorso del canale. (B) Il dispositivo finito è stato caricato con l'indicatore di pH fenolo rosso (2 mM, giallo) e una soluzione trasparente pH 9 (canale centrale). Il rosso fenolo diventa magenta quando è a contatto con soluzioni di base. Le caselle indicano le aree visualizzate in (C) a (F). (C) Messa a fuoco idrodinamica. (D, E) flusso laminare e diffusione. (E, F) micromiscelazione. La barra della scala bianca è di 2 mm in tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Figura 1: Perforazione paraurti/porta. (A) Una configurazione della pressa per trapani che tiene uno strumento rotante facilita la perforazione del paraurti. Vengono utilizzati bit di perforazione di dimensioni 1/32" e 3/64.Drill bits of size 1/32" and 3/64" are used. (B) Il processo è efficiente e un gran numero di paraurti può essere elaborato in un breve lasso di tempo. (C) La perforazione del punzone biforico in biopsia è un'alternativa alla perforazione. (D) Una pinza turalante viene utilizzata per perforazioni più grandi. Queste perforazioni possono essere utilizzate per caricare campioni di grandi dimensioni (mediante ritiro liquido anziché infusione) o come serbatoi di supporti. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 2: Tubing. (A) Laboratorio o tubi medici/chirurgici (1/32" ID, 3/32" OD) è l'opzione più semplice. È flessibile e facile da tagliare. Richiede l'uso di aghi smussati da 18 G. (B) Uno degli aghi è attaccato alla siringa utilizzando l'adattatore Luer (rosa), che viene rimosso da un secondo ago in modo che possa essere montato sul tubo. (C) I ricercatori che hanno già familiarità con i tubi PEEK (0,010" ID, 1/32" OD) possono utilizzarlo con PETL. (D) Raccordi PEEK. (E) Pompa di siringa istituito è lo stesso per entrambi i tipi di tubi. (F) L'installazione di tubi di laboratorio o medici/chirurgici richiederà perforazioni con una punta di perforazione da 3/64,mentre i tubi PEEK avranno bisogno di perforazioni da 1/32". Le perforazioni fatte con un punzone biopsia da 1 mm possono ospitare entrambi i set di tubi. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 3: Allineamento con un filo jig. Il design del dispositivo può includere perforazioni che possono servire come guide per l'allineamento di diversi livelli. Le maschere di filo sono disponibili in commercio per circa 20 USD. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare Figura 4: Limitazioni di dimensione. Sebbene le frese artigianali siano in grado di tagliare canali diritti che hanno una larghezza di 100 m (A), la precisione dei modelli di taglio è notevolmente diminuita per le caratteristiche che misurano 150 m o meno (B). Le dimensioni accanto alle forme indicano la larghezza del canale. Clicca qui per scaricare questa figura.
Tabella supplementare 1: Tempi e costi per la fabbricazione di chip microfluidico nel PDMS. Tempo di produzione quando wafer/muffè è prontamente disponibile e PDMS può essere curato utilizzando un forno. Qualsiasi modifica del progetto rappresenta un ritardo di diversi giorni. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 2: Tempi e costi per la fabbricazione di chip microfluidico PETL. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Mentre la microfluidica è sempre più presente nella serie di laboratori di tutto il mondo, il ritmo di adozione è stato deludente, data la potenziale del suo impatto positivo16. Il basso costo e l'elevata efficienza della fabbricazione di dispositivi microfluidici sono essenziali per accelerare l'adozione di questa tecnologia nel laboratorio di ricerca medio. Il metodo qui descritto utilizza più strati di pellicola per creare dispositivi bi e tre dimensionali a una frazione del tempo e dei costi richiesti dai metodi litografici. La litografia standard costa migliaia di dollari (USD) per l'avvio e richiede giorni per la fabbricazione, il costo di avvio della fabbricazione di PETL è inferiore a 350 USD e i dispositivi possono essere fabbricati in pochi minuti. Questo facilita la loro adozione non solo nel laboratorio di ricerca, ma anche in ambienti in cui l'iterazione rapida è vantaggiosa (ad esempio, la prototipazione per i dispositivi PDMS standard), o dove è richiesta la produzione industriale di dispositivi economici e usa e getta. Ad esempio, i PETL possono essere fabbricati utilizzando materiali biodegradabili e possono essere adattati per il loro utilizzo nel campo sanitario, rendendoli ideali come strumenti di diagnostica. Possono essere utilizzati in classe, sia come materiali didattici prefabbricati che come sfida creativa, in cui gli studenti progettano, fabbricano e testano i propri dispositivi.
La fabbricazione di PETL è semplice. È tuttavia utile identificare i passaggi critici e le attuali limitazioni di questa tecnica. Alcuni utenti scopriranno che lo scambio di gas nei dispositivi PETL è ridotto rispetto ai dispositivi PDMS, il che è compensato dal flusso continuo di supporti durante la sperimentazione. Un'altra limitazione è il dimensionamento. I canali e le altre funzioni di dimensioni inferiori a 150 m sono inferiori al limite di risoluzione della fresa (Figura 4 supplementare). Si consiglia di lavorare con canali con una larghezza compresa tra 200 e 900 m. Questi limiti sono flessibili e tendono a variare in particolare alla soglia superiore. Ad esempio, i canali con un'altezza di 75 m si comprimeranno quando la larghezza del canale è pari o superiore a 950 m, ma rimangono aperti se l'altezza aumenta. Anche se l'architettura del dispositivo varia a seconda dell'applicazione, usiamo regolarmente canali con un'altezza di 75 o 125 m, e una larghezza di 400-600 m.
L'attenzione ai dettagli quando si allineano strati e paraurti è importante. La maggior parte delle poche complicazioni derivanti dalla fabbricazione petL sono il risultato di problemi di allineamento. EVA esposto al momento della laminazione può aderire ai rulli interni e renderli inutilizzabili. L'infusione di liquidi può essere bloccata da un paraurti mal posizionato. Fortunatamente, i PETL non solo sono economici, ma sono anche rapidamente costruiti, quindi i dispositivi difettosi possono essere facilmente sostituiti o modificati.
I PETL possono resistere a velocità di flusso di infusione simili a quelle utilizzate in altri dispositivi microfluidici. Anche se da 0,01 a 100 luna/min è la gamma utilizzata dal nostro gruppo, è possibile utilizzare una portata fino a 500 l/min (e forse superiore quando si utilizzano micropipette azionate a mano). Abbiamo scoperto che i PETL possono resistere alle pressioni nell'intervallo compreso tra 30 e 57 psi8. Pompe siringhe sono raccomandati per la maggior parte delle impostazioni sperimentali, anche se non sono un requisito assoluto. In classe, i burettes sono stati utilizzati per testare i dispositivi deglistudenti 15. Le pompe peristalitiche sono utili in determinati ambienti come la coltura cellulare, in particolare perché lo scambio di gas è limitato nelle PETL. PDMS può essere più vantaggioso a questo proposito, anche se la lisciviazione può essere una preoccupazione5. Abbiamo tentato di produrre PET/EVA-PDMS ibridi, ma EVA non aderisce direttamente al PDMS; è possibile che la modifica della superficie di quest'ultimo (ad esempio, il trattamento al plasma o i trattamenti surfactant) possa risolvere questo problema. Un altro approccio che può essere paragonato alle PETL è la micro lavorazione dei canali che utilizzano l'ablazione laser CO2 17,18 di PMMA. Abbiamo scoperto che il taglio laser è incompatibile con la pellicola PET/EVA, poiché il calore prodotto tende a curare l'EVA e a produrre bordi di canale irregolari. L'uso di attrezzature laser adeguate potrebbe anche aumentare significativamente i costi di fabbricazione.
In sintesi, i PETL offrono molteplici vantaggi rispetto alle tecnologie attuali: (i) i costi sono significativamente inferiori ai metodi tradizionali grazie all'uso di materiali e attrezzature di qualità consumer, rendendoli facilmente accessibili sia ai ricercatori che agli studenti. ii) I dispositivi possono essere progettati, tagliati e assemblati in pochi minuti, il che consente una rapida iterazione del prototipo e facilita la sperimentazione economica. (iii) È possibile fabbricare più dispositivi contemporaneamente, consentendo una produzione ad alta velocità effettiva. (iv) Una varietà di materiali può essere incorporata, aggiungendo versatilità e consentendo un'ampia personalizzazione. Lo sviluppo attuale e futuro di nuove funzionalità che utilizzano questa tecnologia dipende dalla creatività e dalle esigenze dei nuovi utenti. Un'ampia adozione di dispositivi microfluidici PETL porterà probabilmente all'inclusione di nuovi materiali e configurazioni, poiché gli utenti sviluppano nuovi progetti e approcci per le loro esigenze particolari.
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Disclosures
Fernando Ontiveros è in procinto di lanciare PETL FLUIDICS (LLC), una società che commercializzerà e fornirà servizi di consulenza per questa tecnologia. I coautori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro in questo manoscritto è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (NSF) (Grant No. CBET-1553826) (e supplemento DI ROA associato) e il National Institutes of Health (NIH) (Grant No. R35GM124935) a J.e. Ringraziamo Jenna Sjoerdsma e Basar Bilgiàer per aver fornito cellule di mammiferi e protocolli di coltura e Fabio Sacco per l'assistenza con cifre supplementari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
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