Summary
Здесь мы представляем протокол для разработки и изготовления пользовательских микрофлюидных устройств с минимальными финансовыми и временные инвестиции. Цель заключается в содействии внедрению микрофлюидных технологий в биомедицинских исследовательских лабораториях и учебных заведениях.
Abstract
Микрофлюидные устройства позволяют манипулировать жидкостями, частицами, клетками, микроразмерными органами или организмами в каналах от нано до субмиллиметровых чешуек. Быстрое расширение использования этой технологии в биологических науках обусловило необходимость в методах, доступных широкому кругу исследовательских групп. Современные стандарты изготовления, такие как связь PDMS, требуют дорогостоящих и трудоемких методов литографической связи и склеивания. Целесообразной альтернативой является использование оборудования и материалов, которые легко доступны по цене, требуют минимального опыта и позволяют быстро итерации конструкций. В этой работе мы описываем протокол для проектирования и производства ПЭТ-ламината (PETLs), микрофлюидных устройств, которые являются недорогими, легко изготовить, и потребляют значительно меньше времени для генерации, чем другие подходы к технологии микрофлюиды. Они состоят из термически связанных листов пленки, в которых каналы и другие характеристики определены используя резак корабля. ПЕТЛ решают технические проблемы, связанные с конкретными местами, в то же время значительно уменьшая препятствия на пути их принятия. Такой подход облегчает доступность микрофлюидных устройств как в исследовательских, так и в учебных заведениях, обеспечивая надежную платформу для новых методов исследования.
Introduction
Микрофлюитика позволяет контролировать жидкость в небольших масштабах, с объемами от микролитров (1 х 10-6 л) до пиколитеров (1 х 10-12 л). Этот контроль стал возможным отчасти благодаря применению методов микрофабрикации, заимствованных из микропроцессорной промышленности1. Использование микроразмерных сетей каналов и камер позволяет пользователю воспользоваться отдельными физическими явлениями, характерными для малых размеров. Например, в масштабе микрометра жидкостями можно манипулировать с помощью ламинарного потока, где вязкие силы доминируют в инерционных силах. В результате диффузный транспорт становится заметной особенностью микрофлюидики, и может быть изучен количественно и экспериментально. Эти системы могут быть правильно поняты с помощью законов Фика, теории броуновского движения, уравнения тепла, и / или уравнения Навье-Стокса, которые являются важными производными в области механики жидкости и транспортных явлений2.
Потому что многие группы в биологических науках исследования сложных систем на микроскопическом уровне, первоначально считалось, что микрофлюидные устройства будут иметь немедленное и значительное влияние на научно-исследовательские приложения в биологии2,3. Это связано с тем, что диффузия доминирует в переносе малых молекул через мембраны или внутри клетки, а размеры клеток и микроорганизмов идеально подходят для субмиллиметровых систем и устройств. Таким образом, существует значительный потенциал для повышения способа проведения клеточных и молекулярных экспериментов. Однако широкое внедрение биологами микрофлюидных технологий отстает от ожиданий4. Простой причиной отсутствия передачи технологии могут быть дисциплинарные границы, разделяющие инженеров и биологов. Индивидуальные разработки и изготовление устройств остаются вне возможностей большинства групп биологических исследований, что делает их зависимыми от внешних знаний и возможностей. Отсутствие знакомства с потенциальными приложениями, затраты и время, необходимое для проектирования итерации, также являются значительными барьерами для новых пользователей. Вполне вероятно, что эти барьеры привели к подрыву инноваций и предотвращению широкого применения микрофлюиди для решения проблем в биологических науках.
В качестве примера можно привести: с конца 1990-х годов мягкая фотолитография является методом выбора для изготовления микрофлюидных устройств. PDMS (полидиметилсилоксан, органический полимер на силиконовой основе) является широко используемым материалом из-за его физических свойств, таких как прозрачность, деформируемость и биосовместимость5. Техника пользуется большим успехом, с лабораторией-на-чип е и орган-на-чип устройств постоянно разрабатываются на этой платформе6. Большинство групп, работающих над этими технологиями, однако, находятся в инженерных отделов или имеют прочные связи с ними4. Литография обычно требует чистых комнат для изготовления форм и специализированного оборудования связи. Для многих групп это делает стандартные устройства PDMS менее идеальными из-за их капитальных затрат и времени, особенно когда возникает необходимость в повторных изменениях дизайна. Кроме того, технология в основном недоступна для среднего биолога и студентов, не имеющих доступа к специализированным инженерным лабораториям. Было предложено, чтобы микрофлюидные устройства были широко приняты, они должны имитировать некоторые качества материалов, обычно используемых биологами. Например, полистирол, используемый для клеточной культуры и биоассы, является недорогим, одноразовым и поддарен для массового производства. В отличие от этого, промышленное производство микрофлюиды на основе PDMS никогда не реализовывалось из-за его механической мягкости, нестабильности поверхностной обработки и проницаемости газа5. Из-за этих ограничений, и с целью решения технических проблем с помощью индивидуальных устройств, построенных "в доме", мы описываем альтернативный метод, который использует ксурографию7,8,9 протоколов и теплового ламинирования. Этот метод может быть принят с небольшим капиталом и время инвестиций.
ПЕТЛ изготавливаются с использованием полиэтиленовой терафталатной (ПЭТ) пленки, покрытой термоадхесивным этилен-виниловым ацетатом (EVA). Оба материала широко используются в потребительских продуктах, являются биосовместимыми и легко доступны при минимальныхзатратах 10. Пленка PET/EVA может быть получена в виде ламинирующих сумок или рулонов. Используя управляемый компьютером резак, обычно встречающихся в любительских или ремесленных магазинах, каналы вырезаются из одного кинолиста для определения архитектуры устройства11. Каналы затем герметится, применяя дополнительные пленки (или стеклянные) слои, которые связаны с помощью (офис) теплового ламинатора (Рисунок 1A). Перфорированные, самоклеящиеся виниловые бамперы добавляются для облегчения доступа к каналам. Время изготовления колеблется от 5 до 15 мин, что позволяет быстро итерацию конструкции. Все оборудование и материалы, используемые для изготовления PETL, являются коммерчески доступными и доступными (350 долларов США стартовая стоимость, по сравнению с тысячами USDs для литографии). Таким образом, ПЕТЛ обеспечивают новое решение двух основных проблем, связанных с обычными микрофлюиками: доступность и эффективность времени (см. сравнение PDMS/PETL в дополнительных таблицах 1, 2).
В дополнение к предоставлению исследователям возможность разрабатывать и изготавливать свои собственные устройства, PETLs могут быть легко приняты в классе, потому что они просты и интуитивно понятны в использовании. PETLs могут быть включены в средней школы и колледжа учебные программы8, где они используются, чтобы помочь студентам лучше понять физические, химические и биологические концепции, как диффузия, ламинарный поток, микромикс, синтез наночастиц, градиент образования и химиотаксиса.
В этой работе мы иллюстрируем общий рабочий процесс для изготовления чипов PETL модели с различными уровнями сложности. Первое устройство используется для облегчения визуализации клеток и микроорганов в небольшой камере. Второе, более сложное устройство состоит из нескольких слоев и материалов, и используется для исследований в механобиологии9. Наконец, мы создали устройство, которое отображает несколько концепций динамики жидкости (гидродинамическая фокусировка, ламинарный поток, диффузный транспорт и микромиксинг) для образовательных целей. Представленный здесь проект рабочего процесса и устройств может быть легко адаптирован для широкого спектра целей как в исследовательских, так и в классе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дизайн
- Определите приложение для устройств и перечислите компоненты канала/камеры, которые потребуются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все устройства потребуют входных и выходных каналов. Устройства, используемые для микроскопии, потребуют камеры визуализации. Более сложные устройства потребуют каналов и камер, расположенных в нескольких слоях. - Начните с ручного рисования каждого слоя, учитывая, как функциональность устройства зависит от суперпозиции слоев.
- Нарисуйте окончательные проекты на компьютере с помощью любого программного обеспечения, которое позволяет рисовать линии и формы.
- Нарисуйте каждый слой отдельно, используя черные, сплошные линии и формы, лишенные оттенков. Толщина линии 6 или более точек рекомендуется. На данном этапе размеры функций канала и камеры менее важны, чем общие пропорции.
- Используйте функцию копирования и вставки при создании функций и наложения слоев. На рисунке 1B можно ознакомиться с примерами рисунков слоя.
- Импортировать каждый слой в программное обеспечение резак судов(Рисунок 1C). Сделайте это, сделав захват экрана нарисованного дизайна и используя подход перетаскивания и падения.
- Создайте новый документ в программном обеспечении для резец ремесла (бесплатно скачать). Бросьте файл изображения на отображаемом коврике. Программное обеспечение будет распознавать большинство файлов изображений.
- Увеличите изображение, чтобы облегчить обработку, потянув из угла. Теперь конструкция может быть распознана программным обеспечением с помощью функции трассировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут производить de novo конструкции непосредственно на этом программном обеспечении (использовать инструменты рисования в дизайне палитры).
- Чтобы проследить дизайн, выберите значок Trace (форма бабочки) на правой стороне окна и полностью выберите импортируемые конструкции.
- Выберите опцию Trace Preview с меткой. Отрегулируйте (при необходимости) настройки порога и шкалы, чтобы настроить желтый след в соответствии с дизайном.
- Выберите Trace из меню Trace, как только желтый след соответствует дизайну. Каналы теперь отображаются как красный контур. Если красный контур соответствует дизайну, импортируемое изображение может быть выбрано и удалено. Конструкция теперь импортируется и готова для размеров.
- Размер устройства, выбрав прослеживается дизайн и с помощью сетки, предоставляемой программным обеспечением. Потяните, чтобы изменить ширину и длину каналов и камер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение обеспечивает измерения, и небольшие линии могут быть нарисованы временно (использовать палитру дизайна на левой стороне окна) для измерения размеров внутри устройства. Функциональные размеры ширины канала колебллись от 100 мкм до 900 мкм. Размеры, возможно, придется корректировать после тестирования первоначальных прототипов. Важно, чтобы все слои были пропорционально, чтобы обеспечить правильное выравнивание во время сборки.- После правильного размера конструкции выберите квадратный инструмент в меню рисования формы, чтобы нарисовать квадрат/прямоугольник вокруг каждого слоя устройства. Эта форма должна быть одинакового размера для всех слоев. Спример.
- Создайте отдельный верхний слой, содержащий порты доступа к каналам. Простые конструкции будут состоять из основного (среднего) слоя канала, нижнего уплотнительного слоя (часто стекла) и верхнего слоя, который должен содержать круговые перфорации для доступа к каналам (входы/розетки).
ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкции, содержащие более трех слоев, потребуют перфорации ввыхода/выхода в несколько слоев (см. рисунок 1C, рисунок 5A). Эти перфорации могут быть уже включены в дизайн, или могут быть добавлены в это время.- Выберите инструмент рисования на левой стороне экрана. Нарисуйте круги над впуском и выходом портов дизайна.
- Копировать и вставить как оригинальный дизайн и круги. Стереть каналы с базового устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставляет входе / выход портов в правильном положении, соответствующие первоначальному дизайну. Формы также могут быть добавлены к периферии каждого слоя, чтобы помочь с выравниванием.
- Упорядочить все слои, которые будут сокращены на отображаемом коврике. Устройство теперь готово к резке.
2. Резка
- Нанесите на клейкую режущий коврик (или другой материал) предпочтительной толщины (3 млн. Убедитесь, что клей (матовый) стороны лица вверх и пластиковые (блестящие) стороны лица вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистые перчатки, чтобы избежать введения масла и микрочастицы в слоях. - Сгладить пленку против коврика (Рисунок 1D), удаление всего воздуха, который, возможно, были в ловушке. Это можно сделать с помощью рук в перчатках или ролика.
- Выровнять край режущего коврика к линии, указанной на резаке. Загрузите коврик, нажав на резак. Держите настройки на резке лезвия между 3 и 5, в зависимости от толщины пленки.
- Подключите резак USB-кабель к компьютеру.
- Выберите вкладку SEND и выберите настройку резки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Множество настроек доступны в каскадном меню. The-Sticker Paper, Clear- это параметр, который хорошо работает с ПЭТ / EVA фильм, который имеет толщину 3-5 млн (75-125 мкм). Измените настройки для различных материалов и сохраните пользовательские настройки для использования в будущем.
- Выберите вкладку SEND и выберите настройку резки.
- Нажмите Отправить. Начнется резка(рисунок 1E). Убедитесь, что есть достаточно места в задней части резака для коврика, чтобы двигаться беспрепятственно. Когда резак закончен, выгрузите коврик, выбрав разгрузку на резак. Не вытягивайте коврик перед разгрузкой.
3. Выравнивание
- Поместите режущий коврик рядом с чистой поверхностью. С перчатками руки, используйте пару пинцета, чтобы поднять каждый слой устройства microfluidics от разреза коврик(Рисунок 1F). Будьте особенно осторожны вокруг поворотов и поворотов в канале; они особенно деликатны и восприимчивы к разрыву и деформации.
- Поместите слои устройства микрофлюики на чистую поверхность. Заказать их в соответствии с их сверху вниз позиции в устройстве(Рисунок 1G, Рисунок 2A, Рисунок 5А и Рисунок 7A).
- Вырезать небольшие (3 мм х 10 мм) кусочки двусторонней ленты, которые будут использоваться для временного присоединения слоев вместе.
- Накладывайте слои один за 1, начиная с нижнего слоя. Добавьте небольшой кусочек двусторонней ленты в угол между слоями, вдали от любых каналов или входов/выходов(рисунок 1G,стрелка). Лента, хотя и не требуется, обездвиживает слои и уверяет, что они не будут сдвиг во время ламинирования. Используйте проволочный джиг для облегчения выравнивания слоев в устройствах с более чем 4 слоями(Дополнительная диаграмма 3).
- Убедитесь, что клей (мат-EVA) сторона пленки всегда сталкивается с внутренней (внутри слоя части) устройства.
ВНИМАНИЕ: Обнажение клей будет таять против внутренних частей ламинатора и придерживаться их, в результате не только в потере устройства, но и влияет на будущую производительность ламинатора. - После того, как все слои были наложены, проинспектировать устройство. Между всеми слоями должна быть по крайней мере одна сторона EVA, и EVA не должна подвергаться воздействию. При введении материалов с покрытием, не входящих в EVA (например, пленка поливинилхлорид (ПВХ), стекло), пленка с покрытием EVA с обеих сторон может потребоваться, особенно в случае более сложных устройств(рисунок 5).
4. Ламинирование
- Включите и установите ламинатор в желаемую настройку толщины. Некоторые ламинаторы предлагают 3 и 5 миль настройки, в то время как некоторые нет. Для любого устройства с 4 или более слоев используйте 5-мильную настройку.
- Как только ламинатор будет готов, запустите устройство через ламинированные ролики(рисунок 1H-I). Поместите конец, к которому двойная лента была добавлена для достижения наилучших результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При изготовлении устройств из пяти или более слоев, они могут быть запущены через ламинатор более одного раза. - Восстановить ламинированное устройство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется для устройств, чтобы быть достаточно большим, чтобы сделать легко их восстановление от ламинатора. Это соображение не влияет на размер каналов или архитектуры чипа, он просто требует "рамки", которая может легко пройти через ламинатор, не оставаясь внутри.
5. Впускные/выходные порты
- Используйте роторный инструмент и 1/32 дюйма сверло бит, чтобы вырезать небольшое отверстие через центр бампера мебели. Кроме того, используйте 1 мм биопсии удар перфорировать бамперы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется буровой пресс. Хотя размеры варьируются, 2 мм х 6 мм диаметр бамперов рекомендуется. Избегайте просто "заколоть" бампер. Если материал не будет удален, бампер будет уплотнения снова(Дополнительная рисунок 1). Перфорации, как указано выше, предназначены для взаимодействия с политереторкетоном (PEEK) трубкой, пипеткой и кончиком, или тупой иглой (16-18 G). Большие перфорации могут быть достигнуты с помощью вращающихся плоскогубцев удар(Дополнительный рисунок 1). Они полезны, когда бампер используется в качестве "резервуара" для жидкостей или других биологических веществ. - Убедитесь, что это может быть полностью прозрачно, удалив любой мусор (вызванный бурением или штамповкой) с парой небольших пинцетов.
- После того, как порты входе/выхода успешно очищаются, тщательно выровняйте бамперы с портами входе/выходом на ламинированном устройстве(рисунок 1J-K). Этот шаг необходим для правильного потока жидкостей в и из устройства. Держите бампер позади устройства, положение клей лицо мягче открытой входе / розетки на устройстве, затем выровнять и придерживаться. Сборка устройств завершена.
6. Тестирование
- Доступ к архитектуре канала/камеры через перфорированные бамперы (порты). Есть несколько вариантов относительно того, как ввести жидкости и биологические препараты в устройствах.
- Используйте лабораторные или медицинские/хирургические трубки, прикрепив ее к пластиковому разъему (например, адаптеры Luer) или к тупой игле. Также можно использовать стандартный пипетка и наконечник или трубки PEEK без адаптеров(Дополнительная диаграмма 2).
- Выполните настой или рисунок жидкости со шприцев и труб с помощью шприцев или перистальтических насосов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть много вариантов на рынке, начиная с 300 долларов США на момент написания. - Установите различные настройки скорости потока в зависимости от устройства и эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем параметры скорости потока в диапазоне 0,01-100 л/мин, но другие ставки могут быть использованы.
Рисунок 1: Изготовление. (A) Офисный ламинатор и резец ремесла являются единственными двумя единицами оборудования, необходимого для изготовления. Оба доступны в Интернете или в магазинах ремесел / канцелярских принадлежностей. Другие необходимые инструменты включают ножницы и пинцет. (B) Нормандская и камерная архитектуры могут быть составлены в цифровом виде с помощью любой программной программы, которая включает в себя инструменты рисования (векторная графика может быть предпочтительна для некоторых пользователей, но не требуется). Линии и фигуры нарисованы черным цветом с белым фоном. Файл или захват экрана дизайна могут быть импортированы в программное обеспечение резак ремесла путем перетаскивания и падения. (C) Craft резак программное обеспечение доступно бесплатно для скачивания и требуется для управления резак. Программное обеспечение приобретает дизайн и позволяет для модификаций, как размер. Он также предоставляет инструменты рисования. (D) Режущий коврик несет пленку для резки. Это слегка клей, что позволяет обездвижить материалы должны быть сокращены. На рисунке показаны четыре различных материала, готовых к загрузке: 3 мили толщиной ПЭТ/EVA пленки (вверху), 5 миль толщиной ПЭТ / EVA пленки (средний), 6 миль толщиной EVA / ПЭТ / EVA (внизу слева) и ПВХ пленки (внизу справа). (E) Cutter открыт для отображения лезвия (в черном) единицы и загружены коврик. (F) После резки, отдельные слои поднимаются с помощью пинцета. Вырезать выходы каналов и камер остаются прикреплены к коврику, а затем удалены и отбрасываются. (G) Индивидуальные слои выровнены и накладываются для ламинации. Небольшие кусочки двусторонней ленты (стрелка) часто используются для выравнивания и предотвращения смещения слоя во время ламинирования. (H, I) Устройство подается в верхней части ламинатора и восстанавливается через слот. Ламинирование обеспечивает надежное уплотнение, оставляя пути канала открытыми. (J, K) Для того, чтобы получить доступ к каналам, необходимо добавить перфорированные, самоклеящиеся виниловые бамперы. Изображение в (J) отображает "обратный" подход к выравниванию, в котором бампер помещается со спины, что позволяет визуальное выравнивание входе / розетки с перфорацией бампера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В дополнение к низкой стоимости и быстрой итерации, технология PETL может быть легко настроена для решения конкретных задач. Во-первых, мы описываем простое устройство, состоящее из стеклянного крышки, камерного слоя, слоя канала и впускного/выходного слоя(рисунок 2). Это устройство было разработано для облегчения визуализации клеток и микроорганов под постоянным потоком. Культурная среда пополняется при низких темпах потока для поощрения обмена питательными веществами и газом. Круглая камера имеет стеклянное дно, что позволяет для визуализации с помощью перевернутого микроскопа. Есть по крайней мере две причины для использования стекла в этом устройстве. Первый - оптика. ПЭТ и EVA являются термопластика, используемые для их оптической прозрачности и гибкости, и может быть использован в качестве интерфейса для визуализации (особенно при низких увеличениях9. Световая передача ПЭТ в видимом спектре колеблется от 87 до 90%12. Стекло, однако, имеет лучшие оптические свойства и является стандартом, используемым в биологической визуализации. Вторая причина для использования стекла является то, что клетки до сих пор испытания (mammalian клеточных линий), как правило, прикрепляются более легко к нему, чем (необработанные) ПЭТ / EVA.
Рисунок 2: Простая камера для перевернутой микроскопии. (A) Устройство состоит из одного стеклянного слоя и трех слоев ПЭТ/ЭВА (толщиной 3 млн. Стеклянный ковер (24 мм х 60 мм) является нижним слоем. Следующий слой имеет нижнюю часть камеры изображения. Следующий слой имеет верхнюю половину камеры и соединяет ее с каналом вв/ауте. Таким образом, высота канала составляет всего 75 мкм, в то время как высота камеры составляет 150 мкм. Ширина канала определяется пользователем (500 мкм показано здесь). Верхний слой уплотняет путь камеры/канала и обеспечивает доступ к входным/торговым точкам. Накладные слои отображаются справа. (B) Готовое устройство показано настоянный с красным краситель для визуализации. Загрузка может быть достигнута с помощью микропайпетта и кончика, лабораторных или медицинских / хирургических труб оснащентупом иглой, или PEEK трубки, как показано на рисунке. (C) Конструкция канала/камеры может быть итерирована в одном устройстве (например, для облегчения наблюдения нескольких отдельных образцов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Размеры каналов и камеры в этом устройстве стоит описать. Высота в ПЕТВсегда всегда зависит от толщины пленки или слоя. Коммерчески доступные ПЭТ/ЭВА имеют толщину, измеряемую в тысячных дюйма (1 миля 25 мкм). Таким образом, высота канала и камеры, как правило, кратные 25 мкм. Стандартные PETLs построены с использованием 3 или 5 миль ПЭТ / EVA пленки, в результате чего функции, имеющие высоту 75 или 125 мкм. Устройство, показанное на рисунке 2, имеет каналы высотой 75 мкм и камеру, определяемую двумя слоями, общей высотой 150 мкм. Следует отметить, однако, что слои могут состоять из различных материалов (например, стекла, фольги, ПВХ, бумаги) и могут представлять различную толщину, как правило, в диапазоне от 25 до 250 мкм.
Рисунок 3: Клеточная визуализация. (A) Простая камера PETL может быть использована для краткосрочной культуры клеток адептов. Клетки прилипают к воздействию стекла в камере и могут наблюдаться с помощью перевернутого микроскопа. (B) Крыса базофилы были окрашены Hoechst (синий) и плазменной мембраны (красный) флуоресцентные красители для визуализации на перевернутой конфокальный микроскоп. (C) Яркое поле изображение клеток в простом устройстве камеры. (D) Фазовое контрастное изображение. Белая шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Характер изготовления PETL позволяет значительно сложность в конструкции пути жидкости. Простое камерное устройство состоит из четырех слоев, содержащих объекты в двух уровнях z-оси (канал и верхняя часть камеры в одном уровне, нижняя часть камеры во втором уровне). Преимуществом PETLs является легкость, с которой можно строить трехмерные архитектуры каналов/камер. Добавление таких функций, как охлаждающие или нагревательные каналы, диализные мембраны, электрические цепи или линии давления (см. рисунок 5)достигается путем соединения нескольких слоев в трех измерениях. Предостережением до сих пор встречается ограничение на количество слоев, которые могут быть ламинированы. Тепловая передача, необходимая для лечения EVA, была признана недостаточной в устройствах с общей толщиной выше 800 мкм. Это ограничение может быть устранено в некоторых устройствах. Во многих случаях можно ламинировать каждый раз, когда добавляется новый слой. Это невозможно, когда новый слой требует термоадхивии (EVA) лицом к внешней стороне устройства.
Рисунок 4: Микро-организображения. (A) Простая камера PETL используется для изображения крыла диска эмбриона Drosophila меланогастер (2x увеличение). Размеры диска крыла приблизительно 90 мкм х 250 мкм х 500 мкм. Один или несколько органов можно отобразить через окно крышки. Увеличенные увеличения другого крыла диска показаны в (B) 20x/0.75-air, (C) 40x/1.30-масло, и (D)100x/1.49-масляные цели с помощью вращающейся дискковой конфокальной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Изучение клеток в культуре выигрывает от инструментов, которые обеспечивают динамические условия состояния, такие как постоянный поток или механические стимулы. Рисунок 3 служит примером, в котором линия клеток млекопитающих культивируется и изображена в простом камерном устройстве. Средний можно постоянно обменивать во время визуализации, что позволяет не только поддерживать идеальные условия роста, но и для контролируемого внедрения химических стимулов при визуализации в режиме реального времени. Это также верно для изображения бывших микро-органов виво, как показано на рисунке 4. Структуры каналов и камер могут быть разработаны с определенными размерами, чтобы соответствовать различным биологическим образцам, от органов или тканей до целых организмов (например, дрозофилы эмбрионов и воображаемых дисков или C. elegans).
Рисунок 5: Механо-ПЕТЛ. Простая камера PETL модифицируется путем добавления компрессионной камеры. (A) Устройство состоит из семи слоев с четырьмя различными материалами: стеклянный нижний слой (coverslip, не показано), четыре ПЭТ/EVA 3 мл слоев (слой канала/камеры, слой прокладки и входе/выход), слой EVA/PET/EVA 6 миль (уплотнение канала/камеры и прилипания ПВХ) и деформируемый слой PVC (для сжатия). (B, C) Путь канала/камеры образца визуализируется с помощью красного красителя. Путь компрессионного канала/камеры содержит только воздух. (D) Давление воздуха вручную (или механически) применяется к траектории сжатия, что приводит к расширению пленки ПВХ в верхней части камеры. Расширение вытесняет краситель в камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Механическое возмущение биологических образцов улучшает наше понимание клеточной физиологии и проливает свет на такие процессы, как эмбриональное развитие и дифференциация. На рисунке 5 описывается устройство PETL, состоящее из простого канала/камеры и компрессионной камеры. Она состоит (в простейшее виде) из шести слоев, одним из которых является ПВХ-пленка. Пленка Из ПВХ отклоняется при применении давления воздуха, заставляя ее сжимать образцы в камере. Это устройство является примером использования материалов, помимо ПЭТ / EVA, и он был успешно использован9 в замене PDMS / стеклянные устройства, используемые для изучения механической нагрузки на Drosophila микро-органов13 (как показано на рисунке 6). Устройства PETL можно многоразового для засили. Однако, из-за низкой стоимости изготовления, уменьшенного следа, и потенциал для delamination после непрерывных манипуляций или мытья, мы рекомендуем использовать новые приборы на старте каждой процедуры.
Рисунок 6: Механобиологическая визуализация. ()DE-кадхерин::GFP, выражающий диск крыла Drosophila, изображен в механо-ПЕТЛ с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа при 20-х увеличениях. (B) Давление через мембрану над камерой может быть применено путем активации заполненный воздухом шприц вручную или с помощью шприца насоса. Идеальный закон газа используется для оценки количества силы, применяемой к мембране9. Область дискового мешка (белая пунктирная линия) увеличена примерно на 30% (красная пунктирная линия) с применением 4 пси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Из-за простоты изготовления устройств PETL, мы исследовали их использование в учебных заведениях, таких как химия, биология и инженерные классы и учебные лаборатории. Пример образовательного PETL показан на рисунке 7. Устройство предназначено для отображения некоторых основных особенностей потока жидкости в микромасштабе (например, ламинарный поток). Он состоит из четырех слоев 5-мильной ПЭТ/EVA пленки(рисунок 7А)и архитектуры канала, которая включает в себя три сходящихся канала ввода и серпантина структуры. Круговые "депрессии" или "вниз" шаги были добавлены на пути содействия микромиксинг14. Используя шприц насос, фенол красный раствор проникнут через внешние порты в то время как рН 9 решение проникнуто через центральный порт. Гидродинамическая фокусировка15 визуализируется с потоком внешней жидкости, заставляя внутренний поток в меньший поток(рисунок 7C). Ламинарный поток в устройстве предотвращает конвективное смешивание, а постепенное рассеяние показано по длине канала (стрелки). Устройства, подобные показанному, могут быть использованы для обучения концепциям (например, диффузии, ламинарному потоку) в динамике жидкости и биотранспортировке. Кроме того, студенты могут быть приглашены для разработки и изготовления своих собственных устройств, проект, который может быть осуществлен в очередной лабораторной сессии продолжительностью от двух до трех часов8.
Рисунок 7: ПЕТЛ в классе. (A) Устройство изготовлено с использованием четырех слоев 5-мильной ПЭТ/EVA пленки. Второй слой (справа налево) имеет круглые камеры, которые будут расположены под траекторией канала. (B) Готовое устройство было загружено с индикатором pH фенол красный (2 мМ, желтый) и прозрачный раствор pH 9 (центральный канал). Фенол красный становится пурпурным при контакте с основными решениями. Коробки указывают области, показанные в (C) через (F). (C)Гидродинамическая фокусировка. (D, E) ламинарный поток и диффузии. (E, F) микромикс. Белая панель весы составляет 2 мм во всех панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Перфорация бампера/порта. (A) Установка бурового пресса, держащая вращающийся инструмент, облегчает перфорацию бампера. Используются дрело вырываются биты размеров 1/32" и 3/64". (B) Процесс эффективен, и большое количество бамперов может быть обработано в короткий промежуток времени. (C) Биопсия удар перфорации является альтернативой бурения. (D) вращающийся плоскогубец удар используется для больших перфораций. Эти перфорации могут использоваться для загрузки крупных образцов (путем вывода жидкости вместо инфузии) или в качестве резервуаров для носителей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная рисунок 2: Тюбинг. (A) Лаборатория или медицинские / хирургические трубки (1/32 "ID, 3/32" OD) является более простым вариантом. Она гибкая и простава в разрезе. Он требует использования (18 G) тупых игл. (B) Одна из игл крепится к шприцу с помощью (розовый) люер адаптер, который удаляется из второй иглы, чтобы он мог быть установлен на трубку. (C) Исследователи, уже знакомые с PEEK трубки (0.010 "ID, 1/32" OD) могут использовать его с PETLs. (D) ФИтинги PEEK. (E) Шприц насос создан одинаков для обоих типов труб. (F) Лаборатория или медицинские / хирургические трубки создана потребует перфорации с 3/64 "сверло бит, в то время как PEEK трубки потребуется 1/32" перфорации. Перфорации, изготовленные с помощью 1 мм биопсии, могут вместить оба комплекта труб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная диаграмма 3: Выравнивание с помощью проволочного джига. Конструкция устройства может включать перфорации, которые могут служить в качестве направляющих для выравнивания нескольких слоев. Провод джиги коммерчески доступны около 20 долларов США. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 4: Ограничения по размеру. Хотя резцы корабля могут отрезать прямые каналы которые q100 мкм в ширине (A),точность картин огранки значительно умалена для характеристик которые измеряют 150 мкм или меньше (B). Размеры рядом с формами указывают на ширину канала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная таблица 1: Время и стоимость изготовления микрофлюидного чипа в PDMS. «Время производства, когда /плесень легко доступны и PDMS можно вылечить с помощью печи. Любая модификация представляет собой задержку в несколько дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 2: Время и стоимость изготовления микрофлюидного чипа PETL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как микрофлюитики все чаще присутствуют в арсенале лабораторий по всему миру, темпы внедрения были разочаровывающими, учитывая потенциал для его положительного воздействия16. Низкая стоимость и высокая эффективность изготовления микрожидкости устройства имеют важное значение для ускорения внедрения этой технологии в средней исследовательской лаборатории. Описанный здесь метод использует несколько слоев пленки для создания двух- и трехмерных устройств на долю времени и затрат, требуемых литографическими методами. Стандартная литография стоит тысячи долларов (USD) для запуска, и требует дней, чтобы изготовить, стоимость запуска производства PETL составляет менее 350 долларов США и устройства могут быть изготовлены в считанные минуты. Это облегчает их внедрение не только в исследовательской лаборатории, но и в условиях, когда быстрая итерация является выгодной (например, прототипирование для стандартных устройств PDMS), или где промышленное производство недорогих одноразовых устройств требуется. Например, ПЕТЛ могут быть изготовлены с использованием биоразлагаемых материалов, и могут быть адаптированы для их использования в области здравоохранения, что делает их идеальными в качестве диагностических инструментов. Они могут быть использованы в классе, либо в качестве сборных учебных материалов или в качестве творческой задачи, в которой студенты проектируют, изготавливают и тестируют свои собственные устройства.
Изготовление PETL должно быть несложным. Однако полезно определить критические шаги и текущие ограничения этого метода. Некоторые пользователи обнайдут, что обмен газа в устройствах PETL сокращается по сравнению с устройствами PDMS, что компенсируется наличием непрерывного потока носителей во время экспериментов. Другим ограничением является размер. Каналы и другие объекты меньше 150 мкм находятся ниже предела разрешения резака(Дополнительная диаграмма 4). Рекомендуем работать с каналами шириной в диапазоне 200-900 мкм. Эти ограничения являются гибкими и, как правило, особенно различаются на верхнем пороге. Например, каналы высотой 75 мкм рухнут, когда ширина канала составляет 950 мкм или более, но остаются открытыми, если высота увеличивается. Хотя архитектура устройства будет меняться в зависимости от приложения, мы обычно используем каналы высотой 75 или 125 мкм и шириной 400-600 мкм.
Важное значение имеет внимание к деталям при выравнивании слоев и бамперов. Большинство из немногих осложнений, возникающих в результате изготовления PETL являются результатом выравнивания вопросов. Exposed EVA во время ламинирования может прилипать к внутренним роликам и сделать их непригодными для узла. Настой жидкости может быть заблокирован плохо расположенным бампером. К счастью, ПЭТ-тары не только дешевы, но и быстро строятся, поэтому неисправные устройства можно легко заменить или модифицировать.
ПЕТЛ может выдерживать скорость потока инфузии, аналогичную тем, которые используются в других микрофлюидных устройствах. Хотя диапазон, используемый нашей группой, составляет от 0,01 до 100 л/мин, скорость потока до 500 л/мин (и, возможно, выше при использовании микропипететов ручной работы) может быть использована. Мы обнаружили, что PETLs может выдерживать давление в диапазоне от 30 до 57 psi8. Шприц насосы рекомендуется для большинства экспериментальных параметров, хотя они не являются абсолютным требованием. В классе, burettes были использованы для тестирования устройств студента15. Перистальтические насосы полезны в определенных условиях, таких как культура клеток, особенно с тех пор, как обмен газом ограничен в PETL. PDMS может быть более выгодным в этом отношении, хотя выщелачивание может быть проблемой5. Мы пытались производить гибридные ПЭТ / EVA-PDMS, но EVA не будет непосредственно придерживаться PDMS; вполне возможно, что поверхностная модификация последнего (например, плазменная обработка или сурфактантлечения) может решить эту проблему. Другой подход, который можно сравнить с PETLs является микро обработки каналов с использованием CO2 лазерной абляции17,18 PMMA. Мы обнаружили, что лазерная резка несовместима с ПЭТ / EVA пленки, так как тепло производится, как правило, вылечить EVA и производить неравномерные края канала. Использование надлежащего лазерного оборудования может также значительно увеличить расходы на изготовление.
Таким образом, ПЕТЛ ы несколько преимуществ по сравнению с современными технологиями: i) Затраты значительно ниже, чем традиционные методы из-за использования потребительских материалов и оборудования, что делает его легко доступным как для исследователей, так и для студентов. ii) Устройства могут быть спроектированы, вырезаны и собраны в течение нескольких минут, что позволяет быстро итерацию прототипа и облегчает эффективное время экспериментирование. iii) несколько устройств могут быть изготовлены одновременно, что позволяет высокопроизводительную продавщив. (iv) различные материалы могут быть включены, добавив универсальность и позволяет обширную настройку. Текущее и будущее развитие новых функциональных возможностей с использованием этой технологии основывается на творчестве и требованиях новых пользователей. Широкое внедрение микрофлюидных устройств PETL, скорее всего, приведет к включению новых материалов и конфигураций, поскольку пользователи разрабатывают новые проекты и подходы для удовлетворения их конкретных потребностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Фернандо Ontiveros находится в процессе запуска PETL FLUIDICS (LLC), компания, которая будет коммерциализировать и предоставлять консалтинговые услуги для этой технологии. Соавторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа в этой рукописи была частично поддержана Национальным научным фондом (NSF) (Грант No. CBET-1553826) (и связанные с ним дополнения ROA) и Национальные институты здравоохранения (NIH) (Грант No. R35GM124935) в J.A., и Нотр-Дам Мельхор Посещение факультета фонда F.O. Мы хотели бы поблагодарить Дженну Шьердсму и Басар Бильгизер за предоставление клеток млекопитающих и культурных протоколов и Фабио Сакко за помощь с дополнительными цифрами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and Applications of Microfluidics in Biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 4 (1), 261-286 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3 (1), 335-373 (2001).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224 (2012).
- Zhang, B., Korolj, A., Lai, B. F. L., Radisic, M.
- Bartholomeusz, D. A., Boutte, R. W., Andrade, J. D. Xurography: rapid prototyping of microstructures using a cutting plotter. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (6), 1364-1374 (2005).
- Martínez-Hernández, K. J., Rovira-Figueroa, N. D., Ontiveros, F. Implementation and Assessment of Student-Made Microfluidic Devices in the General Chemistry Laboratory. , (2016).
- Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111 (2019).
- Subramaniam, A., Sethuraman, S. Chapter 18 - Biomedical Applications of Nondegradable Polymers. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , 301-308 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Oya, K., et al. Surface Characteristics of Polyethylene Terephthalate (PET) Film Exposed to Active Oxygen Species Generated via Ultraviolet (UV) Lights Irradiation in High and Low Humidity Conditions. Journal of Photopolymer Science and Technology. 27 (3), 409-414 (2014).
- Narciso, C. E., Contento, N. M., Storey, T. J., Hoelzle, D. J., Zartman, J. J. Release of Applied Mechanical Loading Stimulates Intercellular Calcium Waves in Drosophila Wing Discs. Biophysical Journal. 113 (2), 491-501 (2017).
- Suh, Y. K., Kang, S. A Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Weibel, D., Whitesides, G.
- Chen, X., Li, T., Shen, J. CO2 Laser Ablation of Microchannel on PMMA Substrate for Effective Fabrication of Microfluidic Chips. International Polymer Processing. 31 (2), 233-238 (2016).
- Chen, X., Shen, J., Zhou, M. Rapid fabrication of a four-layer PMMA-based microfluidic chip using CO2-laser micromachining and thermal bonding. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (10), 107001 (2016).
