Summary
Aquí presentamos un protocolo para diseñar y fabricar dispositivos microfluídicos personalizados con una inversión financiera y de tiempo mínima. El objetivo es facilitar la adopción de tecnologías microfluídicas en laboratorios de investigación biomédica y entornos educativos.
Abstract
Los dispositivos microfluídicos permiten la manipulación de fluidos, partículas, células, órganos u organismos de tamaño micro en canales que van desde las escalas nanométricas hasta las submilimétricas. Un rápido aumento en el uso de esta tecnología en las ciencias biológicas ha provocado la necesidad de métodos accesibles para una amplia gama de grupos de investigación. Los estándares de fabricación actuales, como la unión PDMS, requieren técnicas litográficas y de unión costosas y que consumen mucho tiempo. Una alternativa viable es el uso de equipos y materiales que son fácilmente asequibles, requieren una experiencia mínima y permiten la rápida iteración de diseños. En este trabajo describimos un protocolo para diseñar y producir pet-laminados (PETL), dispositivos microfluídicos que son baratos, fáciles de fabricar y consumen significativamente menos tiempo para generar que otros enfoques de la tecnología de microfluídicos. Consisten en láminas de película de unión térmica, en las que los canales y otras características se definen mediante una cortadora artesanal. Los PETL resuelven desafíos técnicos específicos sobre el terreno y reducen drásticamente los obstáculos a la adopción. Este enfoque facilita la accesibilidad de los dispositivos microfluídicos tanto en entornos de investigación como educativos, proporcionando una plataforma fiable para nuevos métodos de investigación.
Introduction
La microfluídica permite el control de fluidos a pequeñaescala, con volúmenes que van desde microlitros (1 x 10-6 L) hasta picolitros (1 x 10-12 L). Este control ha sido posible en parte debido a la aplicación de técnicas de microfabricación tomadas de la industria de microprocesadores1. El uso de redes de micro-tamaño de canales y cámaras permite al usuario aprovechar los distintos fenómenos físicos característicos de pequeñas dimensiones. Por ejemplo, a la escala de micrómetros, los fluidos se pueden manipular utilizando flujo laminar, donde las fuerzas viscosas dominan las fuerzas inerciales. Como resultado, el transporte difuso se convierte en la característica prominente de los microfluídicos, y se puede estudiar cuantitativa y experimentalmente. Estos sistemas se pueden entender adecuadamente utilizando las leyes de Fick, la teoría del movimiento Browniano, la ecuación de calor y/o las ecuaciones Navier-Stokes, que son derivaciones importantes en los campos de la mecánica de fluidos y los fenómenos de transporte2.
Debido a que muchos grupos en las ciencias biológicas estudian sistemas complejos a nivel microscópico, originalmente se pensó que los dispositivos microfluídicos tendrían un impacto inmediato y significativo en las aplicaciones de investigación en biología2,3. Esto se debe a que la difusión es dominante en el transporte de moléculas pequeñas a través de membranas o dentro de una célula, y las dimensiones de las células y microorganismos son una coincidencia ideal para sistemas y dispositivos submilimétricos. Por lo tanto, había un potencial significativo para mejorar la forma en que se lleva a cabo la experimentación celular y molecular. Sin embargo, la amplia adopción de tecnologías microfluídicas por los biólogos se ha quedado atrás en las expectativas4. Una sencilla razón de la falta de transferencia de tecnología puede ser los límites disciplinarios que separan a los ingenieros y biólogos. El diseño y la fabricación de dispositivos personalizados se han mantenido justo fuera de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación biológica, lo que los hace dependientes de la experiencia e instalaciones externas. La falta de familiaridad con las aplicaciones potenciales, el costo y el tiempo necesario para la iteración del diseño también son barreras significativas para los nuevos adoptantes. Es probable que estas barreras hayan tenido el efecto de interrumpir la innovación y prevenir la aplicación generalizada de microfluídicos para hacer frente a los desafíos en las ciencias biológicas.
Un ejemplo: Desde finales de la fotolitografía suave de finales de 1990 ha sido el método de elección para la fabricación de dispositivos microfluídicos. PDMS (polidimetilsiloxano, polímero orgánico a base de silicona) es un material ampliamente utilizado debido a sus propiedades físicas, como la transparencia, la deformabilidad y la biocompatibilidad5. La técnica ha tenido un gran éxito, con dispositivos de laboratorio en un chip y de órgano en un chip que se desarrollan continuamente en esta plataforma6. La mayoría de los grupos que trabajan en estas tecnologías, sin embargo, se encuentran en departamentos de ingeniería o tienen fuertes lazos con ellos4. La litografía generalmente requiere salas limpias para la fabricación de moldes y equipos de unión especializados. Para muchos grupos, esto hace que los dispositivos PDMS estándar sean menos que ideales debido a sus costos de capital y tiempo de entrega, especialmente cuando es necesario realizar modificaciones de diseño repetidas. Además, la tecnología es en su mayoría inaccesible para el biólogo promedio y para los estudiantes sin acceso a laboratorios de ingeniería especializados. Se ha propuesto que para que los dispositivos microfluídicos sean ampliamente adoptados, deben imitar algunas de las cualidades de los materiales comúnmente utilizados por los biólogos. Por ejemplo, el poliestireno utilizado para el cultivo celular y los bioensayos es barato, desechable y susceptible de producción en masa. Por el contrario, la fabricación industrial de microfluídicos basados en PDMS nunca se ha realizado debido a su suavidad mecánica, inestabilidad en el tratamiento de la superficie y permeabilidad al gas5. Debido a estas limitaciones, y con el objetivo de resolver retos técnicos utilizando dispositivos personalizados construidos "in-house", describimos un método alternativo que utiliza xurography7,8,9 protocolos y laminación térmica. Este método se puede adoptar con poca inversión de capital y tiempo.
Los PETLse fabrican con película de tereftalato de polietileno (PET), recubiertas con el acetato termoadhesivo de etileno-vinilo (EVA). Ambos materiales son ampliamente utilizados en productos de consumo, son biocompatibles y están fácilmente disponibles a un costo mínimo10. La película PET/EVA se puede obtener en forma de bolsas o rollos de laminado. Usando un cortador de artesanía controlado por computadora que se encuentra comúnmente en tiendas de aficionados o artesanías, los canales se cortan de una sola hoja de película para definir la arquitectura del dispositivo11. A continuación, los canales se sellan aplicando capas adicionales de película (o vidrio) que se unen mediante un laminador térmico (oficina)(Figura 1A). Se añaden parachoques de vinilo perforados y autoadhesivos para facilitar el acceso a los canales. Los tiempos de fabricación varían de 5 a 15 min, lo que permite una rápida iteración del diseño. Todos los equipos y materiales utilizados para fabricar PETLs son comercialmente accesibles y asequibles (<350 USD costo de partida, en comparación con miles de USD para litografía). Por lo tanto, los PETL proporcionan una solución novedosa a dos problemas principales planteados por los microfluídicos convencionales: asequibilidad y eficacia del tiempo (véase la comparación PDMS/PETL en los cuadros suplementarios 1, 2).
Además de proporcionar a los investigadores la oportunidad de diseñar y fabricar sus propios dispositivos, los PETLs se pueden adoptar fácilmente en el aula porque son simples e intuitivos de usar. Los PETLs se pueden incluir en los planes de estudios de bachillerato y universidad8,donde se utilizan para ayudar a los estudiantes a entender mejor los conceptos físicos, químicos y biológicos, como la difusión, el flujo laminar, la micromezcla, la síntesis de nanopartículas, la formación de gradientes y la quimiotaxis.
En este trabajo ilustramos el flujo de trabajo general para la fabricación de chips PETL sin modelos con diferentes niveles de complejidad. El primer dispositivo se utiliza para facilitar la toma de imágenes de células y microórganos en una cámara pequeña. El segundo dispositivo, más complejo consta de varias capas y materiales, y se utiliza para la investigación en mecanobiología9. Por último, construimos un dispositivo que muestra varios conceptos de dinámica de fluidos (enfoque hidrodinámico, flujo laminar, transporte difuso y micromezcla) con fines educativos. El flujo de trabajo y los diseños de dispositivos presentados aquí se pueden adaptar fácilmente para una amplia gama de propósitos tanto en la investigación como en la configuración del aula.
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Protocol
1. Diseño
- Identifique una aplicación para los dispositivos y enumere los componentes de canal/cámara que se necesitarán.
NOTA: Todos los dispositivos requerirán canales de entrada y salida. Los dispositivos utilizados para la microscopía requerirán una cámara de imágenes. Los dispositivos más complejos requerirán canales y cámaras situados en varias capas. - Comience dibujando a mano cada capa, teniendo en cuenta cómo la funcionalidad del dispositivo se ve afectada por la superposición de las capas.
- Dibuja los diseños finales en un ordenador usando cualquier software que permita dibujar líneas y formas.
- Dibuja cada capa por separado usando negro, líneas sólidas y formas carentes de sombras. Se recomienda un grosor de línea de 6 o más puntos. En esta etapa, las dimensiones de las características de canal y cámara son menos importantes que las proporciones generales.
- Utilice la función de copiar y pegar al crear entidades y superponer capas. Consulte la Figura 1B para ver ejemplos de dibujos de capas.
- Importe cada capa en el software de corte artesanal(Figura 1C). Para ello, realice una captura de pantalla del diseño dibujado y utilice un enfoque de arrastrar y soltar.
- Cree un nuevo documento en el software de corte artesanal (descarga gratuita). Suelte el archivo de imagen en el tapete mostrado. El software reconocerá la mayoría de los archivos de imagen.
- Amplíe la imagen para facilitar el procesamiento tirando de una esquina. El diseño ahora puede ser reconocido por el software utilizando la función de rastreo.
NOTA: Los usuarios pueden producir diseños de novo directamente en este software (utilizar herramientas de dibujo en la paleta de diseño).
- Para trazar el diseño, seleccione el icono Trazar (forma de una mariposa) en el lado derecho de la ventana y seleccione completamente los diseños importados.
- Seleccione la opción Vista previa de seguimiento con la etiqueta Esquema. Ajuste (si es necesario) los ajustes Umbral y Escala para ajustar el trazado amarillo para que coincida con el diseño.
- Seleccione Trazar en el menú Seguimiento una vez que el trazado amarillo coincida con el diseño. Los canales ahora se muestran como un contorno rojo. Si el contorno rojo coincide con el diseño, se puede seleccionar y eliminar la imagen importada. El diseño ahora está importado y listo para el dimensionamiento.
- Ajuste el tamaño del dispositivo seleccionando el diseño trazado y utilizando la cuadrícula proporcionada por el software. Tire para cambiar la anchura y la longitud de los canales y las cámaras.
NOTA: El software proporciona medidas y se pueden dibujar líneas pequeñas temporalmente (utilice la paleta de diseño en el lado izquierdo de la ventana) para medir las dimensiones dentro del dispositivo. Las dimensiones funcionales de ancho de canal oscilan entre 100 m y 900 m. Es posible que deba ajustarse las dimensiones después de probar los prototipos iniciales. Es importante que todas las capas se dimensionen proporcionalmente, para garantizar una alineación adecuada durante el ensamblaje.- Después de que el diseño esté correctamente dimensionado, seleccione la herramienta cuadrada en el menú de dibujo de la forma para dibujar un cuadrado/rectángulo alrededor de cada capa del dispositivo. Esta forma debe tener el mismo tamaño para todas las capas. Vea la figura 1C para los ejemplos.
- Cree una capa superior independiente que contenga puertos de acceso a los canales. Los diseños simples consistirán en una capa de canal principal (media), una capa de sellado inferior (a menudo de vidrio) y una capa superior que debe contener perforaciones circulares para acceder a los canales (entradas/salidas).
NOTA: Los diseños que contengan más de tres capas requerirán perforaciones de entrada/salida en varias capas (vea la Figura 1C, Figura 5A). Estas perforaciones pueden estar ya incluidas en el diseño, o se pueden agregar en este momento.- Seleccione la herramienta de dibujo en el lado izquierdo de la pantalla. Dibuje círculos sobre los puertos de entrada y salida del diseño.
- Copie y pegue el diseño original y los círculos. Borre los canales del dispositivo subyacente.
NOTA: Esto deja los puertos de entrada/salida en la posición correcta correspondientes al diseño original. Las formas también se pueden agregar a la periferia de cada capa para ayudar con la alineación.
- Organice todas las capas que se van a cortar en la alfombra mostrada. El dispositivo ya está listo para el corte.
2. Corte
- Aplique una sola película PET/EVA (u otro material) de espesor preferido (3 mil es estándar) sobre la estera de corte adhesiva. Asegúrese de que el lado adhesivo (mate) esté hacia arriba y el lado de plástico (brillante) hacia abajo.
NOTA: Use guantes limpios para evitar la introducción de aceites y micropartículas en las capas. - Aplanar la película contra la estera(Figura 1D), eliminando todo el aire que pueda haber quedado atrapado. Esto se puede hacer usando las manos enguantadas o un rodillo.
- Alinee el borde de la estera de corte con la línea indicada en la herramienta de corte. Cargue la alfombra presionando Cargar estera en la herramienta de corte. Mantenga el ajuste en la cuchilla de corte entre 3 y 5, dependiendo del espesor de la película.
- Conecte el cable USB del cortador al ordenador.
- Seleccione la pestaña ENVIAR y seleccione un ajuste de corte.
NOTA: Hay una multitud de ajustes disponibles en el menú en cascada. El -Papel de pegatina, Clear- es un ajuste que funciona bien con película PET/EVA que tiene un espesor de 3-5 mil (75-125 m). Modifique la configuración de diferentes materiales y guarde la configuración personalizada para su uso futuro.
- Seleccione la pestaña ENVIAR y seleccione un ajuste de corte.
- Haga clic en Enviar. Comenzará el corte(Figura 1E). Asegúrese de que haya suficiente espacio en la parte posterior de la fresa para que la estera se mueva sin obstáculos. Cuando la herramienta de corte haya terminado, descargue la alfombra seleccionando Descargar en la herramienta de corte. No extraiga la alfombra antes de descargarla.
3. Alineación
- Coloque la alfombra de corte junto a una superficie limpia. Con las manos enguantadas, utilice un par de pinzas para levantar cada capa del dispositivo de microfluidos de la alfombra de corte(Figura 1F). Tenga especial cuidado alrededor de giros y curvas en el canal; son especialmente delicadas y susceptibles a rasgarse y deformarse.
- Coloque las capas del dispositivo de microfluidos en una superficie limpia. Ordenarlos de acuerdo con su posición de arriba a abajo en el dispositivo(Figura 1G, Figura 2A, Figura 5A y Figura 7A).
- Corte pequeñas piezas de cinta de doble cara (3 mm x 10 mm) que se utilizarán para unir temporalmente las capas.
- Superponer las capas una por una, empezando por la capa inferior. Agregue un pequeño trozo de cinta de doble cara a una esquina entre las capas, lejos de cualquier canal o entrada/salida(Figura 1G, flecha). La cinta, aunque no es necesaria, inmoviliza las capas y asegura que no cambiarán durante la laminación. Utilice una plantilla de alambre para facilitar la alineación de capas en dispositivos con más de 4 capas(Figura suplementaria 3).
- Asegúrese de que el lado adhesivo (mate-EVA) de la película siempre se dirija al interior (parte dentro de las capas) del dispositivo.
ADVERTENCIA: El adhesivo expuesto se funderá contra las partes internas del laminador y se adhieren a ellas, lo que resulta no sólo en la pérdida del dispositivo, sino que también afectará el rendimiento futuro del laminador. - Una vez superpuestos todas las capas, inspeccione el dispositivo. Debe haber al menos un lado de EVA entre todas las capas, y no se debe exponer ningún EVA. Al introducir materiales no recubiertos con EVA (por ejemplo, película de cloruro de polivinilo (PVC), podría ser necesaria una película recubierta con EVA en ambos lados, especialmente en el caso de dispositivos más complejos(Figura 5).
4. Laminación
- Encienda y ajuste el laminador al ajuste de espesor deseado. Algunos laminadores ofrecen ajustes de 3 y 5 mil, mientras que otros no. Para cualquier dispositivo con 4 o más capas, utilice el ajuste de 5 mil.
- Una vez que el laminador esté listo, pase el dispositivo a través de los rodillos de laminado(Figura 1H–I). Coloque el extremo al que se ha añadido cinta de doble cara para obtener mejores resultados.
NOTA: Al fabricar dispositivos de cinco o más capas, se pueden ejecutar a través del laminador más de una vez. - Recuperar el dispositivo laminado.
NOTA: Es aconsejable que los dispositivos sean lo suficientemente grandes como para facilitar su recuperación desde el laminador. Esta consideración no afecta al tamaño de los canales o la arquitectura de chip, simplemente requiere un "marco" que pueda pasar fácilmente a través del laminador sin permanecer dentro.
5. Puertos de entrada/salida
- Utilice una herramienta giratoria y una broca de 1/32 in. para cortar un pequeño agujero a través del centro de un parachoques de muebles. Alternativamente, utilice un punzón de biopsia de 1 mm para perforar los parachoques.
NOTA: Se recomienda una prensa de perforación. Aunque los tamaños varían, se recomiendan parachoques de 2 mm x 6 mm de diámetro. Evite simplemente "apuñalar" el parachoques. A menos que se retire el material, el parachoques volverá a sellar(Figura Suplementaria 1). Las perforaciones indicadas anteriormente están destinadas a interactuar con tubos de polietheretherketone (PEEK), una pipeta y punta, o una aguja contundente (16-18 G). Las perforaciones más grandes se pueden lograr utilizando alicates de punzonado giratorios(Figura Suplementaria 1). Estos son útiles cuando el parachoques se utiliza como un "reservorio" para líquidos u otros biológicos. - Asegúrese de que el orificio esté completamente limpio eliminando los restos (causados por perforación o punzonado) con un par de pinzas pequeñas.
- Después de que los puertos de entrada/salida se despejen con éxito, alinee cuidadosamente los parachoques con los puertos de entrada/salida del dispositivo laminado(Figura 1J-K). Este paso es esencial para tener un flujo adecuado de líquidos dentro y fuera del dispositivo. Sostenga el parachoques detrás del dispositivo, coloque la cara adhesiva frente a la entrada/salida abierta en el dispositivo, luego alinee y se adhiera. El ensamblaje del dispositivo se ha completado.
6. Pruebas
- Acceda a las arquitecturas de canal/cámara a través de los parachoques perforados (puertos). Hay varias opciones con respecto a cómo introducir fluidos y biológicos en los dispositivos.
- Utilice tubos de laboratorio o médicos/quirúrgicos adjuntándolos a un conector de plástico (por ejemplo, adaptadores Luer) o a una aguja contundente. También se puede utilizar una pipeta estándar y un tubo de punta o PEEK sin adaptadores(Figura Suplementaria 2).
- Realizar perfusión o dibujo de líquidos con jeringas y tubos utilizando jeringas o bombas peristálticas.
NOTA: Hay muchas opciones en el mercado, a partir de 300 USD en el momento de la escritura. - Establezca diferentes ajustes de caudal según el dispositivo y el experimento.
NOTA: Utilizamos rutinariamente la configuración del caudal en el rango de 0,01–100 l/min, pero se pueden utilizar otras velocidades.
Figura 1: Fabricación. (A) Un laminador de oficina y un cortador artesanal son las dos únicas piezas de equipo necesarias para la fabricación. Ambos están disponibles en línea o en tiendas de artesanías / artículos de oficina. Otras herramientas necesarias incluyen tijeras y pinzas. (B) Las arquitecturas de canal y cámara se pueden componer digitalmente utilizando cualquier programa de software que incluya herramientas de dibujo (los gráficos vectoriales pueden ser preferidos por algunos usuarios, pero no son necesarios). Las líneas y formas se dibujan en negro con un fondo blanco. El archivo o una captura de pantalla del diseño se puede importar en el software de corte artesanal arrastrando y soltando. (C) El software de corte Craft está disponible para su descarga gratuita y es necesario para controlar la herramienta de corte. El software adquiere el diseño y permite modificaciones, como el tamaño. También proporciona herramientas de dibujo. ( D ) La alfombradecorte lleva la película para cortar. Es ligeramente adhesivo, lo que permite la inmovilización de los materiales a cortar. La figura muestra cuatro materiales diferentes listos para la carga: película PET/EVA de 3 mil de espesor (arriba), película PET/EVA de 5 mil de espesor (medio), EVA/PET/EVA de 6 mil de espesor (abajo a la izquierda) y película de PVC (abajo a la derecha). (E) El cortador está abierto para mostrar la unidad de la hoja (en negro) y la estera cargada. ( F ) Despuésdelcorte, las capas individuales se levantan con pinzas. Los cortes de canales y cámaras permanecen conectados a la alfombra y luego se retiran y desechan. (G) Las capas individuales están alineadas y superpuestas para la laminación. Los trozos pequeños de cinta adhesiva de doble cara (flecha) se utilizan a menudo para ayudar a alinear y evitar el desplazamiento de capas durante la laminación. (H, I) El dispositivo se alimenta en la parte superior del laminador y se recupera a través de la ranura. La laminación proporciona un sello robusto, dejando las trayectorias del canal abiertas. (J, K) Para acceder a los canales, es necesario añadir parachoques de vinilo perforados y autoadhesivos. La imagen en (J) muestra el enfoque "inverso" para la alineación, en el que el parachoques se coloca desde la parte posterior, permitiendo la alineación visual de la entrada / salida con la perforación del parachoques. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Además de bajo costo y rápida iteración, la tecnología PETL se puede personalizar fácilmente para resolver desafíos específicos. En primer lugar, describimos un dispositivo simple que consiste en un cubreobjetos de vidrio, una capa de cámara, una capa de canal y una capa de entrada/salida(Figura 2). Este dispositivo fue diseñado para facilitar la toma de imágenes de células y micro-órganos bajo flujo constante. El medio de cultivo se repone a bajas tasas de flujo para fomentar el intercambio de nutrientes y gas. La cámara redonda cuenta con un fondo de vidrio, que permite la toma de imágenes utilizando un microscopio invertido. Hay al menos dos razones para el uso de vidrio en este dispositivo. El primero es la óptica. El PET y el EVA son termoplásticos utilizados por su transparencia óptica y flexibilidad, y se pueden utilizar como interfaz para la toma de imágenes (particularmente a bajos aumentos9. La transmitancia de luz del PET en el espectro visible oscila entre 87 y 90%12. El vidrio, sin embargo, tiene mejores propiedades ópticas y es el estándar utilizado en imágenes biológicas. La segunda razón para usar vidrio es que las células probadas hasta ahora (líneas celulares de mamíferos), tienden a adherirse más fácilmente a él que a (sin tratar) PET/EVA.
Figura 2: Cámara simple para microscopía invertida. (A) El dispositivo consta de una capa de vidrio y tres capas PET/EVA (3 mil de espesor). Un cubrecristales (24 mm x 60 mm) es la capa inferior. La siguiente capa presenta la parte inferior de la cámara de imágenes. La siguiente capa cuenta con la mitad superior de la cámara y la conecta al canal de entrada/salida. Por lo tanto, la altura del canal es de sólo 75 m, mientras que la altura de la cámara es de 150 m. La anchura del canal es determinada por el usuario (500 m se muestra aquí). La capa superior sella la trayectoria de la cámara/canal y proporciona acceso a la entrada/salidas. Las capas superpuestas se muestran a la derecha. (B) El dispositivo terminado se muestra infundido con tinte rojo para su visualización. La carga se puede lograr utilizando una micropipeta y una punta, un tubo de laboratorio o médico/quirúrgico equipado con una aguja contundente, o tubos PEEK, como se muestra. (C) El diseño del canal/cámara puede iterarse en un solo dispositivo (por ejemplo, para facilitar la observación de varios especímenes individuales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Merece la pena describir las dimensiones de los canales y la cámara de este dispositivo. La altura en PETLs es siempre una función del espesor de la película o capa. El PET/EVA disponible comercialmente tiene un espesor medido en milésimas de pulgada (1 mil a 25 m). Por lo tanto, las alturas de canal y cámara suelen ser múltiplos de 25 m. Los PETLestándar estándar se construyen utilizando película PET/EVA de 3 o 5 mil, lo que da como resultado características que tienen una altura de 75 o 125 m. El dispositivo que se muestra en la Figura 2 tiene canales con una altura de 75 m, y una cámara definida por dos capas, con una altura total de 150 m. Cabe señalar, sin embargo, que las capas pueden estar compuestas de diferentes materiales (por ejemplo, vidrio, papel de aluminio, PVC, papel) y pueden presentar espesores variables, por lo general que van de 25 a 250 m.
Figura 3: Imágenes celulares. (A) El PETL de cámara simple se puede utilizar para el cultivo a corto plazo de células adherentes. Las células se adhieren al vidrio expuesto en la cámara y se pueden observar con un microscopio invertido. (B) Los basófilos de rata se teñieron con tintes fluorescentes Hoechst (azul) y membrana plasmática (rojo) para su visualización en un microscopio confocal invertido. (C) Imagen de campo brillante de las celdas en un dispositivo de cámara simple. ( D ) Imagen de contrastedefase. La barra de escala blanca es de 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La naturaleza de la fabricación PETL permite una complejidad significativa en el diseño de trayectorias fluidas. El dispositivo de cámara simple consta de cuatro capas que contienen entidades en dos niveles del eje z (canal y parte superior de la cámara en un nivel, parte inferior de la cámara en el segundo nivel). Una ventaja proporcionada por los PETL ses la facilidad con la que se pueden construir arquitecturas de canal/cámara en 3 dimensiones. La adición de características como canales de refrigeración o calefacción, membranas de diálisis, circuitos eléctricos o líneas de presión (ver Figura 5)se logra conectando múltiples capas en tres dimensiones. Una advertencia encontrada hasta ahora es el límite en el número de capas que se pueden laminar. La transferencia de calor necesaria para la curación de EVA se ha encontrado insuficiente en dispositivos con un espesor total superior a 800 m. Esta limitación se puede abordar en algunos dispositivos. En muchos casos, es posible laminar cada vez que se agrega una nueva capa. Esto no es posible cuando una nueva capa requiere el termoadhesivo (EVA) para mirar hacia el exterior del dispositivo.
Figura 4: Imágenes de microórganos. (A) La cámara simple PETL se utiliza para tomar imágenes de un disco de ala del embrión de Drosophila melanogaster (2xaumento). Las dimensiones del disco de ala son de aproximadamente 90 ám x 250 ám x 500 m. Uno o varios órganos se pueden fotodar a través de la ventana de encubrimiento. El aumento de los aumentos de otro disco de ala se muestra en los objetivos de aceite (B) 20x/0.75, (C) 40x/1.30 y (D)100x/1.49-oil utilizando una microscopía confocal de disco giratorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El estudio de las células en el cultivo se beneficia de herramientas que proporcionan condiciones de estado dinámico como flujo constante o estímulos mecánicos. La Figura 3 proporciona un ejemplo en el que una línea celular de mamíferos se cultiva e imagen en un dispositivo de cámara simple. El medio se puede intercambiar constantemente durante la toma de imágenes, lo que permite no sólo mantener las condiciones de crecimiento ideales, sino también para la introducción controlada de estímulos químicos mientras se realiza la toma de imágenes en tiempo real. Esto también es cierto para la toma de imágenes de microórganos ex-vivo, como se muestra en la Figura 4. Las estructuras de canales y cámaras pueden diseñarse con dimensiones específicas para adaptarse a diferentes muestras biológicas, desde órganos o tejidos hasta organismos enteros (por ejemplo, embriones de Drosophila y discos imaginativos o C. elegans).
Figura 5: Mechano-PETL. La cámara simple PETL se modifica añadiendo una cámara de compresión. (A) El dispositivo consta de siete capas con cuatro materiales diferentes: una capa inferior de vidrio (coverslip, no se muestra), cuatro capas PET/EVA de 3 mil (capas de canal/cámara, capa espaciadora y capa de entrada/salida), una capa EVA/PET/EVA de 6 mil (sellado de canal/cámara y adhesión de PVC) y una capa de PVC deformable (para compresión). (B, C) El canal de muestra/trayectoria de la cámara se visualiza utilizando tinte rojo. El canal de compresión/ruta de la cámara contiene sólo aire. (D) La presión del aire se aplica manualmente (o mecánicamente) a la trayectoria de compresión, lo que resulta en la expansión de la película de PVC en la parte superior de la cámara. La expansión desplaza el tinte en la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La perturbación mecánica de los especímenes biológicos mejora nuestra comprensión de la fisiología celular y arroja luz sobre procesos como el desarrollo embrionario y la diferenciación. La Figura 5 describe un dispositivo PETL que consiste en una matriz de canal/cámara simple y una cámara de compresión. Consiste (en su forma más simple) de seis capas, una de las cuales es una película de PVC. La película de PVC se desvía cuando se aplica presión de aire, lo que hace que comprima las muestras dentro de la cámara. Este dispositivo es un ejemplo del uso de materiales distintos de PET/EVA, y se ha empleado con éxito9 en la sustitución de los dispositivos PDMS/vidrio utilizados para estudiar la carga mecánica en los microórganos de Drosophila 13 (como se muestra en la Figura 6). Los dispositivos PETL son reutilizables. Sin embargo, debido al bajo costo de fabricación, la reducción de la huella y el potencial de delaminación después de la manipulación continua o el lavado, recomendamos el uso de nuevos dispositivos al comienzo de cada procedimiento.
Figura 6: Imágenes de mecanobiología. (A) Un desenfreno::GFP que expresa el disco de ala Drosophila se indica dentro de un mecano-PETL utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un aumento de 20x. ( B ) La presión a travésdela membrana por encima de la cámara se puede aplicar accionando una jeringa llena de aire manualmente o utilizando una bomba de jeringa. La ley de gas ideal se utiliza para estimar la cantidad de fuerza aplicada a la membrana9. El área de la bolsa de disco (línea de puntos blanca) aumentó en aproximadamente un 30% (línea de puntos roja) con la aplicación de 4 psi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Debido a la facilidad de fabricación de dispositivos PETL, hemos explorado su uso en entornos educativos como aulas de química, biología e ingeniería y laboratorios de enseñanza. En la Figura 7se muestra un ejemplo de un PETL educativo. El dispositivo está diseñado para mostrar algunas de las características básicas del flujo de fluido según la escala micro (por ejemplo, flujo laminar). Consta de cuatro capas de película PET/EVA de 5 mil(Figura 7A)y una arquitectura de canal que incluye tres canales de entrada convergentes y una estructura serpentina. Se han añadido pasos circulares "depresiones" o "abajo" al camino para promover la micromezcla14. Usando una bomba de jeringa, la solución de color rojo fenol se infunde a través de los puertos exteriores, mientras que la solución pH 9 se infunde a través del puerto central. El enfoque hidrodinámico15 se visualiza con el flujo de fluido externo forzando el flujo interno en una corriente más pequeña(Figura 7C). El flujo laminar en el dispositivo evita la mezcla convectiva, y la mezcla gradual difusa se muestra a lo largo de la longitud del canal (flechas). Dispositivos como el que se muestra se pueden utilizar para enseñar conceptos (por ejemplo, difusión, flujo laminar) en dinámica de fluidos y biotransporte. Alternativamente, se puede invitar a los estudiantes a diseñar y fabricar sus propios dispositivos, un proyecto que se puede llevar a cabo en una sesión de laboratorio regular que dura de dos a tres horas8.
Figura 7: PETLs en el aula. (A) El dispositivo se fabrica utilizando cuatro capas de película PET/EVA de 5 mil. La segunda capa (de derecha a izquierda) cuenta con cámaras circulares que se colocarán debajo de la ruta del canal. (B) El dispositivo terminado se ha cargado con el indicador de pH fenol rojo (2 mM, amarillo) y una solución transparente de pH 9 (canal central). El rojo fenol se convierte en magenta cuando está en contacto con soluciones básicas. Las casillas indican las áreas que se muestran en (C) a (F). (C) Enfoque hidrodinámico. (D, E) flujo laminar y difusión. (E, F) micromezcla. La barra de escala blanca es de 2 mm en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Perforación de parachoques/puerto. (A) Una configuración de prensa de perforación que sujeta una herramienta giratoria facilita la perforación del parachoques. Se utilizan brocas de tamaños 1/32" y 3/64". (B) El proceso es eficiente, y un gran número de parachoques se pueden procesar en un corto período de tiempo. (C) La perforación de punzonado de biopsia es una alternativa a la perforación. (D) Se utiliza un alicate de punzonado giratorio para perforaciones más grandes. Estas perforaciones se pueden utilizar para cargar muestras grandes (por extracción de líquido en lugar de perfusión) o como depósitos de medios. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Tubos. (A) El laboratorio o el tubo médico/quirúrgico (1/32" ID, 3/32" OD) es la opción más simple. Es flexible y fácil de cortar. Requiere el uso de (18 G) agujas contundentes. (B) Una de las agujas se une a la jeringa utilizando el adaptador Luer (rosa), que se retira de una segunda aguja para que pueda instalarse en el tubo. (C) Los investigadores ya familiarizados con los tubos PEEK (0.010" ID, 1/32" OD) pueden utilizarlo con PETLs. (D) Accesorios PEEK. (E) La configuración de la bomba de jeringa es la misma para ambos tipos de tubos. (F) La instalación de tubos médicos/quirúrgicos/de laboratorio requerirá perforaciones con una broca de 3/64", mientras que la tubería PEEK necesitará perforaciones de 1/32". Las perforaciones realizadas con un punzón de biopsia de 1 mm pueden acomodar ambos conjuntos de tubos. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 3: Alineación mediante una plantilla de alambre. El diseño del dispositivo puede incluir perforaciones que pueden servir como guías para la alineación de varias capas. Las plantillas de alambre están disponibles comercialmente por alrededor de 20 USD. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 4: Limitaciones de tamaño. Aunque las fresas artesanales son capaces de cortar canales rectos de 100 m de ancho(A),la precisión de los patrones de corte se reduce considerablemente para las entidades que miden 150 m o menos (B). Las dimensiones junto a las formas indican el ancho del canal. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Tabla Suplementaria 1: Tiempo y costo para la fabricación de chip microfluídico en PDMS. *Tiempo de fabricación cuando la oblea / molde está fácilmente disponible y PDMS se puede curar con un horno. Cualquier modificación de diseño representa un retraso de varios días. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla Suplementaria 2: Tiempo y costo para la fabricación de chip microfluídico PETL. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Si bien los microfluidos están cada vez más presentes en la caja de herramientas de los laboratorios de todo el mundo, el ritmo de adopción ha sido decepcionante, dado el potencial de su impacto positivo16. El bajo costo y la alta eficiencia de la fabricación de dispositivos microfluídicos son esenciales para acelerar la adopción de esta tecnología en el laboratorio de investigación promedio. El método descrito aquí utiliza varias capas de película para crear dispositivos bidimensionales y tridimensionales a una fracción del tiempo y el costo requeridos por los métodos litográficos. La litografía estándar cuesta miles de dólares (USD) para iniciarse, y requiere días para fabricar, el costo de inicio de la fabricación PETL es inferior a 350 USD y los dispositivos se pueden fabricar en minutos. Esto facilita su adopción no sólo en el laboratorio de investigación, sino también en entornos donde la iteración rápida es ventajosa (por ejemplo, prototipos para dispositivos PDMS estándar), o donde se requiere la producción industrial de dispositivos desechables de bajo costo. Por ejemplo, los PETL pueden fabricarse con materiales biodegradables y pueden adaptarse para su uso en el campo sanitario, haciéndolos ideales como herramientas de diagnóstico. Pueden ser utilizados en el aula, ya sea como materiales de aprendizaje prefabricados o como un desafío creativo, en el que los estudiantes diseñan, fabrican y prueban sus propios dispositivos.
La fabricación de PETL está destinada a ser sencilla. Sin embargo, es útil identificar los pasos críticos y las limitaciones actuales de esta técnica. Algunos usuarios encontrarán que el intercambio de gas en dispositivos PETL se reduce en comparación con los dispositivos PDMS, lo que se compensa por tener un flujo continuo de medios durante la experimentación. Otra limitación es el tamaño. Los canales y otras características de menos de 150 m están por debajo del límite de resolución de la herramienta de corte(Figura suplementaria 4). Recomendamos trabajar con canales con una anchura de 200-900 m. Estos límites son flexibles y tienden a variar particularmente en el umbral superior. Por ejemplo, los canales con una altura de 75 m colapsarán cuando la anchura del canal sea de 950 m o más, pero permanecerán abiertos si aumenta la altura. Aunque la arquitectura del dispositivo variará de acuerdo con la aplicación, utilizamos de forma rutinaria canales con una altura de 75 o 125 m, y una anchura de 400-600 m.
La atención al detalle al alinear capas y parachoques es importante. La mayoría de las pocas complicaciones derivadas de la fabricación de PETL son el resultado de problemas de alineación. EL EVA expuesto en el momento de la laminación puede adherirse a los rodillos internos y hacerlos inutilizables. La infusión de líquido puede ser bloqueada por un parachoques mal posicionado. Afortunadamente, los PETLs no sólo son baratos, sino que también se construyen rápidamente, por lo tanto, los dispositivos defectuosos pueden ser fácilmente reemplazados o modificados.
Los PETL pueden soportar caudales de perfusión similares a los utilizados en otros dispositivos microfluídicos. Aunque de 0,01 a 100 l/min es el rango utilizado por nuestro grupo, se pueden utilizar caudales de hasta 500 ml/min (y tal vez más altos cuando se utilizan micropipetas accionadas a mano). Hemos encontrado que los PETLs pueden soportar presiones en el rango de 30 a 57 psi8. Las bombas de jeringa se recomiendan para la mayoría de los ajustes experimentales, aunque no son un requisito absoluto. En el aula, se utilizaban buretas para probar los dispositivos de los estudiantes15. Las bombas peristálticas son útiles en ciertos entornos como el cultivo celular, particularmente porque el intercambio de gas es limitado en PETLs. PDMS puede ser más ventajoso en este sentido, aunque la lixiviación puede ser una preocupación5. Hemos intentado producir PET/EVA-PDMS híbrido, sin embargo, EVA no se adhiere directamente a PDMS; es posible que la modificación superficial de este último (por ejemplo, tratamiento plasmático o tratamientos tensioactivos) pueda resolver este problema. Otro enfoque que se puede comparar con los PETLs es el micromecanizado de canales utilizando la ablación láser CO2 17,18 de PMMA. Hemos descubierto que el corte por láser es incompatible con la película PET/EVA, ya que el calor producido tiende a curar el EVA y a producir bordes de canal desiguales. El uso de equipos láser adecuados también podría aumentar significativamente los costos de fabricación.
En resumen, los PETL ofrecen múltiples ventajas sobre las tecnologías actuales: (i) Los costos son significativamente más bajos que los métodos tradicionales debido al uso de materiales y equipos de calidad de consumidor, por lo que es fácilmente accesible tanto para los investigadores como para los estudiantes. (ii) Los dispositivos se pueden diseñar, cortar y ensamblar en cuestión de minutos, lo que permite una rápida iteración de prototipos y facilita la experimentación eficaz en el tiempo. (iii) Múltiples dispositivos se pueden fabricar simultáneamente, lo que permite una producción de alto rendimiento. (iv) Se puede incorporar una variedad de materiales, añadiendo versatilidad y permitiendo una amplia personalización. El desarrollo actual y futuro de nuevas funcionalidades utilizando esta tecnología se basa en la creatividad y los requisitos de los nuevos usuarios. La amplia adopción de dispositivos microfluídicos PETL probablemente dará lugar a la inclusión de nuevos materiales y configuraciones, a medida que los usuarios desarrollen diseños y enfoques novedosos para sus necesidades particulares.
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Disclosures
Fernando Ontiveros está en el proceso de lanzamiento de PETL FLUIDICS (LLC), una empresa que comercializará y brindará servicios de consultoría para esta tecnología. Los coautores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo de este manuscrito fue apoyado en parte por la National Science Foundation (NSF) (Grant No. CBET-1553826) (y suplemento ROA asociado) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (No de concesión. R35GM124935) a J.Z., y el fondo de la Facultad de Visitas de Notre Dame Melchor a F.O. Nos gustaría dar las gracias a Jenna Sjoerdsma y Basar Bilgiser por proporcionar células de mamíferos y protocolos de cultivo y a Fabio Sacco por la asistencia con figuras suplementarias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
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