Summary
ここでは、最小限の財務および時間投資でカスタムマイクロ流体デバイスを設計および製造するためのプロトコルを紹介します。バイオメディカル研究所や教育現場でのマイクロ流体技術の採用を促進することを目的としています。
Abstract
マイクロ流体デバイスは、ナノスケールからサブミリスケールに至るまでのチャネルで流体、粒子、細胞、マイクロサイズの器官または生物の操作を可能にします。生物科学におけるこの技術の使用の急速な増加は、幅広い研究グループにアクセス可能な方法の必要性を促している。PDMSボンディングなどの現在の製造規格では、高価で時間のかかるリソグラフィおよびボンディング技術が必要です。実行可能な代替手段は、簡単に手頃な価格で、最小限の専門知識を必要とし、設計の迅速な反復を可能にする機器や材料の使用です。本研究では、安価で製造が容易で、マイクロ流体技術に対する他のアプローチよりも生成時間が大幅に短いマイクロ流体デバイスであるPETラミネート(PETL)を設計・製造するためのプロトコルについて述べています。それらは、チャネルおよび他の特徴がクラフトカッターを使用して定義される熱結合されたフィルムシートから成っている。Petlは現場固有の技術的課題を解決すると同時に、導入の障害を劇的に軽減します。このアプローチは、研究と教育の両方の設定でマイクロ流体デバイスのアクセシビリティを容易にし、新しい問い合わせ方法のための信頼性の高いプラットフォームを提供します。
Introduction
マイクロ流体は、マイクロリットル(1 x 10-6 L)からピコリットル(1 x 10-12 L)までの容積で、小さなスケールで流体制御を可能にします。この制御は、マイクロプロセッサ産業1から借用された微細加工技術の応用により、部分的に可能になった。チャネルおよびチャンバーのマイクロサイズのネットワークの使用はユーザーが小さい次元の特徴の明確な物理的な現象の特徴を利用することを可能にする。たとえば、マイクロメートルスケールでは、粘性力が慣性力を支配する層流を使用して流体を操作できます。その結果、拡散輸送はマイクロ流体学の顕著な特徴となり、定量的および実験的に研究することができる。これらのシステムは、流体力学および輸送現象2の分野における重要な導出であるフィックの法則、ブラウン運動理論、熱方程式、および/またはナビエ・ストークス方程式を使用して適切に理解することができる。
生物科学の多くのグループは微視的なレベルで複雑なシステムを研究しているので、マイクロ流体デバイスは生物学2、3の研究アプリケーションに即座かつ重要な影響を与えると考えられていました。これは、膜または細胞内の小分子の輸送において拡散が支配的であり、細胞や微生物の寸法は、サブミリメートルシステムやデバイスに最適です。そのため、細胞実験や分子実験の方法を高める可能性が大きかった。しかし、生物学者によるマイクロ流体技術の広範な採用は、期待に遅れています4.技術移転の欠如の単純な理由は、エンジニアと生物学者を分離する規律的な境界である可能性があります。カスタムデバイスの設計と製造は、ほとんどの生物学的研究グループの能力のすぐ外にとどまっており、外部の専門知識や設備に依存しています。潜在的なアプリケーション、コスト、および設計の反復に必要な時間に精通していないことも、新しい導入者にとって重要な障壁です。これらの障壁は、イノベーションを混乱させ、生物科学の課題に対処するためのマイクロ流体の広範な適用を妨げる効果を持っていた可能性が高い。
ポイントのケース:1990年代後半以来、マイクロ流体デバイスの製造のための選択の方法となっています。PDMS(ポリジメチルシロキサン、シリコーン系有機ポリマー)は、透明性、変形性、生体適合性5などの物理的性質を有するため、広く使用されている材料である。この技術は、ラボ・オン・ア・チップとオルガン・オン・チップデバイスがこのプラットフォーム6で継続的に開発され、大きな成功を収めています。しかし、これらの技術に取り組んでいるグループのほとんどは、エンジニアリング部門で見つかるか、それらに強い関係を持っています4.リソグラフィーは、通常、金型や特殊な接合装置の製造のためのクリーンルームを必要とします。多くのグループにとって、標準のPDMSデバイスは、特に設計を繰り返し変更する必要がある場合に、資本コストとリードタイムにより理想的ではありません。さらに、この技術は、主に平均的な生物学者や専門の工学研究室にアクセスできない学生にはアクセスできません。マイクロ流体デバイスが広く採用されるためには、生物学者が一般的に使用する材料の性質の一部を模倣しなければならないことが提案されています。例えば、細胞培養やバイオアッセイに用いられるポリスチレンは、安価で使い捨てであり、大量生産に適しています。これに対し、PDMS系マイクロ流体の工業製造は、その機械的柔らかさ、表面処理不安定性、ガス透過性5のために実現されたことがない。これらの制限があり、カスタマイズされたデバイスを使用して技術的な課題を解決することを目標に、「社内」に構築され、xurography7、8、9プロトコルおよび熱ラミネートを利用する代替方法について説明します。この方法は、少ない資本と時間投資で採用することができます。
PETLは、ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムを用いて製造され、熱接着性エチレンビニル酢酸(EVA)で被覆される。両方の材料は、消費者製品に広く使用され、生体適合性であり、最小限のコストで容易に入手可能です。PET/EVAフィルムは、ラミネートパウチまたはロールの形態で得ることができる。愛好家や工芸品店で一般的に見られるコンピュータ制御のクラフトカッターを使用して、チャネルは、デバイスのアーキテクチャ11を定義するために、単一のフィルムシートから切り取られます。チャンネルは、(オフィス)サーマルラミネータ(図1A)を使用して結合された追加のフィルム(またはガラス)層を適用することによってシールされます。チャネルへのアクセスを容易にするために、穿状の自己接着ビニールバンパーが追加されます。製造時間は5~15分で、迅速な設計反復が可能です。Petlを作るために使用されるすべての機器と材料は、商業的にアクセス可能で手頃な価格です(リソグラフィのための何千ものUSDと比較して、<350 USD開始コスト)。したがって、Petlsは、従来のマイクロ流体によってもたらされる2つの主要な問題に対する新しい解決策を提供します: 手頃な価格と時間の有効性 (補足表 1, 2の PDMS/PETL 比較を参照)。
研究者に独自のデバイスを設計し、製造する機会を提供することに加えて、Petlは使いやすく直感的なので、教室で簡単に採用できます。PETLは、拡散、層流、マイクロミキシング、ナノ粒子合成、勾配形成および化学タクシスのような物理的、化学的、生物学的概念をよりよく理解するのに役立つ高校および大学のカリキュラム8に含めることができます。
この作業では、複雑さのレベルの異なるモデル Petls チップを製造するための全体的なワークフローを示します。最初の装置は小さい部屋の細胞およびマイクロ器官のイメージ投射を促進するために使用される。第2に、より複雑な装置は、いくつかの層と材料から成り、メカノバイオロジー9の研究に使用される。最後に、教育目的のために、いくつかの流体力学の概念(流体力学的焦点集め、層流、拡散輸送、マイクロミミックス)を表示するデバイスを構築しました。ここで紹介するワークフローとデバイスの設計は、研究と教室の両方の設定で、さまざまな目的に合わせて簡単に調整できます。
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Protocol
1. デザイン
- デバイスのアプリケーションを特定し、必要なチャネル/チャンバーコンポーネントをリストします。
メモ:すべてのデバイスは、入力チャンネルと出力チャンネルを必要とします。顕微鏡検査に使用される装置は、イメージングチャンバを必要とする。より複雑なデバイスは、複数の層に位置するチャネルとチャンバーを必要とします。 - まず、各レイヤーを手描きにして、デバイスの機能がレイヤーの重ね合わせによってどのように影響を受けるかを考慮します。
- 線や図形を描画できる任意のソフトウェアを使用して、コンピュータ上で最終的なデザインを描画します。
- 黒、実線、および色合いを欠いた形状を使用して、各レイヤーを個別に描画します。線の太さが 6 点以上を推奨します。この段階では、チャネルとチャンバーの特徴の寸法は、全体的な比率よりも重要ではありません。
- フィーチャを作成し、レイヤーを重ね合わせる場合は、コピーと貼り付け機能を使用します。レイヤ図面の例については、図 1Bを参照してください。
- 各レイヤーをクラフトカッターソフトウェアにインポートします(図1C)。これを行うには、描画されたデザインを画面キャプチャし、ドラッグ アンド ドロップアプローチを使用します。
- クラフトカッターソフトウェア(無料ダウンロード)で新しいドキュメントを作成します。表示されたマット上にイメージ ファイルをドロップします。ソフトウェアは、ほとんどの画像ファイルを認識します。
- コーナーから引っ張って処理を容易にするために画像を拡大します。これで、トレース機能を使用してソフトウェアで設計を認識できるようになりました。
注:ユーザーは、このソフトウェア上で直接deノボのデザインを作成することができます(デザインパレットの描画ツールを使用)。
- デザインをトレースするには、ウィンドウの右側にあるトレースアイコン(蝶の形状)を選択し、読み込んだデザインを完全に選択します。
- [アウトライン]というラベルの付いた[トレース プレビュー]オプションを選択します。[しきい値]と[スケール]の設定を調整して、デザインに合わせて黄色のトレースを調整します。
- 黄色のトレースがデザインと一致したら、[トレース]メニューの [トレース]を選択します。チャンネルが赤い輪郭で表示されるようになりました。赤い輪郭がデザインと一致する場合は、読み込んだイメージを選択して削除できます。これで、デザインがインポートされ、サイズ変更の準備が整いました。
- トレースされた設計を選択し、ソフトウェアによって提供されるグリッドを使用して、デバイスのサイズを変更します。引っ張って、チャンネルとチャンバーの幅と長さを変更します。
注:ソフトウェアは測定値を提供し、小さな線を一時的に描画(ウィンドウの左側にあるデザインパレットを使用)して、デバイス内の寸法を測定できます。機能的なチャネル幅寸法は100μmから900μmの範囲です。アセンブリ中に適切な位置合わせを確保するには、すべてのレイヤのサイズを比例的に設定することが重要です。- デザインのサイズを適切に設定したら、図形描画メニューで正方形ツールを選択して、デバイスの各レイヤーの周囲に正方形/長方形を描画します。この図形は、すべてのレイヤーで同じサイズにする必要があります。例については、図 1Cを参照してください。
- チャネルへのアクセス ポートを含む別の最上位レイヤを作成します。シンプルなデザインは、メイン(中央)チャンネルレイヤー、ボトムシール層(多くの場合ガラス)、チャンネル(入口/出口)にアクセスするための円形の穿話を含む必要があるトップレイヤーで構成されます。
注: 3 つ以上のレイヤーを含む設計では、複数のレイヤーの入口/出口穿話が必要になります (図 1C、図 5Aを参照)。これらの穿話は、既に設計に含まれている場合もあれば、この時点で追加することもできます。- 画面の左側にある描画ツールを選択します。設計の入口ポートと出口ポートの上に円を描画します。
- 元のデザインと円の両方をコピーして貼り付けます。基になるデバイスからチャネルを消去します。
注: これにより、入口/出口ポートは元の設計に対応する正しい位置に残ります。図形は、整列を支援するために、各レイヤーの周辺に追加することもできます。
- 表示されたマット上でカットするすべてのレイヤーを配置します。これで、デバイスを切断する準備ができました。
2. 切断
- 接着剤切断マットに、好ましい厚さ(3ミルが標準)の単一のPET/EVAフィルム(または他の材料)を塗布します。接着剤(マット)側が上を向き、プラスチック(光沢のある)側が下を向いていることを確認します。
注:層にオイルや微粒子を導入しないように、清潔な手袋を使用してください。 - フィルムをマットに平らにして(図1D)、閉じ込められた可能性のあるすべての空気を除去します。これは手袋の手またはローラーを使用して行うことができる。
- カッティングマットの端をカッターに示された線に合わせます。カッターのロードマットを押してマットをロードします。フィルムの厚さに応じて、切断ブレードの設定を3~5の間に保ちます。
- カッターのUSBケーブルをコンピュータに接続します。
- [送信]タブを選択し、切断設定を選択します。
注: カスケード メニューには多数の設定があります。-ステッカーペーパー、クリア-は、3〜5ミル(75〜125μm)の厚さを有するPET/EVAフィルムに適した設定です。さまざまな材料の設定を変更し、後で使用するためにカスタム設定を保存します。
- [送信]タブを選択し、切断設定を選択します。
- [送信]をクリックします。切断が始まります (図 1E)。カッターの背面に、マットが妨げられずに動くだけの十分なスペースがあることを確認します。カッターが終了したら、カッターで[アンロード]を選択してマットをアンロードします。荷を降ろす前にマットを引き出さないでください。
3. アライメント
- 切断マットをきれいな表面の横に置きます。手袋をした手で、ピンセットを使用して、マイクロ流体デバイスの各層をカットマットから持ち上げます(図1F)。チャンネルのターンや曲がりは特に注意してください。これらは特に繊細で、引き裂いたりゆがんだりする可能性があります。
- マイクロ流体デバイスの層をきれいな表面に置きます。デバイスの上から下の位置に従って順序付けします(図 1G、図2A、図5A、図7A)。
- レイヤーを一時的に取り付けるために使用される両面テープの小片(〜3mm x 10mm)をカットします。
- 一番下のレイヤーから始めて、レイヤーを 1 つずつ重ね合わせます。チャンネルや入口/出口から離れた層の間のコーナーに小さな両面テープを追加します(図1G、矢印)。テープは必須ではありませんが、層を固定化し、積層中にシフトしないことを保証します。ワイヤ治具を使用して、4 層以上のデバイスでのレイヤの位置合わせを容易にします (補足図 3)。
- フィルムの接着剤(マットEVA)側が常にデバイスの内側(層内部分)に面していることを確認します。
注意:露出した接着剤は、ラミネータの内部部分に対して溶融し、それらに付着し、デバイスの損失だけでなく、ラミネータの将来の性能にも影響を与えます。 - すべてのレイヤーを重ね合わせたら、デバイスを検査します。すべての層の間に少なくとも 1 つの EVA 側が存在し、EVA を公開する必要はありません。非EVA被覆材料(例えば、ポリ塩化ビニル(PVC)フィルム、ガラス)を導入する場合、特により複雑なデバイスの場合には、両側にEVAで被覆されたフィルムが必要になる場合がある(図5)。
4. ラミネート
- ラミネータをオンにし、目的の厚さ設定に設定します。一部のラミネーターは3と5ミルの設定を提供しますが、一部のラミネーターは提供していません。4層以上のデバイスの場合は、5mil設定を使用します。
- ラミネータの準備ができたら、ラミネートローラーを通してデバイスを実行します(図1H-I)。最良の結果を得るには、両面テープが追加された端を配置します。
注:5層以上のデバイスを製造する場合、ラミネータを複数回通して実行される場合があります。 - 積層デバイスを回復します。
メモ:ラミネータからの回復を容易にするために、デバイスが十分な大きさであることがお勧めします。この考慮事項は、チャネルやチップアーキテクチャのサイズに影響を与えず、単に内部に残ることなくラミネータを簡単に通過できる「フレーム」を必要とします。
5. 入口/出口ポート
- ロータリーツールと1/32 in.ドリルビットを使用して、家具バンパーの中心に小さな穴を開けます。または、バンパーを穿分するために1mmの生検パンチを使用してください。
メモ:ドリルプレスをお勧めします。サイズはさまざまですが、直径2mm×6mmのバンパーをお勧めします。単にバンパーを「刺す」のを避けてください。材料を取り外さない限り、バンパーは再びシールします(補足図1)。上記の穿話は、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブ、ピペットとチップ、または鈍い針(16-18 G)とインタフェースすることを意味します。より大きな穿話は、回転パンチプライヤーを使用して達成することができます(補足図1)。これらは、バンパーが液体または他の生物学的な「貯蔵所」として使用される場合に有用である。 - 小さなピンセットで破片(掘削やパンチによって引き起こされる)を取り除いて、オリフィスが完全にクリアされていることを確認します。
- 入口/出口ポートが正常にクリアされたら、バンパーを積層デバイスの入口/出口ポートに慎重に合わせます(図1J-K)。このステップは、デバイスに液体を出入りする適切な流れを持つために不可欠です。デバイスの後ろにバンパーを保持し、デバイスの開いた入口/出口に面した接着面を配置し、位置合わせして付着させます。これで、デバイス のアセンブリが完了しました。
6. テスト
- 穿進バンパー(ポート)を介してチャネル/チャンバーアーキテクチャにアクセスします。デバイスに流体や生物学的を導入する方法に関するいくつかのオプションがあります。
- プラスチックコネクタ(ルアーアダプタなど)または鈍い針に取り付けることによって、実験室または医療/外科チューブを使用してください。標準的なピペットとチップまたはアダプタなしのPEEKチューブも使用できます(補足図2)。
- 注射器や蠕動ポンプを使用して、注射器やチューブを使用して液体の注入または描画を行います。
注:市場には、執筆時点で〜300米ドルから始まる多くのオプションがあります。 - デバイスと実験に応じて異なる流量設定を設定します。
メモ:流量設定は0.01~100°L/分の範囲で日常的に使用していますが、その他のレートも使用できます。
図1:製造(A) オフィスラミネーターとクラフトカッターは、製造に必要な唯一の2つの機器です。どちらもオンラインまたは工芸品/事務用品店でご利用いただけます。その他の必要なツールには、はさみやピンセットが含まれます。(B)チャネルおよびチャンバーアーキテクチャは、描画ツールを含む任意のソフトウェアプログラムを使用してデジタル的に構成することができます(ベクトルグラフィックスは、一部のユーザーが好むかもしれませんが、必須ではありません)。線と図形は、白い背景を持つ黒で描画されます。デザインのファイルまたはスクリーンキャプチャは、ドラッグアンドドロップでクラフトカッターソフトウェアにインポートできます。(C) クラフトカッターソフトウェアは無料でダウンロードでき、カッターを制御する必要があります。ソフトウェアは、設計を取得し、サイジングなどの変更を可能にします。また、描画ツールも提供します。(D) 切断マットは、切断用のフィルムを運びます。わずかに接着剤で、切断する材料の固定化を可能にします。この図は、3ミル厚のPET/EVAフィルム(上)、5ミル厚のPET/EVAフィルム(中央)、6ミル厚のEVA/PET/EVA(左下)、PVCフィルム(右下)の4種類の材料をロード可能です。(E) カッターは、ブレード(黒)ユニットと装填マットを表示するために開いています。(F) 切断後、ピンセットを使用して個々の層を持ち上げます。チャンネルとチャンバーの切り抜きはマットに取り付けられたままで、後で取り外して廃棄されます。(G) 個々の層が整列され、積層のために重ね合わされます。両面テープ(矢印)の小片は、ラミネート中の層シフトを防ぐために、整列を助けるためによく使用されます。(H, I)装置はラミネーターの上部に供給され、スロットを通して回復される。ラミネートは、チャネルパスを開いたまま、堅牢なシールを提供します。(J, K)チャネルにアクセスするためには、穿足した自己接着ビニールバンパーを追加する必要があります。(J)の画像は、バンパーが背面から配置されるアライメントの「逆」アプローチを表示し、入口/出口をバンパー穿話で視覚的にアライメントできるようにします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
低コストで迅速なイテレーションに加えて、PETLテクノロジーを簡単にカスタマイズして特定の課題を解決できます。まず、ガラスカバースリップ、チャンバー層、チャネル層、および入口/出口層からなる単純なデバイスについて説明します(図2)。この装置は一定の流れの下で細胞およびマイクロ器官のイメージ投射を促進するように設計されていた。培養培地は、栄養とガスの交換を奨励するために低流量で補充されます。円形の部屋は反転顕微鏡を使用してイメージすることを可能にするガラス底を特色にする。この装置でガラスを使用する理由は少なくとも2つあります。最初のものは光学です。PETおよびEVAは、その光学的透明性および柔軟性のために使用される熱可塑性プラスチックであり、イメージングのためのインターフェースとして使用することができる(特に低倍率9.可視スペクトルにおけるPETの光透過率は87〜90%12の範囲である。しかし、ガラスはより良い光学特性を有し、生物学的イメージングに使用される標準である。ガラスを使用する第2の理由は、これまでに試験した細胞(哺乳動物細胞株)が、(未処理の)PET/EVAよりも容易にそれに付着する傾向があるからである。
図2:逆顕微鏡用の簡易チャンバー(A)装置は1つのガラス層および3つのPET/EVA層(3マイルの厚さ)から成っている。ガラスカバースリップ(24 mm x 60 mm)は底層です。次の層は、撮像室の底部を特徴とする。次の層は部屋の上半分を特色にし、イン/出口チャネルに接続する。したがって、チャネルの高さはわずか75μmであり、チャンバーの高さは150μmです。チャネルの幅はユーザによって決定されます(ここでは500μm)。最上層はチャンバー/チャネルパスを密封し、入口/出口へのアクセスを提供する。重ね合わせたレイヤーが右側に表示されます。(B) 完成したデバイスには、視覚化のために赤色の染料が注入されています。ローディングは、示すように、マイクロピペットとチップ、実験室または鈍い針、またはPEEKチューブを装備した医療/外科チューブを使用して達成することができる。(C)チャネル/チャンバー設計は、1つの装置で反復することができる(例えば、いくつかの個々の標本の観察を容易にする)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
この装置のチャネルおよび部屋の次元は記述する価値がある。Petlの高さは、常にフィルムまたは層の厚さの関数です。市販のPET/EVAは、1000分の1インチ(1ミル≥25μm)で測定された厚さを有する。したがって、チャネルおよびチャンバーの高さは通常25μmの倍数であり、標準Petlsは3または5ミルPET /EVAフィルムを使用して構築され、その結果、高さは75または125μmの特徴になります。図2に示す装置は、高さ75μmのチャネルと、合計高さ150μmの2層で定義されたチャンバーを有する。ただし、層は異なる材料(例えば、ガラス、箔、PVC、紙)で構成することができ、通常25〜250μmの範囲で様々な厚さを提示することができることに留意すべきです。
図3:細胞イメージング。(A)簡易チャンバーPETLは、接着細胞の短期培養に用いることができる。細胞はチャンバーに露出したガラスに付着し、逆顕微鏡を使用して観察することができる。(B)ラット好塩基球を、反転共焦点顕微鏡上で可視化するために、ホエヒト(青)および形質膜(赤色)蛍光色素で染色した。(C)単純なチャンバー装置における細胞の明視野画像。(D) 位相コントラスト画像。ホワイトスケールバーは200μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
PETL製造の性質は流体経路の設計の著しい複雑さを可能にする。単純なチャンバー装置は、Z軸の2つのレベル(1つのレベルでチャンバーのチャネルと上部、第2レベルのチャンバーの底)の特徴を含む4つの層で構成されています。Petlsが提供する利点は、3次元チャネル/チャンバーアーキテクチャを構築する容易さです。冷却または加熱チャネル、透析膜、電気回路または圧力線(図5を参照)などの機能の追加は、3次元で複数の層を接続することによって達成されます。これまでに発生した注意事項は、積層できるレイヤーの数の制限です。EVAキュレーションに必要な熱伝達は、全体的な厚さが800μmを超えるデバイスでは不十分であることがわかりました。この制限は、一部のデバイスで対処できます。多くの場合、新しいレイヤーが追加されるたびにラミネートが可能です。新しい層がデバイスの外側を向くために熱接着性(EVA)を必要とする場合、これは不可能です。
図4:マイクロオルガンイメージング(A)シンプルなチャンバーPETLは、ショウジョウバエメラノガスター(2倍倍率)の胚の翼円盤を画像化するために使用される。ウィングディスクの寸法は約90μm×250μm×500μmです。カバースリップウィンドウを通して1つまたは複数の器官を画像化することができます。別の翼ディスクの拡大倍率は、回転ディスク共焦点顕微鏡を用いて(B)20x/0.75-air、(C)40x/1.30-オイル、および(D)100x/1.49-オイル目標に示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
培養中の細胞の研究は、一定の流れや機械的刺激のような動的状態条件を提供するツールから利益を得る。図3は、哺乳動物細胞株を培養し、単純なチャンバー装置で画像化する例を示す。媒体はイメージングの間に絶えず交換することができ、理想的な成長条件を維持するだけでなく、リアルタイムでイメージングしながら化学刺激の制御された導入のためにも可能にする。これは、図 4に示すように、元 vivo マイクロオルガンのイメージングにも当てはまります。チャネルおよびチャンバー構造は、器官または組織から全生物(例えば、ショウジョウバエ胚および画像ディスクまたはC.エレガンス)に至る、異なる生物学的標本に適合するように特定の寸法で設計され得る。
図5:メカノ-PETL.単純なチャンバーPETLは、圧縮チャンバを追加することによって変更される。(A)このデバイスは、ガラス底層(カバースリップ、図示せず)、4つのPET/EVA 3ミル層(チャンネル/EVA層、スペーサー層および入口/出口層)、EVA/PET/EVA 6ミル層(チャネル/チャンバーシールおよびPVC接着)、変形可能なPVC層(圧縮用)の4つの異なる材料を備えた7つの層で構成されています。(B, C)標本チャネル/チャンバーパスは赤い染料を使用して視覚化される。圧縮チャネル/チャンバーパスには空気のみが含まれます。(D)空気圧は、手動(または機械的に)圧縮経路に加え、チャンバの上部にPVCフィルムの膨張をもたらす。膨張は部屋の染料を置き換え。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
生体標本の機械的摂動は、細胞生理学の理解を向上させ、胚発生や分化などのプロセスに光を当てます。図5は、単純なチャネル/チャンバアレイと圧縮チャンバからなるPETLデバイスを示しています。それは6層の(最も単純な形で)で構成され、そのうちの1つはPVCフィルムです。PVCフィルムは、空気圧が適用されると偏向し、チャンバー内の標本を圧縮します。この装置は、PET/EVA以外の材料の使用例であり、ショウジョウバエマイクロオルガン13の機械的負荷を研究するために利用されるPDMS/ガラスデバイスの交換に9を採用することに成功している(図6参照)。PETL デバイスは再利用可能です。ただし、製造コストが低く、フットプリントが減少し、連続的な操作や洗浄後に剥離する可能性があるため、すべての手順の開始時に新しいデバイスを使用することをお勧めします。
図6:メカノバイオロジーイメージング(A)ショウジョウバエルウィングディスクを発現するDROsophilaウィングディスクを発現するGFPは、20倍倍倍の回転ディスク共焦点顕微鏡を用いてメカノPETL内で画像化される。(B)チャンバーの上の膜を通る圧力は、手動で空気で満たされた注射器を作動させるか、またはシリンジポンプを使用することによって適用することができる。理想的なガス法則は、膜9に適用される力の量を推定するために使用されます。ディスクパウチ面積(白い点線)は~4psiの印種で約30%(赤い点線)増加した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
PETLデバイスの製造が容易なため、化学、生物学、工学教室、教育研究室などの教育環境での使用を検討してきました。教育 PETL の例を図7に示します。装置はマイクロスケール(例えば層流)の流体の流れの基本的な特徴の一部を表示するように設計されている。5 mil PET/EVA フィルム (図7A)の 4 つの層と、3 つの収束入力チャネルと蛇行構造を含むチャネル アーキテクチャで構成されています。マイクロミキシング14を促進する経路に円形の「うつ病」または「ダウン」ステップが追加されました。シリンジポンプを使用して、フェノール赤色溶液は外側のポートを介して注入され、pH 9溶液は中央ポートを介して注入されます。流体力学的集束15は、内側の流れを小さな流れに押し付けた外流体流れで可視化される(図7C)。装置の層流は対流混合を防ぎ、チャネルの長さに沿って徐々に拡散混合が示される(矢印)。示されているようなデバイスは、流体力学およびバイオトランスポートの概念(例えば、拡散、層流)を教えるために使用することができる。あるいは、学生は自分のデバイスを設計し、製造するために招待され、2〜3時間8続く定期的な実験室のセッションで行うことができるプロジェクトです。
図 7: 教室の Petls(A)装置は5ミルPET/EVAフィルムの4つの層を使用して製造される。2番目の層(右から左)は、チャネルパスの下に配置される円形のチャンバーを備えています。(B)完成した装置は、pHインジケータフェノールレッド(2 mM、黄色)と透明なpH9溶液(中央チャネル)を搭載しています。フェノール赤は、基本的なソリューションと接触するとマゼンタを回します。ボックスは、 (C) から (F) に示す領域を示します。(C)流体力学的集束。(D, E) 層流と拡散。(E、F)マイクロミキシング。白いスケールの棒はすべてのパネルの2つのmmである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:バンパー/ポート穿話(A) ロータリーツールを保持するドリルプレスのセットアップにより、バンパー穿話が容易になります。サイズ1/32"および3/64"のドリルビットが使用されます。(B) プロセスは効率的で、短時間で多数のバンパーを処理できます。(C)生検パンチ穿殺は掘削の代替手段である。(D) 回転パンチプライヤーは、より大きな穿話に使用されます。これらの穿話は、大きな標本(注入の代わりに液体の引き出しによって)または媒体貯蔵所としてロードするために使用することができる。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:チューブ。(A)実験室または医学/外科チューブ(1/32"ID、3/32"OD)はより簡単な選択である。それは柔軟で、切りやすいです。それは(18 G)鈍い針の使用を要求する。(B)針の1つは、チューブに取り付けることができるように第2の針から取り外される(ピンク)ルアーアダプタを使用して注射器に取り付けられています。(C) PEEKチューブ(0.010"ID、1/32"OD)に精通している研究者は、Petlsでそれを使用することができます。(D) PEEKフィッティング。(E)シリンジポンプセットアップは、チューブの両方のタイプで同じです。(F)実験室または医療/外科チューブのセットアップは、3/64"ドリルビットで穿話を必要とし、PEEKチューブは1/32"穿刺を必要とします。1 mmの生検のパンチでなされる穿話は管の両方のセットを収容できる。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:ワイヤー治具を使用した位置合わせ。デバイスの設計には、複数の層の配置のガイドとして機能する可能性のある穿話を含めることができます。ワイヤージグは約20米ドルで市販されています。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 4: サイズの制限クラフトカッターは幅が約100μm(A)の直線チャネルをカットできますが、150μm以下(B)を測定する特徴では、カットパターンの精度が大幅に低下します。図形の横の寸法は、チャネル幅を示します。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:PDMSにおけるマイクロ流体チップの製造にかかる時間とコスト※ウエハ/金型が容易に入手可能で、PDMSがオーブンで硬化できる製造時間。デザインの変更は、数日の遅延を表します。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:PETLマイクロ流体チップの製造にかかる時間とコストこのテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マイクロ流体は、世界中の実験室のツールボックスにますます存在しているが、その肯定的な影響の可能性を考えると、採用のペースは失望している16.マイクロ流体デバイス製造の低コストと高効率は、平均的な研究所でこの技術の採用を加速するために不可欠です。ここで説明する方法では、複数のフィルム層を使用して、リソグラフィ法に必要な時間とコストのほんの一部で 2 次元および 3 次元デバイスを作成します。標準リソグラフィは、起動に数千ドル(USD)の費用がかかり、製造に数日を要し、PETL製造の起動コストは350米ドル未満であり、デバイスは数分で製造することができます。これにより、研究室だけでなく、迅速なイテレーションが有利な設定(例えば、標準的なPDMSデバイスのプロトタイピング)、または安価で使い捨てデバイスの工業生産が必要な場所での採用が容易になります。例えば、Petlは生分解性材料を使用して製造することができ、ヘルスケア分野での使用に適応することができ、診断ツールとして理想的です。教室では、事前に作られた学習教材として、または学生が自分のデバイスを設計、製作、テストする創造的な課題として使用できます。
PETL製造は、単純化されることを意味する。ただし、この手法の重要な手順と現在の制限事項を特定すると便利です。一部のユーザーは、実験中に連続的なメディアの流れを持つことによって補償されるPDMSデバイスと比較して、PETLデバイスのガス交換が減少していることがわかります。もう 1 つの制限は、サイズ変更です。150μm未満のチャンネルやその他の機能は、カッターの解像度制限を下回っています(補足図4)。200 ~ 900 μm の範囲の幅を持つチャネルを操作することをお勧めします。これらの制限は柔軟性があり、特に上限しきい値で変化する傾向があります。たとえば、高さが 75 μm のチャネルは、チャネルの幅が 950 μm 以上の場合は折りたたまれますが、高さが大きければ開いたままになります。デバイスのアーキテクチャは用途によって異なりますが、高さ75~125μm、幅400~600μmのチャンネルを日常的に使用しています。
レイヤーとバンパーを揃える際の細部への注意が重要です。PETLの製造から生じるいくつかの合併症のほとんどは、アライメントの問題の結果です。ラミネート時に露出EVAは、内部ローラーに付着し、使用不能にすることができます。流体注入は、不適切な位置のバンパーによってブロックされる可能性があります。幸いなことに、Petlは安価であるだけでなく、急速に構築されているため、障害のあるデバイスを簡単に交換または変更できます。
Petlsは、他のマイクロ流体デバイスで使用されるものと同様の注入流量に耐えることができます。0.01~100μL/minは当社グループで使用される範囲ですが、最大500μL/min(および手で作動したマイクロピペットを使用する場合は高い)の流量を使用できます。我々は、Petlsが30〜57 psi8の範囲の圧力に耐えることができることを発見した。シリンジポンプは、絶対的な要件ではありませんが、ほとんどの実験設定に推奨されます。教室では、ブレットを使用して学生のデバイスをテストしました15.ペリスタリックポンプは、特にPetlsではガス交換が制限されているため、細胞培養などの特定の設定で有用です。PDMSは、この点でより有利であり得るが、浸出は懸念される5であり得る。我々はハイブリッドPET / EVA-PDMSを生産しようとしましたが、EVAはPDMSに直接準拠しません。後者の表面改質(例えば、プラズマ処理または界面活性剤処理)がこの問題を解決する可能性がある。Petlsと比較することができるもう一つのアプローチは、PMMAのCO2レーザーアブレーション17、18を使用したチャネルのマイクロ加工である。レーザー切断は、生成される熱がEVAを治癒し、不均一なチャネルエッジを生成する傾向があるため、PET/EVAフィルムと互換性がないことがわかりました。適切なレーザー装置を使用すると、製造コストも大幅に増加する可能性があります。
要約すると、Petlは現在の技術に比べて複数の利点を提供します:(i)コストは、消費者グレードの材料や機器の使用により、従来の方法よりも大幅に低く、研究者と学生の両方が簡単にアクセスできます。(ii) デバイスは数分以内に設計、切断、組み立てることができ、迅速なプロトタイプの反復が可能になり、時間効率の高い実験が容易になります。(iii) 複数のデバイスを同時に製造できるため、高スループットの生産が可能です。(iv) 様々な材料を組み込むことができ、汎用性を高め、広範なカスタマイズを可能にします。この技術を用いた新機能の現在および将来の開発は、新しいユーザーの創造性と要件にかかっています。PETLマイクロ流体デバイスの広範な採用は、ユーザーが彼らの特定のニーズのための新しいデザインやアプローチを開発するにつれて、新しい材料や構成を含む可能性が高いです。
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Disclosures
フェルナンド・オンティベロスは、この技術のコンサルティングサービスを製品化し、提供するPETL FLUIDICS(LLC)を立ち上げようとしています。共同執筆者は何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この原稿の作品は、国立科学財団(NSF)(グラントNo.)によって一部支援されました。CBET-1553826)(および関連するROAサプリメント)および国立衛生研究所(NIH)(補助金番号)R35GM124935)からJ.Z.、ノートルダム・メルチョル・ビデンティカル・ファンド・オンフ・レオ哺乳類の細胞と培養プロトコルとファビオ・サッコに補足的な数字を提供してくれたジェナ・ジョルズマとバサール・ビルギサーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
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