Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att designa och fabricera anpassade mikroflödessystem enheter med minimal ekonomisk och tid investeringar. Syftet är att underlätta införandet av mikrofluidic teknologier i biomedicinska forskningslaboratorier och pedagogiska miljöer.
Abstract
Microfluidic enheter möjliggör manipulation av vätskor, partiklar, celler, mikro-storlek organ eller organismer i kanaler som sträcker sig från nano till submillimeter skalor. En snabb ökning av användningen av denna teknik i de biologiska vetenskaperna har föranlett ett behov av metoder som är tillgängliga för ett brett spektrum av forskargrupper. Nuvarande tillverkningsnormer, såsom PDMS limning, kräver dyra och tidskrävande litografi och limning tekniker. Ett lönsamt alternativ är användningen av utrustning och material som är lätt överkomliga, kräver minimal expertis och möjliggör en snabb iteration av mönster. I detta arbete beskriver vi ett protokoll för att designa och producera PET-laminat (petls), mikroflödessystem enheter som är billiga, lätt att fabricera, och konsumerar betydligt mindre tid att generera än andra metoder för mikrofluidics teknik. De består av termiskt bundna film ark, där kanaler och andra funktioner definieras med hjälp av en Craft Cutter. PETLs lösa Fältspecifika tekniska utmaningar och samtidigt dramatiskt minska hindren för antagande. Den här metoden underlättar tillgängligheten för mikrofluidics-enheter i både forsknings-och utbildningsmiljöer, vilket ger en tillförlitlig plattform för nya undersökningsmetoder.
Introduction
Mikrofluidik möjliggör vätske kontroll i små skalor, med volymer som sträcker sig från mikroliter (1 x 10-6 l) till picoliter (1 x 10-12 l). Denna kontroll har möjliggjorts delvis på grund av tillämpningen av mikrofabrikationsmetoder lånade från mikroprocessor industrin1. Användningen av mikro-stora nätverk av kanaler och kammare gör det möjligt för användaren att dra nytta av de distinkta fysiska fenomen karakteristiska för små dimensioner. Till exempel, i mikrometerskalan, kan vätskor manipuleras med laminärt flöde, där trögflytande krafter dominerar tröghetskrafter. Som ett resultat, diffusiv transport blir framträdande inslag i mikrofluidik, och kan studeras kvantitativt och experimentellt. Dessa system kan förstås med hjälp av fick lagar, Brownian rörelse teori, värme ekvation, och/eller Navier-Stokes ekvationer, som är viktiga derivationer inom områdena strömningsmekanik och Transportfenomen2.
Eftersom många grupper i biologisk vetenskap studera komplexa system på mikroskopisk nivå, var det ursprungligen tänkt att mikroflödessystem enheter skulle ha en omedelbar och betydande inverkan på forskningstillämpningar i biologi2,3. Detta beror på diffusion är dominerande i transporten av små molekyler över membran eller i en cell, och dimensionerna av celler och mikroorganismer är en idealisk matchning för sub-millimeter system och enheter. Därför fanns det en betydande potential för att förbättra det sätt på vilket cellulära och molekylära experiment bedrivs. Men, brett antagande av mikroflödessystem teknik av biologer har släpat bakom förväntningarna4. En enkel orsak till bristen på tekniköverföring kan vara de disciplinära gränser som separerar ingenjörer och biologer. Anpassad enhet design och tillverkning har varit precis utanför de möjligheter som de flesta biologiska forskargrupper, vilket gör dem beroende av extern expertis och anläggningar. Brist på förtrogenhet med potentiella tillämpningar, kostnad, och den tid som krävs för design-iteration är också betydande hinder för nya adopterare. Det är troligt att dessa hinder har påverkat innovationen och hindrat den utbredda tillämpningen av mikrofluidik att ta itu med utmaningarna i de biologiska vetenskaperna.
Ett exempel: sedan slutet av 1990-talet Soft-Photolithography har varit den metod som val för tillverkning av mikrofluidic enheter. PDMS (Polydimetylsiloxan, en silikonbaserad organisk polymer) är ett allmänt använt material på grund av dess fysikaliska egenskaper, såsom transparens, deformerbarhet och biokompatibilitet5. Tekniken har haft stor framgång, med Lab-on-a-chip och orgel-on-a-chip enheter ständigt utvecklas på denna plattform6. De flesta av de grupper som arbetar med dessa tekniker, dock finns i ingenjörs avdelningar eller har starka band till dem4. Litografi kräver vanligtvis rena rum för tillverkning av formar och specialiserade bindningsutrustning. För många grupper, detta gör standard PDMS enheter mindre än perfekt på grund av deras kapitalkostnader och ledtid, särskilt när det finns ett behov av att göra upprepade konstruktionsändringar. Dessutom är tekniken mestadels otillgänglig för den genomsnittlige biologen och för studenter utan tillgång till specialiserade laboratorier. Det har föreslagits att för mikrofluidiska anordningar som skall antas allmänt, måste de efterlikna några av de kvaliteter av material som vanligen används av biologer. Till exempel, polystyren används för cellkultur och bioassays är billig, disponibel, och mottaglig för massproduktion. Däremot har industriell tillverkning av PDMS-baserade mikrofluidik aldrig realiserats på grund av dess mekaniska mjukhet, ytbehandling instabilitet, och gas permeabilitet5. På grund av dessa begränsningar, och med målet att lösa tekniska utmaningar med hjälp av kundanpassade enheter byggda "in-House", beskriver vi en alternativ metod som utnyttjar xurography7,8,9 protokoll och termisk laminering. Denna metod kan antas med lite kapital och tid investeringar.
PETLs är tillverkade med polyetylentereftalat (PET) film, belagd med den termoadhesiva etylen-vinylacetat (EVA). Båda materialen används ofta i konsumentprodukter, är biokompatibla och är lätt tillgängliga till minimal kostnad10. PET/EVA film kan erhållas i form av laminering påsar eller rullar. Med hjälp av en datorstyrd hantverk fräs som vanligtvis finns i hobby eller hantverk butiker, kanaler skärs ut ur en enda film blad för att definiera enhetens arkitektur11. Kanalerna förseglas sedan genom att använda ytterligare film (eller glas) skikt som är bundna med en (kontor) termisk laminatorn (figur 1A). Perforerade, självhäftande vinylstötfångare tillsätts för att underlätta tillgången till kanalerna. Fabrication Times sträcker sig från 5 till 15 min, vilket möjliggör snabb design iteration. All utrustning och material som används för att göra PETLs är kommersiellt tillgängliga och överkomliga (< 350 USD start kostnad, jämfört med tusentals USDs för litografi). Därför, PETLs ge en ny lösning på två huvudsakliga problem som orsakas av konventionella mikrofluidik: överkomliga priser och tidseffektivitet (se PDMS/PETL jämförelse i kompletterande tabeller 1,2).
Förutom att ge forskarna möjlighet att designa och tillverka sina egna produkter, kan PETLs enkelt antas i klassrummet eftersom de är enkla och intuitiva att använda. Petls kan ingå i gymnasiet och högskolans läroplaner8, där de används för att hjälpa eleverna bättre förstå fysiska, kemiska och biologiska begrepp, som diffusion, laminärt flöde, micromixing, nanopartiklar syntes, lutning formation och chemotaxis.
I detta arbete illustrerar vi det övergripande arbetsflödet för tillverkning av modell PETLs marker med olika komplexitetsnivåer. Den första enheten används för att underlätta avbildning av celler och mikro organ i en liten kammare. Den andra, mer komplexa enheten består av flera lager och material, och används för forskning i Mekanobiologi9. Slutligen byggde vi en enhet som visar flera Fluid Dynamics begrepp (hydrodynamisk fokusering, laminärt flöde, diffus transport och micromixing) för utbildningsändamål. Arbetsflödet och enhets designen som presenteras här kan enkelt skräddarsys för ett stort antal syften i både forsknings-och klassrums inställningarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design
- Identifiera en applikation för enheterna och lista de kanal/kammar komponenter som kommer att krävas.
Obs: alla enheter kommer att kräva in-och utmatnings kanaler. Enheter som används för mikroskopi kommer att kräva en avbildning kammare. Mer komplexa enheter kräver kanaler och kammare som finns i flera lager. - Börja med hand-ritning varje skikt, med tanke på hur enhetens funktionalitet påverkas av superpositionen av lagren.
- Rita den slutgiltiga designen på en dator med någon programvara som gör det möjligt att rita linjer och former.
- Rita varje skikt separat med svarta, heldragna linjer och former som saknar nyanser. Linjetjocklek på 6 eller fler punkter rekommenderas. I detta skede är måtten på kanal-och kammar funktioner mindre viktiga än de totala proportionerna.
- Använd funktionen Kopiera och klistra in när du skapar funktioner och övertvingar lager. Se figur 1B för exempel på lager ritningar.
- Importera varje skikt i Craft Cutter programvaran (figur 1C). Gör detta genom att göra en skärmdump av den ritade designen och med hjälp av en dra och släpp-metoden.
- Skapa ett nytt dokument i Craft Cutter Software (gratis nedladdning). Släpp bildfilen på mattan som visas. Programvaran kommer att känna igen de flesta bildfiler.
- Förstora bilden för att underlätta bearbetningen genom att dra från ett hörn. Designen kan nu kännas igen av programvaran med hjälp av spårnings funktionen.
Obs: användare kan producera de Novo mönster direkt på denna programvara (Använd ritverktyg i designpaletten).
- Om du vill spåra designen väljer du spårnings ikonen (formen på en fjäril) på höger sida av fönstret och väljer helt och hållet de importerade designerna.
- Markera alternativet spåra förhandsgranskning med etiketten disposition. Justera (om det behövs) tröskelvärdet och skala inställningar för att justera den gula spårningen så att den matchar designen.
- Välj trace från spårnings menyn när den gula spårningen matchar designen. Kanalerna visas nu som en röd kontur. Om den röda kon turen matchar designen kan den importerade bilden väljas och tas bort. Designen är nu importerad och klar för storlekssortering.
- Storleken på enheten genom att välja den spårade designen och genom att använda rutnätet som tillhandahålls av programvaran. Dra för att ändra bredden och längden på kanaler och kamrar.
Obs: programvaran ger mätningar, och små linjer kan dras tillfälligt (Använd designpaletten på vänster sida av fönstret) för att mäta dimensioner inom enheten. Funktionell kanalbredd dimensionerna varierar från 100 μm till 900 μm. dimensioner kan behöva justeras efter att ha testat de första prototyperna. Det är viktigt att alla skikt är dimensionerade proportionellt, för att säkerställa korrekt justering under monteringen.- När designen har rätt storlek väljer du verktyget kvadrat på formen Rita-menyn för att rita en kvadrat/rektangel runt varje skikt av enheten. Den här formen ska ha samma storlek för alla lager. Se figur 1C för exempel.
- Skapa ett separat översta lager som innehåller Åtkomstportar till kanalerna. Enkel design kommer att bestå av en huvudsaklig (mitten) kanal skikt, en botten tätnings skikt (ofta glas) och ett toppskikt som bör innehålla cirkulära perforeringar för att komma åt kanalerna (inlopp/uttag).
Anmärkning: konstruktioner som innehåller mer än tre skikt kommer att kräva inlopp/utlopps perforeringar i flera skikt (se figur 1C, figur 5A). Dessa perforeringar kan redan ingå i konstruktionen, eller kan läggas till vid denna tidpunkt.- Välj ritverktyget på skärmens vänstra sida. Rita cirklar över inlopps-och utlopps portarna på konstruktionen.
- Kopiera och klistra in både den ursprungliga designen och cirklarna. Radera kanalerna från den underliggande enheten.
Obs: Detta lämnar inlopps-/utlopps portarna i rätt läge som motsvarar den ursprungliga designen. Former kan också läggas till i periferin för varje skikt för att hjälpa till med justering.
- Ordna alla lager som ska klippas på den visade mattan. Enheten är nu klar för kapning.
2. kapning
- Applicera en enda PET/EVA film (eller annat material) av önskad tjocklek (3 mil är standard) på den självhäftande skär mattan. Se till att limmet (Matt) sidan är vänd uppåt och plasten (blanka) sidan vänd nedåt.
Obs: Använd rena handskar för att undvika att införa oljor och mikropartiklar till lagren. - Platta filmen mot mattan (figur 1D) och ta bort all luft som kan ha fastnat. Detta kan göras med handskar händer eller en rulle.
- Rikta in kanten på skär mattan mot den linje som anges på fräsen. Fyll på mattan genom att trycka på Last mattan på fräsen. Håll inställningen på skärbladet mellan 3 och 5, beroende på filmtjockleken.
- Anslut fräsens USB-kabel till datorn.
- Välj fliken Skicka och välj en skär inställning.
En mängd olika inställningar finns på menyn kaskad. Den-sticker papper, Clear-är en inställning som fungerar bra med PET/EVA film som har en tjocklek på 3 – 5 mil (75 – 125 μm). Ändra inställningar för olika material och spara anpassade inställningar för framtida användning.
- Välj fliken Skicka och välj en skär inställning.
- Klicka på Skicka. Kommer att påbörjas (figur 1E). Se till att det finns tillräckligt med utrymme i ryggen på fräsen för mattan att röra obehindrat. När fräsen är klar, lossa mattan genom att välja lossa på fräsen. Dra inte ut mattan före lossning.
3. anpassning
- Placera skär mattan bredvid en ren yta. Med handskar på händerna, Använd ett par pincett för att lyfta varje skikt av mikrofluidik enheten från Cut mattan (figur 1F). Var särskilt försiktig runt svängar och kurvor i kanalen; dessa är särskilt känsliga och mottagliga för rivning och skevhet.
- Placera lagren av mikrofluidik enheten på en ren yta. Beställ dem enligt deras topp-till-botten position i anordningen (figur 1G, figur 2a, figur 5a och figur 7a).
- Skär små (~ 3 mm x 10 mm) bitar av dubbelhäftande tejp som kommer att användas för att tillfälligt fästa lagren tillsammans.
- Överlägga lagren en efter en, börjar med bottenlagret. Lägg till en liten bit dubbelhäftande tejp till ett hörn mellan lagren, bort från alla kanaler eller inlopp/uttag (figur 1G, pil). Tejpen, men inte krävs, immobilizes lagren och försäkrar att de inte kommer att skifta under laminering. Använd en trådjigg för att underlätta justeringen av lager i enheter med mer än 4 skikt (kompletterande figur 3).
- Se till att limmet (Matt-EVA) sidan av filmen alltid ansikten insidan (inom lager delen) av enheten.
Varning: det exponerade limmet smälter mot laminatorens inre delar och fäster vid dem, vilket inte bara resulterar i förlust av anordningen utan även påverkar laminatorens framtida prestanda. - Inspektera enheten när alla lager har överlagringar. Det bör finnas minst en EVA sida mellan alla skikt, och ingen EVA bör exponeras. Vid införande av icke-EVA-belagda material (t. ex. polyvinylklorid (PVC) film, glas), kan en film belagd med EVA på båda sidor behövas, särskilt när det gäller mer komplexa anordningar (figur 5).
4. laminering
- Sätt på och Ställ in laminatorn till önskad tjocklek inställning. Vissa laminatorer erbjuder 3 och 5 mil inställningar, medan vissa inte. För alla enheter med 4 eller fler lager använder du 5-mil-inställningen.
- När laminatorn är klar, kör enheten genom laminering rullarna (figur 1H – I). Placera den ände som dubbelhäftande tejp har lagts till för bästa resultat.
Anmärkning: när fabricera enheter av fem eller flera skikt, kan de köras genom laminatorn mer än en gång. - Återställ den laminerade enheten.
Obs: det är lämpligt för enheter att vara tillräckligt stor för att göra lätt sin återhämtning från laminatorn. Detta övervägande påverkar inte storleken på kanalerna eller chip arkitektur, det kräver helt enkelt en "ram" som lätt kan gå igenom laminatorn utan att förbli inne.
5. inlopps-/utloppsportar
- Använd ett roterande verktyg och en 1/32 i. borra lite för att skära ett litet hål genom mitten av en möbel stötfångare. Alternativt, Använd en 1 mm biopsi Punch att perforera stötfångare.
Obs: en borr press rekommenderas. Även om storlekarna varierar, rekommenderas stötfångare med 2 mm x 6 mm diameter. Undvik att bara "stickande" stötfångaren. Om materialet inte avlägsnas, tätar stötfångaren igen (kompletterande figur 1). Perforeringar som anges ovan är avsedda att samverka med polyetereterketon (PEEK) slangar, en pipett och spets, eller en trubbig nål (16 – 18 G). Större perforeringar kan åstadkommas med roterande stantänger (kompletterande figur 1). Dessa är användbara när stötfångaren används som en "reservoar" för vätskor eller andra Biologicals. - Se till att öppningen är helt klar genom att ta bort eventuellt skräp (orsakad av borrning eller stansning) med ett par små pincetter.
- Efter att inlopps-/utlopps portarna har rensats, justera stötfångarna försiktigt med inlopps-/utlopps portarna på den laminerade enheten (figur 1J – K). Detta steg är viktigt för att ha korrekt flöde av vätskor in och ut ur anordningen. Håll stötfångaren bakom enheten, placera det självhäftande ansiktet mot den öppna inloppet/utloppet på enheten, justera och följ. Enhets sammansättningen är nu slutförd.
6. provning
- Få åtkomst till kanal-/kammararkitekturerna genom de perforerade stötfångarna (portarna). Det finns flera alternativ om hur man introducerar vätskor och Biologicals i enheterna.
- Använd laboratorium eller medicinsk/kirurgisk slang genom att fästa den på en plast kontakt (t. ex. lueradaptrar) eller till en trubbig nål. En standardpipett och spets eller PEEK slang utan adaptrar kan också användas (kompletterande figur 2).
- Utför infusion eller ritning av vätskor med sprutor och slangar med sprutor eller Peristaltiska pumpar.
Obs: det finns många alternativ på marknaden, från ~ 300 USD vid skrivande stund. - Ställ in olika inställningar för flödeshastighet enligt enheten och experimentera.
Obs: vi använder rutinmässigt flödeshastigheter i intervallet 0,01 – 100 μL/min, men andra priser kan användas.
Figur 1: tillverkning. (A) en kontors laminatorn och en Craft Cutter är de enda två delar av utrustning som krävs för tillverkning. Båda är tillgängliga online eller på hantverk/kontorsmaterial butiker. Andra nödvändiga verktyg inkluderar sax och pincett. (B) kanal-och kammar arkitekturer kan komponeras digitalt med hjälp av alla program som innehåller ritverktyg (vektorgrafik kan föredras av vissa användare, men krävs inte). Linjer och former ritas i svart med en vit bakgrund. Filen eller en skärmdump av designen kan importeras till Craft Cutter programvara genom att dra och släppa. (C) Craft Cutter programvara är tillgänglig gratis att ladda ner och krävs för att styra fräsen. Programvaran förvärvar designen och möjliggör ändringar, som dimensionering. Det ger också ritverktyg. D) skär mattan bär filmen för kapning. Det är något lim, vilket möjliggör immobilisering av de material som ska klippas. Figuren visar fyra olika material redo för lastning: 3 mil tjocka PET/EVA film (överst), 5 mil tjocka PET/EVA film (mitten), 6 mil tjocka EVA/PET/EVA (nedre vänstra) och PVC-film (längst ner till höger). (E) fräs är öppen för att Visa Blade (i svart) enhet och lastad matta. (F) efter styckning lyfts enskilda skikt med hjälp av pincett. Klipp ut av kanaler och kammare förblir knutna till mattan och senare avlägsnas och kasseras. G) enskilda skikt är justerade och överlagda för laminering. Små bitar av dubbelhäftande tejp (pil) används ofta för att hjälpa till att justera och förhindra lager växling under laminering. (H, I) Enheten matas i toppen av laminatorn och återvinns genom facket. Laminering ger en robust tätning och lämnar kanal banorna öppna. (J, K) För att få tillgång till kanalerna, är det nödvändigt att lägga perforerade, självhäftande vinyl stötfångare. Bild i (J) visar "omvänd" inställning för justering, där stötfångaren är placerad från baksidan, vilket möjliggör visuell justering av inloppet/utloppet med stötfångaren perforering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förutom låg kostnad och snabb iteration, PETL teknik kan enkelt anpassas för att lösa specifika utmaningar. För det första beskriver vi en enkel anordning som består av en glastäckslip, ett kammar skikt, ett kanal skikt och ett inlopps-/utlopps skikt (figur 2). Denna apparat har utformats för att underlätta avbildning av celler och mikroorgan under konstant flöde. Odlingsmediet fylls på med låga flöden för att stimulera näringsämnen och gasutbyte. Den runda kammaren har en glasbotten, som möjliggör avbildning med hjälp av ett inverterat Mikroskop. Det finns minst två anledningar till att använda glas i denna apparat. Den första är optik. PET och EVA är termoplaster som används för deras optiska transparens och flexibilitet, och kan användas som ett gränssnitt för avbildning (särskilt vid låga förstoringar9. Ljusgenomsläpplighet av PET i det synliga spektrumet varierar från 87 till 90%12. Glas har dock bättre optiska egenskaper och är den standard som används i biologisk avbildning. Den andra anledningen att använda glas är att de celler som hittills testats (däggdjurs cellinjer), tenderar att fästa mer lätt än att (obehandlad) PET/EVA.
Figur 2: enkel kammare för inverterad mikroskopi. (A) anordningen består av ett glasskikt och tre PET/Eva skikt (3 mil tjock). En glastäckslip (24 mm x 60 mm) är bottenskiktet. Nästa lager har botten av bild kammaren. Nästa skikt har den övre halvan av kammaren och ansluter den till in/utlopp kanal. Således är höjden på kanalen endast 75 μm, medan höjden på kammaren är 150 μm. Kanalens bredd bestäms av användaren (500 μm visas här). Det översta lagret tätar kammaren/Kanalvägen och ger tillgång till inloppet/uttagen. De överlagda lagren visas till höger. (B) den färdiga anordningen visas infunderas med rött färgämne för visualisering. Lastning kan uppnås med hjälp av en micropipett och spets, laboratorium eller medicinsk/kirurgisk slang utrustad med en trubbig nål, eller PEEK slangar, som visas. C) kanal-/kammar designen kan itereras i en enda enhet (t. ex. för att underlätta observation av flera enskilda prover). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Måtten på kanalerna och kammaren i den här enheten är värda att beskriva. Höjd i PETLs är alltid en funktion av film eller skikttjocklek. Kommersiellt tillgängliga PET/EVA har en tjocklek mätt i tusendelar av en tum (1 mil ≈ 25 μm). Därför är kanal-och kammar höjder vanligtvis multiplar av 25 μm. standard PETLs byggs med 3 eller 5 mil PET/EVA film, vilket resulterar i funktioner med en höjd av 75 eller 125 μm. Enheten som visas i figur 2 har kanaler med en höjd på 75 μm, och en kammare definierad av två skikt, med en total höjd på 150 μm. Det bör dock noteras att lagren kan bestå av olika material (t. ex. glas, folie, PVC, papper) och kan uppvisa varierande tjocklek, vanligen mellan 25 och 250 μm.
Figur 3: cell avbildning. (A) den enkla kammar petl kan användas för kortvarig kultur av anhängare celler. Cellerna följer det glas som exponeras i kammaren och kan observeras med hjälp av ett inverterat Mikroskop. B) rått basofiler färgas med Hoechst (blå) och plasmamembran (röda) fluorescerande färgämnen för visualisering på ett inverterat konfokalmikroskop. C) ljus fält bild av celler i en enkel kammar enhet. (D) bild för faskontrast. Vit Skale stång är 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Arten av PETL Fabrication möjliggör betydande komplexitet i vätske bana design. Den enkla kammaren enheten består av fyra skikt som innehåller funktioner i två nivåer av z-axeln (kanal och toppen av kammaren i en nivå, botten av kammaren i den andra nivån). En fördel som PETLs är den lätthet med vilken 3-dimensionell kanal/kammare arkitekturer kan byggas. Tillägg av funktioner som kyl-eller värme kanaler, dialysmembran, elektriska kretsar eller tryckledningar (se figur 5) uppnås genom att flera lager ansluts i tre dimensioner. En varning hittills stött på är gränsen för antalet skikt som kan lamineras. Värmeöverföring som krävs för EVA Curation har befunnits vara otillräcklig i enheter med en total tjocklek över 800 μm. Den här begränsningen kan åtgärdas i vissa enheter. I många fall är det möjligt att laminera varje gång ett nytt lager läggs till. Detta är inte möjligt när ett nytt lager kräver termolim (EVA) att möta utsidan av anordningen.
Figur 4: mikroorganavbildning. (A) den enkla kammar petl används för att avbilda en vinge skiva av embryot av Drosophila melanogaster (2x förstoring). Ving skivans mått är cirka 90 μm x 250 μm x 500 μm. Ett eller flera organ kan avbildas genom täckslip-fönstret. Ökade förstoringar av en annan vinge skiva visas i (B) 20x/0,75-luft, (C) 40x/1.30-olja, och (D) 100x/1,49-Oil mål med hjälp av en snurrande skiva konfokalmikroskopi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Studiet av celler i kulturen gynnas av verktyg som ger dynamiska tillstånd tillstånd som konstant flöde eller mekaniska stimuli. Figur 3 är ett exempel där en cellinjer från däggdjursceller odlas och avbildas i en enkel kammar enhet. Medium kan ständigt bytas under Imaging, vilket gör att inte bara för att bibehålla idealiska tillväxtförhållanden, men också för kontrollerad införandet av kemiska stimuli medan Imaging i realtid. Detta gäller även för avbildning av ex-vivo-mikroorgan, som visas i figur 4. Kanal-och kammar strukturer kan utformas med specifika dimensioner för att passa olika biologiska prover, från organ eller vävnader till hela organismer (t. ex. Drosophila embryon och imaginal skivor eller C. elegans).
Figur 5: Mechano-PETL. Den enkla kammar PETLEN modifieras genom att tillsätta en kompressions kammare. (A) enheten består av sju skikt med fyra olika material: ett glasbotten skikt (täckslip, visas inte), fyra PET/Eva 3 mil lager (kanal/kammare lager, spacer lager och inlopp/utlopp lager), en Eva/PET/Eva 6 mil skikt (kanal/kammare tätning och PVC adhesion) och en DEFORMERBAR PVC-skikt (för kompression). (B, C) Prov kanals/kammar banan visualiseras med hjälp av rött färgämne. Kompressions kanal/kammar bana innehåller endast luft. (D) lufttrycket är manuellt (eller mekaniskt) anbringat på kompressions banan, vilket resulterar i en utvidgning av PVC-filmen på kammarens ovansida. Expansionen förflyttar färgämnet i kammaren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mekanisk störning av biologiska prover förbättrar vår förståelse av cellulär fysiologi och belyser processer som embryonal utveckling och differentiering. Figur 5 beskriver en petl enhet som består av en enkel kanal/kammare array och en kompressions kammare. Den består (i sin enklaste form) av sex skikt, varav en är en PVC-film. PVC-filmen reflekterar när lufttrycket appliceras, vilket gör att det komprimerar prover i kammaren. Denna enhet är ett exempel på användning av andra material än PET/EVA, och det har framgångsrikt använts9 i att ersätta PDMS/glas anordningar utnyttjas för att studera mekanisk belastning på Drosophila mikro-organ13 (som visas på figur 6). PETL-enheter är återanvändbara. Men på grund av den låga kostnaden för tillverkning, minskad fotavtryck, och potentialen för delaminering efter kontinuerlig manipulation eller tvättning, rekommenderar vi användning av nya enheter i början av varje förfarande.
Figur 6: Mechanobiologi Imaging. A) ende-cadherin:: GFP uttrycker Drosophila Wing Disc är avbildad inom en Mechano-petl med en snurrande skiva konfokal Mikroskop vid 20x förstoring. (B) tryck genom membranet ovanför kammaren kan appliceras genom att aktivera en luftfylld spruta manuellt eller med hjälp av en sprutpump. Den idealiska gas lag används för att uppskatta mängden kraft appliceras på membranet9. Skiv påse område (vit prickad linje) ökade med cirka 30% (rödprickig linje) med tillämpning av ~ 4 psi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
På grund av den enkla tillverkningen av PETL-enheter har vi utforskat deras användning i pedagogiska miljöer som kemi, biologi och ingenjörs klass och undervisnings laboratorier. Ett exempel på en pedagogisk PETL visas i figur 7. Enheten är konstruerad för att visa några av de grundläggande funktionerna i vätskeflödet i mikroskalan (t. ex. laminärt flöde). Den består av fyra lager av 5 mil PET/EVA film (figur 7A) och en kanal arkitektur som innehåller tre konvergerande ingångskanaler och en Serpentine struktur. Cirkulära "fördjupningar" eller "down" steg har lagts till vägen för att främja micromixing14. Med hjälp av en sprutpump, är fenol Red Solution infunderas genom de yttre portarna medan pH 9 lösning infunderas genom centrum porten. Hydrodynamisk fokusering15 visualiseras med det yttre vätskeflödet som tvingar det inre flödet till en mindre ström (figur 7C). Laminärt flöde i anordningen förhindrar konvektiv blandning, och gradvis diffusiv blandning visas längs kanalens längd (pilar). Enheter som den som visas kan användas för att undervisa begrepp (t. ex. diffusion, laminärt flöde) i fluiddynamik och bio transport. Alternativt kan eleverna bli inbjudna att designa och tillverka sina egna enheter, ett projekt som kan genomföras i en regelbunden laboration som varar två till tre timmar8.
Figur 7: PETLs i klassrummet. (A) enheten är tillverkad med fyra lager av 5 mil PET/Eva film. Det andra lagret (från höger till vänster) har cirkulära kammare som kommer att placeras under Kanalsökvägen. B) den färdiga anordningen har lastats med pH-indikatorn fenolrött (2 mm, gult) och en transparent pH 9-lösning (Mittkanal). Phenol Red blir Magenta vid kontakt med grundläggande lösningar. Rutorna indikerar områden som visas i (C) till (F). Chydrodynamisk fokusering. (D, E) laminärt flöde och diffusion. (E, F) micromixing. Vit Skale listen är 2 mm i alla paneler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: stötfångare/port perforering. (A) en borr press setup som håller ett roterande verktyg underlättar stötfångaren perforering. Borr bitarna i storlekarna 1/32 "och 3/64" används. (B) processen är effektiv, och ett stort antal stötfångare kan bearbetas på kort tid. C) perforering av biopsi är ett alternativ till borrning. D) en roterande stans tång används för större perforeringar. Dessa perforeringar kan användas för att lasta stora prover (genom vätske abstinens istället för infusion) eller som Media reservoarer. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: slangar. (A) laboratorium eller medicinsk/kirurgisk slang (1/32 "ID, 3/32" OD) är det enklare alternativet. Den är flexibel och lätt att klippa. Det kräver användning av (18 G) trubbiga nålar. (B) en av nålarna fästs på sprutan med den (rosa) lueradaptern, som avlägsnas från en andra nål så att den kan monteras på slangen. (C) forskare som redan är bekanta med Peek slangar (0,010 "ID, 1/32" OD) kan använda den med petls. D) Peek-beslag. (E) sprutpumpens Ställ in är densamma för båda typerna av slangar. (F) laboratorium eller medicinsk/kirurgisk slang inrättas kommer att kräva perforeringar med en 3/64 "borr bit, medan Peek slangar kommer att behöva 1/32" perforeringar. Perforeringar gjorda med en 1 mm biopsi Punch kan rymma båda uppsättningarna av slangar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Tilläggs figur 3: justering med hjälp av en trådjigg. Utformningen av enheten kan innehålla perforeringar som kan fungera som stödlinjer för anpassningen av flera skikt. Tråd jiggar finns kommersiellt tillgängliga för cirka 20 USD. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 4: storleksbegränsningar. Även Craft fräsar kan skära raka kanaler som är ~ 100 μm i bredd (a), är noggrannheten i snitt mönstren kraftigt minskat för funktioner som mäter 150 μm eller mindre (B). Dimensionerna bredvid formerna indikerar kanalbredden. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Tilläggstabell 1: tid och kostnad för tillverkning av mikroflödessystem chip i PDMS. * Tillverkning tid när wafer/mögel är lätt tillgänglig och PDMS kan botas med hjälp av en ugn. Alla designändringar representerar en fördröjning på flera dagar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggstabell 2: tid och kostnad för tillverkning av petl mikroflödessystem chip. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan mikrofluidik är alltmer närvarande i verktygslådan av laboratorier runt om i världen, har takten i antagandet varit en besvikelse, med tanke på potentialen för dess positiva inverkan16. Låg kostnad och hög verkningsgrad av mikroflödessystem enhet tillverkning är avgörande för att påskynda antagandet av denna teknik i det genomsnittliga forskningslaboratoriet. Metoden som beskrivs här använder flera skikt för att skapa två och tredimensionella enheter till en bråkdel av den tid och kostnad som krävs av litografiska metoder. Standard litografi kostar tusentals dollar (USD) till start-up, och kräver dagar att fabricera, PETL Fabrication start kostnaden är mindre än 350 USD och enheter kan tillverkas i minuter. Detta underlättar deras antagande inte bara i forskningslaboratoriet utan också i inställningar där snabb iteration är fördelaktigt (t. ex. prototyper för standard PDMS-enheter), eller där den industriella produktionen av billiga engångsprodukter krävs. Till exempel kan PETLs tillverkas med biologiskt nedbrytbart material, och kan anpassas för deras användning inom sjukvården, vilket gör dem idealiska som diagnostikverktyg. De kan användas i klassrummet, antingen som prefabricerade läromedel eller som en kreativ utmaning, där eleverna designar, fabricera och testa sina egna enheter.
PETL Fabrication är tänkt att vara okomplicerad. Det är dock bra att identifiera kritiska steg och nuvarande begränsningar av denna teknik. Vissa användare kommer att finna att gasutbyte i PETL enheter reduceras i jämförelse med PDMS enheter, som kompenseras genom att ha kontinuerligt flöde av media under experimenterande. En annan begränsning är dimensionering. Kanaler och andra funktioner som är mindre än 150 μm är under fräsens stängnings gräns (kompletterande figur 4). Vi rekommenderar att du arbetar med kanaler med en bredd i intervallet 200 – 900 μm. Dessa gränser är flexibla och tenderar att variera särskilt vid den övre tröskeln. Till exempel kommer kanaler med en höjd på 75 μm att kollapsa när bredden på kanalen är 950 μm eller mer, men förblir öppen om höjden ökar. Även om enhetens arkitektur varierar beroende på tillämpning, använder vi rutinmässigt kanaler med en höjd på 75 eller 125 μm och en bredd på 400 – 600 μm.
Uppmärksamhet på detaljer när du justerar lager och stötfångare är viktigt. De flesta av de få komplikationer som uppstår från PETL Fabrication är ett resultat av anpassningen frågor. Utsatt EVA vid tidpunkten för laminering kan följa de interna rullarna och göra dem oanvändbara. Vätske infusion kan blockeras av en illa positionerad stötfångare. Lyckligtvis, PETLs är inte bara billigt men är också snabbt byggda, därför felaktiga enheter kan enkelt bytas ut eller ändras.
PETLs tål infusionshastighet som liknar dem som används i andra mikrofluidiska enheter. Även om 0,01 till 100 μL/min är det intervall som används av vår grupp kan flödeshastigheter på upp till 500 μL/min (och kanske högre vid användning av handmanövrerade Mikropipetter) användas. Vi har funnit att PETLs kan motstå tryck i intervallet 30 till 57 PSI8. Sprutpumpar rekommenderas för de flesta experimentella inställningar, även om de inte är ett absolut krav. I klassrummet användes byretter för att testa elevens enheter15. Peristaltiska pumpar är användbara i vissa inställningar som cellkultur, särskilt eftersom gasutbyte är begränsat i PETLs. PDMS kan vara mer fördelaktigt i detta avseende, även om urlakning kan vara ett bekymmer5. Vi har försökt att producera hybrid PET/EVA-PDMS, men EVA kommer inte direkt att följa PDMS; Det är möjligt att ytmodifiering av den senare (t. ex. plasma behandling eller ytaktiva behandlingar) kan lösa detta problem. En annan metod som kan jämföras med petls är mikro bearbetning av kanaler med co2 laser ablation17,18 av PMMA. Vi har funnit att laserskärning är oförenligt med PET/EVA film, eftersom den värme som produceras tenderar att bota EVA och att producera ojämna kanal kanter. Användningen av adekvat laserutrustning kan också avsevärt öka tillverkningskostnaderna.
Sammanfattnings, PETLs erbjuder flera fördelar jämfört med nuvarande teknik: (i) kostnaderna är betydligt lägre än traditionella metoder på grund av användning av konsument-grade material och utrustning, vilket gör den lättillgänglig för både forskare och studenter. (II) enheter kan utformas, klippa och monteras inom några minuter, vilket möjliggör snabb prototyp iteration och underlättar tidseffektiva experiment. (III) flera enheter kan tillverkas samtidigt, vilket möjliggör hög genomströmning produktion. (IV) en mängd olika material kan införlivas, lägga mångsidighet och möjliggör omfattande anpassning. Nuvarande och framtida utveckling av nya funktioner med hjälp av denna teknik vilar på kreativitet och krav för nya användare. Brett antagande av petl mikroflödessystem enheter kommer sannolikt att resultera i införandet av nya material och konfigurationer, som användare utveckla nya mönster och metoder för deras särskilda behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Fernando Ontiveros är i färd med att lansera PETL FLUIDICS (LLC), ett företag som kommer att kommersialisera och tillhandahålla konsulttjänster för denna teknik. Medförfattarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet i detta manuskript stöddes delvis av National Science Foundation (NSF) (Grant No. CBET-1553826) (och tillhörande ROA tillägg) och National Institutes of Health (NIH) (Grant No. R35GM124935) till J.Z., och Notre Dame Melchor gästar fakultets fonden för att F.O. Vi vill tacka Jenna Sjoerdsma och basar Bilgiçer för att tillhandahålla däggdjursceller och kultur protokoll och Fabio Sacco för hjälp med kompletterande siffror.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and Applications of Microfluidics in Biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 4 (1), 261-286 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3 (1), 335-373 (2001).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224 (2012).
- Zhang, B., Korolj, A., Lai, B. F. L., Radisic, M.
- Bartholomeusz, D. A., Boutte, R. W., Andrade, J. D. Xurography: rapid prototyping of microstructures using a cutting plotter. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (6), 1364-1374 (2005).
- Martínez-Hernández, K. J., Rovira-Figueroa, N. D., Ontiveros, F. Implementation and Assessment of Student-Made Microfluidic Devices in the General Chemistry Laboratory. , (2016).
- Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111 (2019).
- Subramaniam, A., Sethuraman, S. Chapter 18 - Biomedical Applications of Nondegradable Polymers. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , 301-308 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Oya, K., et al. Surface Characteristics of Polyethylene Terephthalate (PET) Film Exposed to Active Oxygen Species Generated via Ultraviolet (UV) Lights Irradiation in High and Low Humidity Conditions. Journal of Photopolymer Science and Technology. 27 (3), 409-414 (2014).
- Narciso, C. E., Contento, N. M., Storey, T. J., Hoelzle, D. J., Zartman, J. J. Release of Applied Mechanical Loading Stimulates Intercellular Calcium Waves in Drosophila Wing Discs. Biophysical Journal. 113 (2), 491-501 (2017).
- Suh, Y. K., Kang, S. A Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Weibel, D., Whitesides, G.
- Chen, X., Li, T., Shen, J. CO2 Laser Ablation of Microchannel on PMMA Substrate for Effective Fabrication of Microfluidic Chips. International Polymer Processing. 31 (2), 233-238 (2016).
- Chen, X., Shen, J., Zhou, M. Rapid fabrication of a four-layer PMMA-based microfluidic chip using CO2-laser micromachining and thermal bonding. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (10), 107001 (2016).
