Summary
Her presenterer vi en protokoll for å designe og dikte tilpassede mikrovæskebasert enheter med minimal finansiell og tids investering. Målet er å tilrettelegge for innføringen av mikrovæskebasert teknologi i biomedisinsk forskningslaboratorier og utdanningsmiljøer.
Abstract
Mikrovæskebasert enheter tillater manipulering av væsker, partikler, celler, mikro-sized organer eller organismer i kanaler som spenner fra nano til submillimeter skalaer. En rask økning i bruken av denne teknologien i biologiske vitenskaper har bedt om et behov for metoder som er tilgjengelige for et bredt spekter av forskningsgrupper. Aktuelle fabrikasjon standarder, som PDMS bånd, forlange dyr og tid forbruker litografiske og bånd teknikker. Et levedyktig alternativ er bruk av utstyr og materialer som er lett rimelig, krever minimal kompetanse og gir mulighet for rask gjentakelse av design. I dette arbeidet beskriver vi en protokoll for design og produksjon av PET-laminat (PETLs), mikrovæskebasert enheter som er billig, lett å dikte, og forbruke betydelig mindre tid til å generere enn andre tilnærminger til materialer teknologi. De består av termisk limt film ark, der kanaler og andre funksjoner er definert ved hjelp av en Craft cutter. PETLs løse felt-spesifikke tekniske utfordringer samtidig dramatisk redusere hindringer for adopsjon. Denne tilnærmingen forenkler tilgjengeligheten av materialer enheter i både forskning og pedagogiske innstillinger, og gir en pålitelig plattform for nye metoder for forespørsel.
Introduction
Materialer muliggjør væske kontroll ved små skalaer, med volumer som spenner fra mikroliter (1 x 10-6 l) til picoliters (1 x 10-12 l). Denne kontrollen har blitt gjort mulig delvis på grunn av anvendelsen av microfabrication teknikker lånt fra mikroprosessor industrien1. Bruk av mikro-sized nettverk av kanaler og kamre gjør at brukeren kan dra nytte av den distinkte fysiske fenomener karakteristisk for små dimensjoner. For eksempel, på mikrometer skala, kan væsker manipuleres ved hjelp av laminær flyt, hvor tyktflytende krefter dominerer treghet krefter. Som et resultat, blir diffusive transport det fremtredende trekk ved materialer, og kan bli studert kvantitativt og eksperimentelt. Disse systemene kan forstås riktig ved hjelp av Fick ' s lover, Brownske bevegelses teori, varme ligningen, og/eller Navier-Stokes ligninger, som er viktige avledninger innen væske mekanikere og transport fenomener2.
Fordi mange grupper i de biologiske vitenskaper studien komplekse systemer på mikroskopisk nivå, var det opprinnelig antatt at mikrovæskebasert enheter ville ha en umiddelbar og betydelig innvirkning på forskningsprogrammer i biologi2,3. Dette skyldes Diffusjon er dominerende i transport av små molekyler på tvers av membraner eller i en celle, og dimensjonene av celler og mikroorganismer er en ideell match for sub-millimeter systemer og enheter. Derfor var det betydelig potensial for å øke måten mobilnettet og molekylær eksperimentering er gjennomført. Men bred adopsjon av mikrovæskebasert teknologier av biologer har ligget bak forventningene4. En enkel grunn til mangelen på teknologioverføring kan være disiplinære grenser skille ingeniører og biologer. Tilpasset enhets design og fabrikasjon har forblitt like utenfor evnene til de fleste biologiske forskningsgrupper, noe som gjør dem avhengige av ekstern ekspertise og fasiliteter. Mangel på fortrolighet med muligheter søknadene, bekostning, og klokken krevde for tegning-gjentakelse er likeledes betydelig barriere for ny adoptert. Det er sannsynlig at disse barrierene har hatt effekten av å forstyrre innovasjon og forebygge utbredt anvendelse av materialer for å løse utfordringene i de biologiske vitenskaper.
Et eksempel på dette: siden slutten av 1990-tallet Soft-Foto litografi har vært metoden for valg for fabrikasjon av mikrovæskebasert enheter. PDMS (Polydimethylsiloxan, en silikon-basert økologisk polymer) er en mye brukt materiale på grunn av dens fysiske egenskaper, som gjennomsiktighet, fleksibilitet, og biokompatibilitet5. Teknikken har hatt stor suksess, med Lab-on-a-chip og organ-on-a-chip enheter kontinuerlig utvikles på denne plattformen6. De fleste av gruppene som arbeider med disse teknologiene, men finnes i engineering avdelinger eller har sterke bånd til dem4. Litografi krever vanligvis Clean-rom for fabrikasjon av muggsopp og spesialisert bonding utstyr. For mange grupper, dette gjør standard PDMS enheter mindre enn ideelt på grunn av deres kapitalkostnader og ledetid, spesielt når det er behov for å gjøre gjentatte design modifikasjoner. Videre er teknologien for det meste utilgjengelige for den gjennomsnittlige biolog og studenter uten tilgang til spesialiserte tekniske laboratorier. Det har blitt foreslått at for mikrovæskebasert enheter å være allment vedtatt, må de etterligne noen av de kvaliteter av materialer som vanligvis brukes av biologer. For eksempel polystyren brukes for cellekultur og bioassays er billig, disponibel, og mottagelig for masseproduksjon. I kontrast, industriell produksjon av PDMS-baserte materialer har aldri vært realisert på grunn av sin mekaniske mykhet, overflatebehandling ustabilitet, og gass permeabilitet5. På grunn av disse begrensningene, og med mål om å løse tekniske utfordringer ved hjelp av tilpassede enheter bygget "in-House", beskriver vi en alternativ metode som utnytter xurography-7,8,9 protokoller og termisk laminering. Denne metoden kan vedtas med lite kapital og tid investering.
PETLs er fabrikkert ved hjelp av polyetylen polyetylentereftalat (PET) film, belagt med thermoadhesive etylen-vinyl acetate (EVA). Begge materialene er mye brukt i forbrukerprodukter, er biokompatible og er lett tilgjengelig på minimal kostnad10. PET/EVA film kan fås i form av laminering poser eller ruller. Ved hjelp av en datastyrt håndverket cutter vanligvis finnes i hobby eller håndverket butikker, er kanalene kuttet ut av en enkelt film ark for å definere enhetens arkitektur11. Kanalene blir deretter forseglet ved å bruke ekstra film (eller glass) lag som er limt ved hjelp av en (kontor) termisk lamineringsmaskinen (figur 1A). Perforert, selvklebende vinyl støtfangere er lagt til for å lette tilgangen til kanalene. Fabrikasjon timene omfang fra 5 å 15 min, hvilke innrømmer rask tegning gjentakelse. Alt utstyr og materialer som brukes til å lage PETLs er kommersielt tilgjengelig og rimelig (< 350 USD startkostnad, sammenlignet med tusenvis av USDs for litografi). Derfor PETLs gi en ny løsning på to hovedproblemer som utgjøres av konvensjonelle materialer: rimelig og tids effektivitet (se PDMS/PETL sammenligning i supplerende tabeller 1, 2).
I tillegg til å gi forskere muligheten til å designe og dikte opp sine egne enheter, kan PETLs enkelt vedtas i klasserommet fordi de er enkle og intuitive å bruke. PETLs kan inngå i videregående skole og høyskole læreplaner8, hvor de brukes til å hjelpe elevene bedre forstå fysiske, kjemiske og biologiske konsepter, som diffusjon, laminær flyt, mikromixing, nanopartikkel syntese, gradient dannelse og chemotaxis.
I dette arbeidet illustrerer vi den generelle arbeidsflyten for fabrikasjon av modellen PETLs chips med ulike nivåer av kompleksitet. Den første enheten brukes til å forenkle bildebehandling av celler og mikro-organer i et lite kammer. Den andre, mer komplekse enheten består av flere lag og materialer, og brukes til forskning i mechanobiology9. Endelig har vi bygget en enhet som viser flere Fluid dynamikk konsepter (hydrodynamisk fokus, laminær flyt, diffusive transport og mikromixing) for pedagogiske formål. Arbeidsflyten og enhets designene som presenteres her, kan enkelt skreddersys for et stort utvalg formål både i innstillingene for forskning og klasserom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utforming
- Identifiser en applikasjon for enhetene, og oppgi kanal/kammer-komponentene som skal være nødvendige.
Merk: alle enheter vil kreve inn-og ut-kanaler. Enheter som brukes til mikroskopi vil kreve et bilde kammer. Mer komplekse enheter vil kreve kanaler og kamre som ligger i flere lag. - Start med hånd-tegning hvert lag, med tanke på hvordan enhetens funksjonalitet påvirkes av superposisjon av lagene.
- Tegn de endelige utformingene på en datamaskin ved hjelp av programvare som gjør det mulig å tegne linjer og figurer.
- Tegn hvert lag separat ved hjelp av svarte, heltrukne linjer og former uten nyanser. Linjetykkelse på 6 eller flere punkt anbefales. På dette stadiet, dimensjonene på kanalen og kammer funksjoner er mindre viktig enn den samlede proporsjoner.
- Bruk kopier og lim inn-funksjonen når du oppretter funksjoner og superimposing lag. Se figur 1B for eksempler på lag tegninger.
- Importer hvert lag til Craft cutter programvare (figur 1C). Gjør dette ved å ta et skjermbilde av den tegnede designen og bruke en dra og slipp-tilnærming.
- Opprett et nytt dokument i håndverket cutter programvare (gratis nedlasting). Slipp bildefilen på matten som vises. Programvaren vil gjenkjenne de fleste bildefiler.
- Forstørr bildet for å forenkle behandlingen ved å trekke fra et hjørne. Utformingen kan nå gjenkjennes av programvaren ved hjelp av sporingsfunksjonen.
Merk: brukere kan produsere de Novo design direkte på denne programvaren (bruk tegneverktøy i design palett).
- Hvis du vil spore utformingen, velger du sporings ikonet (formen på en sommerfugl) på høyre side av vinduet og velger de importerte utformingene fullstendig.
- Velg alternativet Forhåndsvisning av spor merket disposisjon. Juster (om nødvendig) innstillingene for terskel og skalering for å justere den gule sporingen slik at den samsvarer med designen.
- Velg spor fra spor -menyen når den gule sporingen samsvarer med utformingen. Kanalene vises nå som en rød kontur. Hvis den røde konturen samsvarer med designen, kan det importerte bildet velges og slettes. Utformingen er nå importert og klar for skalering.
- Endre størrelse på enheten ved å velge den sporede utformingen og ved å bruke rutenettet som leveres av programvaren. Trekk for å endre bredden og lengden på kanaler og kamre.
Merk: programvaren gir målinger, og små linjer kan trekkes midlertidig (Bruk design paletten på venstre side av vinduet) for å måle dimensjonene i enheten. Funksjonell kanalbredde dimensjoner varierer fra 100 μm til 900 μm. dimensjonene må kanskje justeres etter testing av første prototyper. Det er viktig at alle lagene er i størrelse proporsjonalt, for å sikre riktig justering under montering.- Når utformingen er riktig størrelse, velger du det firkantede verktøyet på figur tegne menyen for å tegne et kvadrat/rektangel rundt hvert lag på enheten. Denne figuren må ha samme størrelse for alle lag. Se figur 1C for eksempler.
- Opprett et eget topplag som inneholder tilgangs porter til kanalene. Enkle design vil bestå av en hoved (midten) kanal lag, en bunn tetting lag (ofte glass) og et topplag som skal inneholde sirkulære perforering for å få tilgang til kanaler (viker/utsalgssteder).
Merk: design som inneholder mer enn tre lag vil kreve perforering av innløp/utløp i flere lag (se figur 1C, figur 5A). Disse hullene kan være allerede inkludert i utformingen, eller kan legges til på dette tidspunktet.- Velg tegneverktøyet på venstre side av skjermen. Tegn sirkler over innløpet og utløp portene på design.
- Kopier og lim inn både den opprinnelige designen og sirklene. Slett kanalene fra den underliggende enheten.
Merk: Dette etterlater inntaks-/utløps portene i riktig posisjon som tilsvarer den opprinnelige designen. Figurer kan også legges til periferien av hvert lag til hjelp med samkjøre.
- Ordne alle lagene som skal kuttes på den viste matten. Enheten er nå klar til kutting.
2. skjæring
- Påfør en enkelt PET/EVA film (eller annet materiale) av foretrukket tykkelse (3 mil er standard) på limet skjære matten. Sørg for at limet (matte) siden vender opp og at plasten (blanke) siden vender ned.
Merk: Bruk rene hansker for å unngå å innføre oljer og mikropartikler til lagene. - Flat filmen mot matten (figur 1D), fjerne all luft som kan ha vært fanget. Dette kan gjøres ved hjelp av hansker hender eller en valse.
- Juster kanten på skjære matten til den linjen som er angitt på kniven. Legg i matten ved å trykke på Legg matten på kniven. Hold innstillingen på skjærebladet mellom 3 og 5, avhengig av filmtykkelsen.
- Koble skjære-USB-kabelen til datamaskinen.
- Velg fanen Send og velg en skjære innstilling.
Merk: en rekke innstillinger er tilgjengelige på kaskade menyen. The-klistremerke papir, Clear-er en innstilling som fungerer godt med PET/EVA film som har en tykkelse på 3-5 mil (75 – 125 μm). Endre innstillinger for ulike materialer og lagre egendefinerte innstillinger for fremtidig bruk.
- Velg fanen Send og velg en skjære innstilling.
- Klikk på Send. Skjæring vil begynne (figur 1E). Pass på at det er nok plass på baksiden av kniven for å flytte uhindret. Når kniven er ferdig, fjerner du matten ved å velge losse på kniven. Ikke trekk matten ut før lossing.
3. justering
- Plasser skjære matten ved siden av en ren overflate. Med hansker hender kan du bruke en pinsett til å løfte hvert lag av den materialer enheten av skjære matten (figur 1F). Vær spesielt forsiktig rundt svinger og bøyer i kanalen; disse er spesielt delikat og mottakelig for rive og fordreining.
- Plasser lagene i den materialer enheten på en ren overflate. Rekkefølge dem i henhold til deres topp-til-bunn posisjon i enheten (figur 1G, figur 2a, figur 5a og figur 7a).
- Skjær små (~ 3 mm x 10 mm) stykker dobbeltsidig tape som skal brukes til å midlertidig feste lagene sammen.
- Sammenligne med lagene en etter en, og starter med det nederste laget. Legg til et lite stykke dobbeltsidig tape til et hjørne mellom lagene, vekk fra alle kanaler eller viker/utsalgssteder (figur 1G, pil). Tapen, men ikke nødvendig, immobilizes lagene og sikrer at de ikke vil skifte under laminering. Bruk en wire jig for å lette justeringen av lag i enheter med mer enn 4 lag (supplerende figur 3).
- Kontroller at limet (Matt-EVA) på siden av filmen alltid vender mot innsiden (i lag delen) av enheten.
FORSIKTIG: eksponert klebemiddel vil smelte mot de innvendige delene av lamineringsmaskinen og følge dem, noe som ikke bare resulterer i tap av enheten, men som også påvirker den fremtidige ytelsen til lamineringsmaskinen. - Når alle lag er lagt i, Inspiser enheten. Det bør være minst én EVA-side i mellom alle lag, og ingen EVA bør utsettes. Ved innføring av ikke-EVA belagt materiale (f. eks, polyvinylklorid (PVC) film, glass), en filmbelagt med EVA på begge sider kan være nødvendig, spesielt i tilfelle av mer komplekse enheter (figur 5).
4. laminering
- Slå på og sett lamineringsmaskinen til ønsket tykkelse. Noen laminatorer tilbyr 3 og 5 mil innstillinger, mens noen ikke. For alle enheter med 4 eller flere lag, bruk 5-mil innstillingen.
- Når lamineringsmaskinen er klar, Kjør enheten gjennom laminering rullene (figur 1H-i). Plasser enden som dobbeltsidig tape er lagt til for best resultat.
Merk: Når du fabrikere enheter med fem eller flere lag, kan de bli kjørt gjennom lamineringsmaskinen mer enn én gang. - Gjenopprette den laminerte enheten.
Merk: det anbefales at enheter er store nok til å gjøre det enkelt å gjenopprette dem fra lamineringsmaskinen. Denne vurderingen påvirker ikke størrelsen på kanaler eller chip arkitektur, det bare krever en "ramme" som lett kan gå gjennom lamineringsmaskinen uten å forbli inne.
5. innløp/utløp porter
- Bruk et roterende verktøy og en 1/32 i. Drill bit for å skjære et lite hull gjennom midten av en møbel støtfanger. Alternativt kan du bruke en 1 mm biopsi punch for å perforere støtfangere.
Merk: en drill trykk anbefales. Selv om størrelsene varierer, anbefales 2 mm x 6 mm-støtfangere. Unngå bare "knivstikking" støtfangeren. Med mindre materialet er fjernet, vil støtfangeren forsegle igjen (supplerende figur 1). Hullene som indikert ovenfor er ment å være et grensesnitt med Polyetheretherketone (PEEK), en pipette og tupp, eller en butt nål (16 – 18 G). Større perforering kan oppnås ved hjelp av roterende punch tang (supplerende figur 1). Disse er nyttige når støtfangeren brukes som et "reservoar" for væsker eller andre Biologicals. - Pass på at åpningen er helt klar ved å fjerne rusk (forårsaket av boring eller stansing) med et par små pinsett.
- Etter at innløps-/utløps portene er tømt, justerer du forsiktig støtfangeren med innløps-/utløps portene på den laminerte enheten (figur 1J – K). Dette trinnet er avgjørende for å ha riktig strøm av væsker inn og ut av enheten. Hold støtfangeren bak enheten, plasser det selvklebende ansiktet vendt mot det åpne innløpet/uttaket på enheten, og Juster og følg. Enhets samlingen er nå fullført.
6. testing
- Få tilgang til kanal-/kammer arkitekturer gjennom de perforerte støtfangere (portene). Det er flere alternativer om hvordan å innføre væsker og Biologicals inn i enhetene.
- Bruk laboratorie-eller medisinsk/kirurgisk rør ved å feste det til en plast kontakt (f.eks. luer-adaptere) eller til en butt nål. En standard pipette og tipp-eller PEEK-slange uten adaptere kan også brukes (supplerende figur 2).
- Utfør infusjon eller tegning av væsker med sprøyter og slanger med sprøyter eller peristaltisk pumper.
Merk: det er mange alternativer i markedet, som starter på ~ 300 USD i skrivende stund. - Angi ulike innstillinger for strømningshastighet i henhold til enheten, og eksperimenter.
Merk: vi bruker rutinemessig strømnings hastighetsinnstillinger i området 0,01 – 100 μL/min, men andre satser kan brukes.
Figur 1: fabrikasjon. (A) en Office-lamineringsmaskinen og en Craft cutter er de eneste to stykker av utstyr som kreves for fabrikasjon. Begge er tilgjengelige på nettet eller på håndverk/kontorrekvisita butikker. Andre nødvendige verktøy inkluderer saks og pinsett. (B) kanal og kammer arkitekturer kan være sammensatt digitalt ved hjelp av en hvilken som helst programvare som inkluderer tegneverktøy (vektorgrafikk kan foretrekkes av noen brukere, men er ikke nødvendig). Linjer og figurer tegnes i svart med en hvit bakgrunn. Filen eller et skjermbilde av designen kan importeres til håndverket cutter programvare ved å dra og slippe. (C) Craft cutter programvare er tilgjengelig gratis å laste ned og er nødvendig for å kontrollere kniven. Programvaren kjøper design og gir mulighet for modifikasjoner, som dimensjonering. Det gir også tegneverktøy. (D) skjære matten bærer filmen for kutting. Det er litt lim, slik at for immobilisering av materialene som skal kuttes. Figuren viser fire forskjellige materialer klar for lasting: 3 mil-tykk PET/EVA film (topp), 5 mil-tykk PET/EVA film (midten), 6 mil-tykk EVA/PET/EVA (nederst til venstre) og PVC film (nederst til høyre). (E) cutter er åpen for å vise blad (i svart) enhet og lastet matte. (F) etter klipping løftes individuelle lag ved hjelp av pinsett. Cut outs av kanaler og kamre forblir festet til matten og blir senere fjernet og forkastet. (G) individuelle lag er justert og lagt for laminering. Små biter av dobbeltsidig tape (pil) er ofte brukt til å hjelpe til med å samkjøre og hindre lag skiftende under laminering. (H, I) Enheten mates på toppen av lamineringsmaskinen og utvinnes gjennom sporet. Laminering gir en robust forsegling, slik at kanalen stier åpne. (J, K) For å få tilgang til kanalene, er det nødvendig å legge til perforert, selvklebende vinyl støtfangere. Bilde i (J) viser "reverse" tilnærming for justering, der støtfangeren er plassert fra baksiden, slik at visuell justering av innløpet/utløp med støtfanger perforering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I tillegg til lave kostnader og raske gjentakelser, kan PETL-teknologi enkelt tilpasses for å løse spesifikke utfordringer. Først beskriver vi en enkel enhet bestående av et glass dekkglass, et kammer lag, et kanal lag, og et innløp/utløp lag (figur 2). Denne enheten ble utformet for å lette Imaging av celler og mikro-organer under konstant flyt. Kultur medium etterfylles ved lave strømningsrater for å oppmuntre til nærings-og gassutveksling. Den runde kammer har en glassbunn, som gjør det mulig for bildebehandling ved hjelp av en invertert mikroskop. Det er minst to grunner til bruk av glass i denne enheten. Den første er optikk. PET og EVA er termoplast anvendt for deres optisk gjennomsiktighet og fleksibiliteten, og kan brukes idet en grenseflate for tenkelig (spesielt for lav forstørrelser9. Lett Transmisjon av PET i det synlige spekteret varierer fra 87 til 90%12. Glass har imidlertid bedre optiske egenskaper og er standarden som brukes i biologisk bildebehandling. Den andre grunnen til å bruke glass er at cellene så langt testet (pattedyr cellelinjer), har en tendens til å feste lettere til det enn å (ubehandlet) PET/EVA.
Figur 2: enkelt kammer for invertert mikroskopi. (A) enheten består av ett glass lag og tre pet/Eva lag (3 mil tykk). Et glass dekkglass (24 mm x 60 mm) er det nederste laget. Det neste laget har bunnen av bilde kammeret. Det neste laget har den øverste halvdelen av kammeret og kobler den til i/utløp kanal. Dermed er høyden på kanalen bare 75 μm, mens høyden på kammeret er 150 μm. Bredden på kanalen bestemmes av brukeren (500 μm vises her). Det øverste laget forsegler kammeret/kanalen banen og gir tilgang til innløpet/utsalgssteder. De lagt lag vises til høyre. (B) den ferdige enheten vises tilført med rødt fargestoff for visualisering. Lasting kan oppnås ved hjelp av en micropipette og tips, laboratorium eller medisinsk/kirurgisk rør utstyrt med en stump nål, eller PEEK slange, som vist. (C) kanal/kammer design kan bli iterated i en enkelt enhet (f. eks, for å lette observasjon av flere individuelle eksemplarer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Dimensjonene av kanaler og kammer i denne enheten er verdt å beskrive. Høyde i PETLs er alltid en funksjon av film eller lag tykkelse. Kommersielt tilgjengelig PET/EVA har en tykkelse målt i tusen deler av en tomme (1 mil ≈ 25 μm). Derfor er kanal og kammer høyder vanligvis multiplum av 25 μm. standard PETLs er bygget med 3 eller 5 mil PET/EVA film, som resulterer i funksjoner som har en høyde på 75 eller 125 μm. Enheten som vises i figur 2 har kanaler med en høyde på 75 μm, og et kammer definert av to lag, med en total høyde på 150 μm. Det bør bemerkes, men at lagene kan være sammensatt av forskjellige materialer (f. eks, glass, folie, PVC, papir) og kan presentere varierende tykkelse, vanligvis spenner fra 25 til 250 μm.
Figur 3: celle avbildning. (A) det enkle kammeret PETL kan brukes for kortsiktig kultur av tilhenger celler. Celler holder seg til glasset eksponert i kammeret og kan observeres ved hjelp av en invertert mikroskop. (B) Rat basofile ble farget med Hoechst (blå) og plasma membran (rød) fluorescerende fargestoffer for visualisering på en invertert konfokalmikroskopi mikroskop. (C) Bright felt bilde av celler i en enkel kammer enhet. (D) fase kontrast bilde. Hvit skala bar er 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Arten av PETL fabrikasjon innrømmer for betydelig innviklet beskaffenhet inne Fluid sti tegning. Den enkle kammer enheten består av fire lag som inneholder funksjoner i to nivåer av z-aksen (kanal og toppen av kammeret i ett nivå, nederst i kammeret i andre nivå). En fordel som tilbys av PETLs er den enkle som 3-dimensjonal kanal/kammer arkitekturer kan bygges. Tillegg av funksjoner som kjøling eller varme kanaler, dialyse membraner, elektriske kretser eller trykk linjer (se figur 5) oppnås ved å koble flere lag i tre dimensjoner. En påminnelse så langt oppstått er grensen på antall lag som kan være laminert. Varmeoverføring som er nødvendig for EVA-håndplukking, er ikke funnet tilstrekkelig i enheter med en total tykkelse over 800 μm. Denne begrensningen kan løses på enkelte enheter. I mange tilfeller er det mulig å laminat hver gang et nytt lag er lagt til. Dette er ikke mulig når et nytt lag krever at thermoadhesive (EVA) skal møte utsiden av enheten.
Figur 4: bilde av mikro-orgel. (A) den enkle kammer PETL brukes til bilde en vinge plate av embryo Drosophila melanogaster (2x forstørrelse). Vingen platen dimensjonene er ca 90 μm x 250 μm x 500 μm. Ett eller flere organer kan bli avbildet gjennom dekkglass vinduet. Økt forstørrelser av en annen vinge plate er vist i (B) 20x/0,75-Air, (C) 40x/1.30-olje, og (D) 100%/1.49-olje mål ved hjelp av en spinnende plate konfokalmikroskopi mikroskopi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Studiet av celler i kulturen drar nytte av verktøy som gir dynamiske statlige forhold som konstant flyt eller mekaniske stimuli. Figur 3 gir et eksempel der en pattedyr cellelinje er kultivert og avbildet i en enkel kammer enhet. Medium kan stadig utveksles under bildebehandling, slik at ikke bare for å opprettholde ideelle vekstforhold, men også for kontrollert innføring av kjemiske stimuli mens Imaging i sanntid. Dette gjelder også for Imaging av ex-vivo mikro-organer, som vist i Figur 4. Kanal og kammer strukturer kan utformes med bestemte dimensjoner for å passe ulike biologiske prøver, fra organer eller vev til hele organismer (f. eks Drosophila embryo og imaginal plater eller C. elegans).
Figur 5: Mechano-PETL. Den enkle kammer PETL er modifisert ved å legge en kompresjons kammer. (A) enheten består av syv lag med fire forskjellige materialer: et glassbunn lag (dekkglass, ikke vist), fire pet/Eva 3 mil lag (kanal/kammer lag, spacer lag og innløp/utløp lag), en Eva/pet/Eva 6 mil lag (kanal/kammer tetting og PVC vedheft) og en deformerbare PVC lag (for komprimering). (B, C) Prøven kanal/kammer banen er visualisere ved hjelp av rød farge. Kompresjons kanalen/kammer banen inneholder bare luft. (D) lufttrykket er manuelt (eller mekanisk) påføres kompresjons banen, noe som resulterer i utvidelsen av PVC-filmen på toppen av kammeret. Utvidelsen fortrenger fargestoffet i kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mekaniske forstyrrelsene av biologiske prøver forbedrer vår forståelse av cellulære fysiologi og kaster lys over prosesser som embryoutvikling og differensiering. Figur 5 beskriver en PETL-enhet bestående av en enkel kanal/kammer array og et kompresjons kammer. Den består (i sin enkleste form) av seks lag, hvorav den ene er en PVC-film. PVC-filmen deflects når lufttrykket påføres, forårsaker det å komprimere eksemplarer i kammeret. Denne enheten er et eksempel på bruk av materialer enn PET/EVA, og det har blitt ansatt9 i å erstatte PDMS/glass enheter benyttet for å studere mekanisk belastning på Drosophila mikro-organer13 (som vist på figur 6). PETL-enheter kan gjenbrukes. Men på grunn av den lave kostnaden for fabrikasjon, redusert fotavtrykk, og potensialet for delaminering etter kontinuerlig manipulasjon eller vasking, anbefaler vi bruk av nye enheter i starten av hver prosedyre.
Figur 6: Mechanobiology avbildning. (A) A de-cadherin:: GFP uttrykker Drosophila Wing platen er avbildet i en mechano-PETL ved hjelp av en spinnende plate konfokalmikroskopi mikroskop på 20x forstørrelse. (B) Trykk gjennom membranen over kammeret kan påføres ved å actuating en luft-fylte sprøyte manuelt eller ved hjelp av en sprøyte pumpe. Den ideelle gass loven brukes til å anslå hvor mye kraft som brukes på membranen9. Disc posen området (hvit stiplet linje) økte med ca 30% (rød stiplet linje) med anvendelse av ~ 4 PSI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
På grunn av den enkle fabrikasjon av PETL enheter, har vi utforsket deres bruk i pedagogiske innstillinger som kjemi, biologi og engineering klasserom og undervisningslaboratorier. Et eksempel på en pedagogisk PETL er vist i figur 7. Enheten er utformet for å vise noen av de grunnleggende funksjonene i væskestrømmen på mikro skala (f. eks, laminær flow). Den består av fire lag av 5 mil PET/EVA film (skikkelsen 7A) og en kanalen arkitekturen det inkluderer tre sammenfallende input kanalene og en Serpentine struktur. Sirkulære "depresjoner" eller "down" trinn har blitt lagt til banen for å fremme mikromixing14. Ved hjelp av en sprøyte pumpe, er fenol rød løsning tilført de ytre portene mens pH 9-løsning er tilført gjennom sentrum porten. Hydrodynamisk fokusering15 er bilde av med den ytre Fluid Flow tvinge den indre strømme inn i en mindre strøm (figur 7C). Laminær flyt i enheten hindrer konvektive miksing, og gradvis diffusive miksing vises langs lengden av kanalen (piler). Enheter som den som er vist kan brukes til å undervise konsepter (for eksempel diffusjon, laminær flow) i Fluid dynamikk og biotransport. Alternativt kan elevene bli invitert til å designe og dikte sine egne enheter, et prosjekt som kan foretas i en vanlig laboratorie sesjon som varer i to til tre timer8.
Figur 7: PETLs i klasserommet. (A) enheten er fabrikkert ved hjelp av fire lag med 5 mil pet/Eva film. Det andre laget (fra høyre til venstre) har sirkulære kamre som vil bli plassert under kanal banen. (B) den ferdige enheten er lastet med pH-indikatoren fenol rød (2 mm, gul) og en gjennomsiktig pH 9-løsning (senterkanal). Fenol rød svinger magenta når den er i kontakt med grunnleggende løsninger. Boksene viser områder som er vist i (C) gjennom (F). (C) hydrodynamisk fokusering. (D, E) laminær Flow og diffusjon. (E, F) mikromixing. Hvit skala bar er 2 mm i alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: støtfanger/babord perforering. (A) et bore trykk oppsett som holder et roterende verktøy muliggjør støtfanger perforering. Bor biter av størrelser 1/32 "og 3/64" brukes. (B) prosessen er effektiv, og et stort antall støtfangere kan behandles på kort tid. (C) biopsi punch perforering er et alternativ til boring. (D) en roterende punch-plier brukes til større perforering. Disse hullene kan brukes til å laste store prøver (ved væske uttak i stedet for infusjon) eller som medie reservoarer. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2: slange. (A) laboratorium eller medisinsk/kirurgisk rør (1/32 "ID, 3/32" OD) er det enklere alternativet. Det er fleksibelt og lett å skjære. Det krever bruk av (18 G) stumpe nåler. (B) en av nålene er festet til sprøyten ved hjelp av (rosa) luer-adapteren, som er fjernet fra en andre nål slik at den kan monteres på slangen. (C) forskere allerede kjent med Peek slange (0,010 "ID, 1/32" OD) kan bruke den med PETLs. (D) Peek beslag. (E) sprøyte pumpen satt opp er den samme for begge typer rør. (F) laboratorium eller medisinsk/kirurgisk slange satt opp vil kreve perforering med en 3/64 "Drill bit, mens Peek slangen vil trenge 1/32" perforering. Perforering laget med 1 mm biopsi punch kan romme begge sett med slange. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 3: justering ved hjelp av en wire jig. Utformingen av enheten kan inneholde perforering som kan fungere som hjelpelinjer for justeringen av flere lag. Wire jigs er kommersielt tilgjengelig for rundt 20 USD. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 4: størrelsesbegrensninger. Selv om håndverket cutters er i stand til å kutte rett kanaler som er ~ 100 μm i bredde (A), nøyaktigheten av kuttet mønstrene er sterkt redusert for funksjoner som måler 150 μm eller mindre (B). Dimensjonene ved siden av figurene angir kanalbredde. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende tabell 1: tid og kostnad for fabrikasjon av mikrovæskebasert chip i PDMS. * Produksjon tid når wafer/mold er lett tilgjengelig og PDMS kan kureres med en ovn. Eventuelle endringer i utformingen representerer en forsinkelse på flere dager. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggs tabell 2: tid og kostnad for fabrikasjon av PETL mikrovæskebasert chip. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens materialer er stadig til stede i verktøykassen av laboratorier rundt om i verden, har tempoet i vedtaket vært skuffende, gitt potensialet for sin positive innvirkning16. Lave kostnader og høy effektivitet av mikrovæskebasert enhet fabrikasjon er avgjørende for å akselerere innføringen av denne teknologien i gjennomsnittlig forskningslaboratorium. Metoden beskrevet her bruker flere film lag for å lage to og tredimensjonale enheter til en brøkdel av tiden og kostnadene som kreves av litografiske metoder. Standard litografi koster tusenvis av dollar (USD) for å starte opp, og krever dager å dikte opp, PETL fabrikasjon oppstart kostnaden er mindre enn 350 USD og enheter kan være fabrikkert i minutter. Dette forenkler deres adopsjon ikke bare i forskningslaboratoriet, men også i miljøer der rask gjentakelse er fordelaktig (f. eks, prototyping for standard PDMS enheter), eller hvor industriell produksjon av billig, disponibel enheter er nødvendig. For eksempel kan PETLs være fabrikkert ved hjelp av biologisk nedbrytbart materiale, og kan tilpasses for deres bruk i helsevesenet feltet, noe som gjør dem ideelle som diagnostikkverktøy. De kan brukes i klasserommet, enten som pre-fabrikkert læremateriell eller som en kreativ utfordring, der elevene designe, dikte og teste sine egne enheter.
PETL fabrikasjon er mente å bli ukomplisert. Det er imidlertid nyttig å identifisere kritiske trinn og nåværende begrensninger av denne teknikken. Noen brukere vil finne at gassutveksling i PETL enheter er redusert i forhold til PDMS enheter, som er kompensert for ved å ha kontinuerlig strøm av Media under eksperimentering. En annen begrensning er størrelsen. Kanaler og andre funksjoner mindre enn 150 μm er under oppløsnings grensen til kniven (supplerende figur 4). Vi anbefaler å arbeide med kanaler med en bredde i størrelsesorden 200 – 900 μm. Disse grensene er fleksible, og har en tendens til å variere spesielt på den øvre terskelen. For eksempel vil kanaler med en høyde på 75 μm kollapse når bredden på kanalen er 950 μm eller mer, men forbli åpen hvis høyden øker. Selv om enhetens arkitektur vil variere i henhold til programmet, bruker vi rutinemessig kanaler med en høyde på 75 eller 125 μm, og en bredde på 400 – 600 μm.
Oppmerksomhet på detaljer når samkjøre lag og støtfangere er viktig. De fleste av de få komplikasjoner som oppstår fra PETL fabrikasjon er et resultat av innretting problemer. Eksponert EVA på tidspunktet for laminering kan følge den interne valser og gjøre dem ubrukelig. Væsketilførsel kan blokkeres av en dårlig plassert støtfanger. Heldigvis PETLs er ikke bare billig, men er også raskt bygget, derfor defekte enheter kan enkelt byttes ut eller endres.
PETLs kan tåle infusjons strømningshastigheter som ligner de som brukes i andre mikrovæskebasert enheter. Selv om 0,01 til 100 μL/min er rekkevidden som brukes av vår gruppe, kan strømningshastigheter på opptil 500 μL/min (og kanskje høyere ved bruk av hånd drevne Mikropipetter) brukes. Vi har funnet ut at PETLs tåler trykk i størrelsesområdet 30 til 57 PSI8. Sprøyte pumper anbefales for de fleste eksperimentelle innstillinger, selv om de ikke er et absolutt krav. I klasserommet ble byretter brukt til å teste elevenes enheter15. Peristaltisk pumper er nyttige i visse innstillinger som cellekultur, spesielt siden gassutveksling er begrenset i PETLs. PDMS kan være mer fordelaktig i denne forbindelse, selv om utvasking kan være en bekymring5. Vi har forsøkt å produsere hybrid PET/EVA-PDMS, men EVA vil ikke direkte følge PDMS; Det er mulig at overflate modifikasjon av sistnevnte (for eksempel plasma behandling eller overflateaktive middel behandlinger) kan løse dette problemet. En annen tilnærming som kan sammenlignes med PETLs er mikro maskinering av kanaler som bruker co2 laser ablasjon17,18 av PMMA. Vi har funnet at laserskjæring er uforenlig med PET/EVA film, siden varmen produseres tendens til å kurere EVA og å produsere ujevne kanal kanter. Bruk av tilstrekkelig laser utstyr kan også øke produksjonskostnadene betraktelig.
Oppsummert, PETLs tilbyr flere fordeler fremfor dagens teknologier: (i) kostnader er betydelig lavere enn tradisjonelle metoder på grunn av bruk av forbruker-grade materialer og utstyr, noe som gjør det lett tilgjengelig for både forskere og studenter. (II) enheter kan utformes, kuttes og monteres i løpet av minutter, noe som gir rask prototype i prototypen og forenkler tidseffektiv eksperimentering. (III) flere enheter kan være fabrikkert samtidig, noe som åpner for høy gjennomstrømming produksjon. (IV) en rekke materialer kan innlemmes, og tilfører allsidighet og muliggjør omfattende tilpasning. Nåværende og fremtidig utvikling av nye funksjoner ved hjelp av denne teknologien hviler på kreativitet og krav til nye brukere. Bred adopsjon av PETL mikrovæskebasert enheter vil trolig føre til inkludering av nye materialer og konfigurasjoner, som brukerne utvikler romanen design og tilnærminger for deres spesielle behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Fernando Ontiveros er i ferd med å lansere PETL FLUIDER (LLC), et selskap som vil kommersialisere og gi rådgivningstjenester for denne teknologien. Co-forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet i dette manuskriptet ble støttet delvis av National Science Foundation (NSF) (Grant no. CBET-1553826) (og tilhørende ROA supplement) og National Institutes of Health (NIH) (Grant no. R35GM124935) til J.Z., og Notre Dame Melchor Visiting fakultet fondet til F.O. Vi vil gjerne takke Jenna Sjoerdsma og basar Bilgiçer for å gi pattedyrceller og kultur protokoller og Fabio Sacco for å få hjelp med supplerende tall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and Applications of Microfluidics in Biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 4 (1), 261-286 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3 (1), 335-373 (2001).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224 (2012).
- Zhang, B., Korolj, A., Lai, B. F. L., Radisic, M.
- Bartholomeusz, D. A., Boutte, R. W., Andrade, J. D. Xurography: rapid prototyping of microstructures using a cutting plotter. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (6), 1364-1374 (2005).
- Martínez-Hernández, K. J., Rovira-Figueroa, N. D., Ontiveros, F. Implementation and Assessment of Student-Made Microfluidic Devices in the General Chemistry Laboratory. , (2016).
- Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111 (2019).
- Subramaniam, A., Sethuraman, S. Chapter 18 - Biomedical Applications of Nondegradable Polymers. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , 301-308 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Oya, K., et al. Surface Characteristics of Polyethylene Terephthalate (PET) Film Exposed to Active Oxygen Species Generated via Ultraviolet (UV) Lights Irradiation in High and Low Humidity Conditions. Journal of Photopolymer Science and Technology. 27 (3), 409-414 (2014).
- Narciso, C. E., Contento, N. M., Storey, T. J., Hoelzle, D. J., Zartman, J. J. Release of Applied Mechanical Loading Stimulates Intercellular Calcium Waves in Drosophila Wing Discs. Biophysical Journal. 113 (2), 491-501 (2017).
- Suh, Y. K., Kang, S. A Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Weibel, D., Whitesides, G.
- Chen, X., Li, T., Shen, J. CO2 Laser Ablation of Microchannel on PMMA Substrate for Effective Fabrication of Microfluidic Chips. International Polymer Processing. 31 (2), 233-238 (2016).
- Chen, X., Shen, J., Zhou, M. Rapid fabrication of a four-layer PMMA-based microfluidic chip using CO2-laser micromachining and thermal bonding. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (10), 107001 (2016).
