Name: Ensaio para Pathogen-Associated Padrão Molecular (PAMP) Triggered-Imunidade (PTI) em Plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de morte celular para avaliar imunidade desencadeada por PAMP em Nicotiana benthamiana. Este método permite investigar genes envolvidos na resposta de PTI em plantas.

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Agradecemos a Hye Sook-Oh, Joanne Morello e Alan Collmer, Departamento de Fitopatologia e Biologia Vegetal-Microbe, Cornell University, pelas valiosas discussões. Agradecemos a Jesse Munkvold para comentários sobre o artigo. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation Programa Genoma Plant, número prêmio DBI-0605059 (GBM).

Parte 1: O crescimento das plantas e manutenção Nicotiana benthamiana plantas utilizada no ensaio deve ser de cerca de 7 semanas de idade. Eles devem ser aparadas pelo menos 4-5 dias antes do ensaio para remover todos os ramos axilares e flores. É uma boa idéia para remover ramos axilares logo depois que eles surgem de forma a tornar as plantas mais facilmente gerenciáveis. Parte 2: cultura bacteriana DIA 1: <ol><li> Placas ou culturas de todas as estirpes utilizadas no ensaio são iniciadas ao mesmo tempo. Para a Pseudomonas spp. que incluem dois indutores e 3 cepas desafio, bactérias raia em placas KBM contendo os antibióticos adequados de estoques congelados glicerol (Tabela 2). Uma pequena quantidade de bactérias deve ser espalhado no centro do prato. Incubar as placas a 30 ° C por cerca de 18-24 horas. Para Agrobacterium, iniciar uma cultura líquida em duas LB ml de uma placa nova e crescer durante a noite a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> 2 º DIA: <ol start="2"><li> Por Pseudomonas, adicione 150-200 mL de KBM líquido para as bactérias e espalhe-os sobre a placa inteira usando um espalhador de vidro estéril. Coloque o prato de volta na incubadora e deixá-lo crescer por mais 20-24 horas. Deve haver um gramado bacteriana na placa no dia seguinte, indicando um bom crescimento. Para Agrobacterium, iniciar uma cultura secundária em cerca de 50-10 ml LB com 20 mM acetosyringone e deixá-lo crescer durante a noite para 20 horas a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> Parte 3: Estações Preparação para o ensaio 2 º DIA: <ol><li> Um dia antes do ensaio as plantas devem ser movido para um quarto em 22-24 ° C, luz ~ 35-40% de umidade relativa e constante. </li><li> Mark círculos em folhas que são pelo menos 1,5 cm de diâmetro com um marcador preto grosso. Dois a quatro círculos podem ser marcados por folha. Os círculos devem ser bem espaçadas e de preferência não atravessar uma grande veia. Escolha bem-expandida folhas. Evitar que as folhas velhas ou folhas que são difíceis ou grossa ao toque e evitar a marcação círculos nas partes inferior da folha. </li></ol> Círculos marcando um dia antes do experimento não é essencial para o protocolo. No entanto, ele economiza tempo se houver um grande número de plantas que estão sendo analisadas, e faz com que seja mais fácil de conseguir o sincronismo preciso entre a indução da PTI e inoculações desafio. Parte 4: Indução da PTI DIA 3: <ol><li> Colher as células a partir da placa em 10 mM MgCl 2 para P. fluorescens e P. putida. Para Agrobacterium, centrifugar a cultura para coletar células e ressuspender em 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Repetir a centrifugação e ressuspender em solução de 2-MES MgCl. Medir a densidade óptica (DO) das células a 600 nm. Ajustar o ODS para os valores finais necessários conforme descrito na Tabela 2. Pseudomonas deve ser finalmente ressuspenso em 10 mM MgCl 2 e Agrobacterium na MgCl 2-MES solução. Um volume total de 25 ml é suficiente para inocular cerca de 40-50 pontos. </li><li> Infiltrar no PTI indutores para os círculos pré-marcadas nas folhas utilizando uma seringa de 1 ml sem agulha. Anote a ordem em que as plantas foram infiltradas eo tempo exato em que a infiltração foi iniciada. </li></ol> Parte 5: inoculação Desafio <ol><li> Prepare P. syringae pv tomate. DC3000, Pst DC3000 Δ hopQ1-1 e Ps pv. tabaci para o desafio, tal como descrito na parte 4.1 e Tabela 2. </li><li> Sete horas após a infiltração indutor, executar a infiltração desafio na mesma ordem de plantas como a indução foi feito. Geralmente, um ponto na periferia do círculo primeira inoculação pode ser usado como o centro do círculo segunda inoculação. Se há pontos múltiplos em uma folha, em seguida, certifique-se as infiltrações não se sobrepõem. </li><li> Diluições placa de série de todas as culturas utilizadas no ensaio de KBM ou LB placas contendo os antibióticos apropriados para determinar o número exato UFC. </li></ol> Parte 6: A pontuação para repartição do PTI Dia 5: <ol><li> Olhe para o surgimento de morte celular por ETI os pontos que foram desafiados com Pst DC3000. Morte celular dentro da área de sobreposição de infiltração indica uma repartição dos PTI e deve ser marcado como um fenótipo positivo. </li></ol> Dia 7: <ol start="2"><li> Olhe para o surgimento de morte celular devido à doença nos locais que foram desafiados com Pst DC3000 Δ hopQ1-1 ou pv Ps. Tabaci </em&gt;. Pontuação para um fenótipo positivo da mesma maneira como descrito na parte 6.1. </li></ol> Quando as plantas controle (que não deve ser comprometida por PTI) começam a mostrar a morte celular na área de sobreposição de infiltração, parar de fazer quaisquer observações adicionais. Parte 7: resultados Representante A Figura 1 mostra o resultado de um ensaio quando P. fluorescens foi usado como indutor e DC3000 Pst como o desafio. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. P. fluorescens foi infiltrada em N. benthamiana folhas (círculo preto) para induzir a PTI e 7 horas depois, o local foi desafiado com Pst DC3000 (círculo branco). Plantas silenciadas para FLS2 mostrou um colapso da PTI na região onde P. fluorescens foi infiltrada (A), como visto por morte celular. Plantas controle que não foram silenciadas não mostrou a morte celular na área de sobreposição devido à indução da PTI (B). Setas vermelhas indicam ausência ou presença de morte celular na área de sobreposição de infiltração. Fotografias foram tiradas dois dias após a infiltrações. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <table border="1"><tbody><tr><td> Indutor PTI </td><td> Morte celular provocando desafio </td><td> Natureza da morte celular </td><td> Código </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv tomato (Pst). DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> Pf / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETI </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 </td><td> Doença </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> Doença </td><td> Agro / ptab </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Combinações de PTI induzir e morte celular provocando micróbios usados ​​no ensaio para a morte celular PTI. <table border="1"><tbody><tr><td> Estirpe bacteriana </td><td> Meio de seleção </td><td> Finais OD usado em experimento </td><td> CFU correspondente / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM Ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM Ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0,02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 de diluição de 0,1 vezes </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 de diluição de 0,1 vezes </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Condições de cultura e níveis de inóculo utilizado no ensaio. O OD e níveis correspondentes UFC pode variar entre diferentes marcas de espectrofotômetros.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

A célula de ensaio de morte podem ser usadas para determinar o envolvimento de um gene no PTI. Por exemplo, perda de função mutantes para um gene de interesse pode ser testado com este ensaio. Das 4 combinações de indutor e inoculações desafio dada na Tabela 1, é possível que apenas uma combinação pode resultar em um fenótipo em seu fundo de plantas. Temos observado que as plantas silenciadas para FLS2 mostrar uma avaria do PTI na Pf / DC e Pf/Q1-1 combinações de indutor e inoculações desafio (Tabela 1). É essencial que as condições ambientais para o ensaio são o mais próximo possível às descritas na parte 3.1. A baixa umidade provoca a morte celular para continuar rápido demais, tornando o ensaio difícil de marcar. Se as condições descritas no nosso protocolo não funcionam em seu laboratório, em seguida, tentar alterar o nível de indutor ou inoculação desafio. Outro parâmetro que pode ser modificado é o intervalo de tempo entre indução e desafio, embora tenhamos encontrado que as lacunas de tempo mais curto fez com que o ensaio de quebrar muito rapidamente em plantas controle. Recomendamos que, pelo menos, 4-5 plantas ser testado em um experimento e um fenótipo positivo deve ser repetido em pelo menos 3-4 experimentos independentes.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Preparar como solução estoque 1 M, ajustar o pH e esterilizar por filtração. Armazenar à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV/Vis para Ciências da Vida</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio para pathogen-associated padrão molecular (pamp) triggered-imunidade (pti) em plantas

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Para perceber patógenos potenciais em seu ambiente, as plantas usam receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) presentes nas membranas seu plasma. PRRs reconhecer recursos microbianos conservada chamado patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs) e isso leva à detecção de PAMP disparado imunidade (PTI), o que efetivamente previne a colonização de tecidos vegetais por patógenos não 1,2. O sistema mais bem estudado no PTI é a via de três FLS2-dependente. FLS2 reconhece a flg22 PAMP que é um componente dos flagelos bacterianos. Patógenos de sucesso possuem fatores de virulência ou efetores que pode suprimir PTI e permitir que o patógeno para causar a doença 1. Algumas plantas, por sua vez possuem genes de resistência que detectam efetores ou sua atividade, o que leva a efetoras disparado imunidade (ETI) 2. Descrevemos uma célula de ensaio da morte-based para PTI modificado a partir Ah, e Collmer 4. O ensaio foi padronizado em N. benthamiana, que está sendo usado cada vez mais como um sistema modelo para o estudo da planta-patógeno interações 5. PTI é induzida pela infiltração de uma cepa não-patogênica bacteriana em folhas. Sete horas depois, uma cepa bacteriana que causa a doença tanto ou que ativa ETI é infiltrado em uma área de sobreposição da zona de infiltração original. PTI induzida pela infiltração primeiro é capaz de retardar ou prevenir o aparecimento de morte celular, devido à infiltração segundo desafio. Por outro lado, a aparência de morte celular na área de sobreposição de inoculação indica uma repartição dos PTI. Quatro combinações diferentes de indutores do PTI e inoculações desafio foram padronizados (Tabela 1). O ensaio foi testado em não-silenciadas N. benthamiana plantas que serviram como controle e plantas silenciadas para FLS2 que estava previsto para ser comprometida em sua capacidade de desenvolver PTI.

Uma célula de ensaio de morte com base em plantas para PTI Nicotiana benthamiana é descrito.

Ensaio para Pathogen-Associated Padrão Molecular (PAMP) Triggered-Imunidade (PTI) em Plantas

Para perceber patógenos potenciais em seu ambiente, as plantas utilizam receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) presentes em suas membranas plasmáticas. Os PRRs reconhecem...

Olá, sou Suma TI do laboratório de Greg Martin no Instituto de Pesquisa em Plantas Voice Thompson. Hoje vamos mostrar um procedimento para um ensaio baseado em morte celular para imunidade desencadeada por PAM, ou PTI. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para investigar o envolvimento de um gene na PTI.Então vamos começar. Inicie o procedimento cultivando Nicotiana ANA até que tenham cerca de sete semanas de idade. Quatro a cinco dias antes de iniciar.O ensaio de imunidade induzida por PAM ou PTI. Poda as plantas para remover todos os ramos axilares e flores. Tente remover os ramos axilares logo após seu surgimento para tornar as plantas mais manejáveis.Após preparar as plantas, prossiga com o cultivo das bactérias. Este procedimento utiliza bactérias não patogênicas para indução da imunidade vegetal antes de uma segunda inoculação com bactérias desafio; inicie o crescimento de todas as bactérias utilizadas no ensaio. Ao mesmo tempo, utilize estoces bacterianos de glicerol congelados de Pseudomonas para cada estoque bacteriano de Pseudomonas.Espalhe uma pequena quantidade de bactérias no centro de uma placa de KBM contendo o antibiótico apropriado e incube a placa a 30 graus Celsius por cerca de 18 a 24 horas. Para o agrobactéria, use uma placa fresca previamente preparada para iniciar um cultivo líquido em dois mililitros de lb. Incube durante a noite a 30 graus Celsius com agitação no dia seguinte.Adicione 150 a 200 microlitros de meio KBM líquido às placas das bactérias *Pseudomonas*. Espalhe as bactérias por toda a placa. Utilizando um espalhador estéril.Coloque as placas novamente no incubador por mais 20 a 24 horas. Quatro agrobactérias. Inicie um cultivo secundário em cerca de cinco a 10 mililitros de LB contendo 20 micromolares de acetosyringona.Cultive a cultura durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Após o preparo das bactérias, prossiga com o preparo das plantas para o ensaio no dia anterior à realização do ensaio de IPR. Após o preparo das bactérias, transfira as plantas para um ambiente com temperatura entre 22 e 24 graus Celsius, umidade relativa de aproximadamente 35 a 40% e luz constante.Em seguida, use uma caneta preta grossa para marcar círculos nas folhas. Escolha folhas bem expandidas e evite folhas mais velhas ou folhas que estejam duras ou espessas ao tato. Evite marcar as porções inferiores da folha.Os círculos têm pelo menos 1,5 centímetros de diâmetro, e podem ser marcados de dois a quatro círculos por folha. Os círculos devem estar bem espaçados e, preferencialmente, não devem cruzar uma veia grande. Inicie o ensaio de ITP colhendo as bactérias utilizadas na indução do ITP.A espécie de pseudomonas utilizada deverá ter formado um gramado bacteriano indicativo de bom crescimento. Colete-as da placa raspando com um palito estéril longo e re suspenda em cerca de 20 a 25 mililitros de solução de cloreto de magnésio 10 milimolar para centrífuga de agrobactérium.A cultura para coletar as células e ressuspender em cerca de 20 a 25 mililitros de cloreto de magnésio 10 milimolar mais 10 milimolar de MES, pH 5,6; repita a centrifugação e, novamente, ressuspender em cerca de 20 a 25 mililitros da solução de cloreto de magnésio mais MES. Agora que as bactérias indutoras de pseudomonas e agrobacterium estão ressuspensas.Meça a densidade óptica das três culturas em um comprimento de onda de 600 nanômetros. Ajuste as ODS diluindo as células com cloreto de magnésio para a pseudomonas e MES mais cloreto de magnésio para a agrobacterium. Os valores finais de OD exigidos encontram-se no protocolo escrito em anexo.Um volume total de 25 mililitros de cultura bacteriana é suficiente para inocular cerca de 40 a 50 pontos. Agora, inicie o ensaio infiltrando os indutores de PTI nos círculos previamente marcados nas folhas usando uma seringa de um mililitro sem agulha. Anote a ordem na qual as plantas foram infiltradas e o horário exato em que a infiltração foi iniciada após a indução.Prossiga para a inoculação de desafio várias horas após a inoculação de indução. Colete as cepas bacterianas necessárias para a inoculação de desafio conforme mostrado anteriormente para as cepas de pseudomonas indutoras. Novamente, meça a DO e ajuste a concentração das culturas de acordo com o protocolo GR fornecido.Inicie a inoculação de desafio sete horas após a infiltração do indutor. Utilize as seguintes combinações de indutor e desafiador. Escolha um ponto na periferia do primeiro círculo de inoculação como centro do segundo círculo de inoculação.Realize a infiltração de desafio na mesma ordem das plantas utilizada na indução. Se houver múltiplos pontos em uma folha, certifique-se de que as infiltrações não se sobrepõem. Por fim, plaque diluições seriadas de todas as culturas utilizadas no ensaio em placas de KBM ou LB contendo os antibióticos apropriados.Dois dias após a inoculação de desafio, pode-se começar a avaliar a resposta de imunidade induzida por padrões (PTI). Dois dias após as inoculações de indução e desafio, observe o aparecimento de morte celular devido à imunidade acionada por efetores (ETI) nas áreas que foram desafiadas com PST DC 3000. A morte celular dentro da região sobreposta de infiltração indica uma quebra da PTI e deve ser pontuada como um fenótipo positivo. Quatro a cinco dias após as inoculações de indução e desafio, observe o aparecimento de morte celular devido à doença nas áreas desafiadas com o mutante DC 3000 hopQ1 ou PS back high novamente. Procure por quebra da PTI, indicada pela morte celular devido à doença na área sobreposta de infiltração. Continue observando as plantas até que aquelas que não apresentam comprometimento da PTI comecem a mostrar morte celular na região sobreposta de infiltração.Plantas silenciadas para FLS dois apresentam comprometimento da PTI dois dias após inoculação com a combinação PFDC. A morte celular é observada na área de sobreposição, indicando a quebra do controle da PTI em plantas que não foram silenciadas para nenhum gene. Também foram inoculadas com a combinação PFDC e examinadas dois dias após a realização do ensaio; a morte celular devido ao desafio é observada fora, mas não dentro, da área de sobreposição, devido a uma resposta normal de PTI.Acabamos de mostrar como realizar um ensaio baseado na morte celular para imunidade induzida por PAMPs, ou PTI, durante este procedimento. É importante lembrar de manter as plantas nas condições ambientais que recomendamos. Níveis mais altos de umidade afetariam negativamente as plantas e fariam o ensaio progredir mais rapidamente.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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