Ensaio para Pathogen-Associated Padrão Molecular (PAMP) Triggered-Imunidade (PTI) em Plantas

Olá, sou Suma TI do laboratório de Greg Martin no Voice Thompson Institute for Plant Research. Hoje mostraremos um procedimento para um ensaio baseado em morte celular para imunidade desencadeada por PAM ou PTI. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para procurar o envolvimento de um gene no PTI.

Então vamos começar. Comece o procedimento cultivando Nicotiana ANA até que tenham cerca de sete semanas de idade. Quatro a cinco dias antes de começar.

O ensaio de imunidade desencadeada por PAM ou PTI. Apare as plantas para remover todos os ramos axilares e flores. Tente remover os ramos axilares logo após eles emergirem para tornar as plantas mais manejáveis.

Depois de preparar as plantas, prossiga para o cultivo da bactéria. Este procedimento utiliza bactérias não patogênicas para indução da imunidade da planta antes de uma segunda inoculação com bactérias de desafio, iniciando o crescimento de todas as bactérias utilizadas no ensaio. Ao mesmo tempo, use talos de glicerol congelados da bactéria pseudomonas para cada caule bacteriano de pseudomonas.

Espalhe uma pequena quantidade de bactérias no centro de uma placa KBM contendo o antibiótico apropriado e incube a placa a 30 graus Celsius por cerca de 18 a 24 horas. Para a agrobactéria, use um prato fresco previamente preparado para iniciar uma cultura líquida em dois mililitros de lb. Crescer durante a noite a 30 graus Celsius com agitação no dia seguinte.

Adicione 150 a 200 microlitros de KBM líquido às placas da bactéria pseudomonas. Espalhe as bactérias por todo o prato. Usando um greter estéril.

Coloque as placas de volta na incubadora por mais 20 a 24 horas. Quatro agrobactérias. Inicie uma cultura secundária em cerca de cinco a 10 mililitros de LB contendo 20 acetonas micromolares.

Cultive a cultura durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Depois de preparar as bactérias, prossiga para preparar as plantas para o ensaio no dia anterior à realização do ensaio PTI. Depois de preparar as bactérias, mova as plantas para uma sala de 22 a 24 graus Celsius com aproximadamente 35 a 40% de umidade relativa e luz constante.

Em seguida, use um marcador preto grosso para marcar círculos nas folhas. Escolha folhas bem expandidas e evite folhas mais velhas ou folhas duras ou grossas ao toque. Evite marcar as partes inferiores da folha.

Os círculos têm pelo menos 1,5 centímetros de diâmetro e dois a quatro círculos podem ser marcados por folha. Os círculos devem ser bem espaçados e, de preferência, não cruzar uma veia grande. Inicie o ensaio de PTI colhendo as bactérias usadas na indução de PTI.

As espécies de pseudomonas utilizadas devem ter formado um gramado bacteriano indicativo de bom crescimento. Colha-os do prato raspando com uma vara de madeira longa e estéril e ressuspenda em cerca de 20 a 25 mililitros de 10 milimolares. Solução de cloreto de magnésio para centrífuga de agrobactérias.

A cultura para coletar as células e ressus, suspende em cerca de 20 a 25 mililitros de cloreto de magnésio 10 milimolares mais 10 milimolares. MES pH 5,6, repita a centrifugação e novamente, resuse Suspender em cerca de 20 a 25 mililitros da solução de cloreto de magnésio mais MES. Agora que as pseudomonas indutoras e as bactérias agrobacterium são ressuspensas.

Meça a densidade óptica de todas as três culturas em um comprimento de onda de 600 nanômetros. Ajuste o ODS diluindo as células com cloreto de magnésio para as pseudomonas e MES mais cloreto de magnésio para a agrobactéria. Os valores finais de DO necessários encontram-se no protocolo escrito que acompanha.

Um volume total de 25 mililitros de cultura bacteriana é suficiente para inocular cerca de 40 a 50 manchas. Agora inicie o ensaio infiltrando os indutores de PTI nos círculos pré-marcados nas folhas usando uma seringa de um mililitro sem agulha. Anote a ordem em que as plantas foram infiltradas e a hora exata em que a infiltração foi iniciada após a indução.

Prossiga para a inoculação de desafio várias horas após a inoculação de indução. Colha as cepas bacterianas necessárias para a inoculação de desafio, conforme mostrado anteriormente para as cepas indutoras de pseudomonas. Novamente, meça a DO e ajuste a concentração das culturas de acordo com o protocolo GR que o acompanha.

Inicie a inoculação de desafio sete horas após a infiltração do indutor. Use as seguintes combinações de desafiantes indutores. Escolha um ponto na periferia do primeiro círculo de inoculação como o centro do segundo círculo de inoculação.

Execute a infiltração de desafio na mesma ordem de plantas que a da indução. Se houver vários pontos em uma folha, certifique-se de que as infiltrações não se sobreponham. Finalmente, diluição seriada em placas de todas as culturas usadas no ensaio em placas KBM ou LB contendo os antibióticos apropriados.

Dois dias após a inoculação de desafio, pode-se começar a avaliar a resposta do PTI dois dias após a indução e as inoculações de desafio procuram o aparecimento de morte celular devido à imunidade desencadeada pelo efetor ou ETI nos pontos que foram desafiados com PST DC 3000 morte celular dentro da área de infiltração sobreposta indica uma quebra do PTI e deve ser pontuado como um fenótipo positivo quatro a cinco dias após a indução e o desafio as inoculações procuram o aparecimento de morte celular devido a doenças nos pontos que foram desafiados com o mutante DC 3000 hop Q1 ou PS de volta ao alto. Procure por quebra de PTI que é indicada pela morte celular devido à doença na área de infiltração sobreposta. Continue a observar as plantas até que aquelas que não estão comprometidas para PTI comecem a mostrar morte celular na área de infiltração sobreposta.

As plantas silenciadas para FLS dois são comprometidas para PTI dois dias após a inoculação com a combinação PFDC. A morte celular é observada na área sobreposta, indicando a quebra das plantas de controle de PTI que não foram silenciadas para nenhum gene. Também foram inoculados com a combinação PFDC e examinados dois dias após a realização do ensaio, a morte celular devido ao desafio ser visto fora, mas não dentro da área sobreposta devido a uma resposta normal de PTI.

Acabamos de mostrar como realizar um ensaio baseado em morte celular para imunidade acionada por calça ou PTI ao fazer este procedimento. É importante lembrar de manter as plantas nas condições ambientais que recomendamos. Níveis mais altos de umidade afetariam negativamente as plantas e fariam com que o ensaio prosseguisse mais rapidamente.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.