Ensaio para Pathogen-Associated Padrão Molecular (PAMP) Triggered-Imunidade (PTI) em Plantas
9 de setembro de 2009
Uma célula de ensaio de morte com base em plantas para PTI Nicotiana benthamiana é descrito.
Olá, sou Suma TI do laboratório de Greg Martin no Instituto de Pesquisa em Plantas Voice Thompson. Hoje vamos mostrar um procedimento para um ensaio baseado em morte celular para imunidade desencadeada por PAM, ou PTI. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para investigar o envolvimento de um gene na PTI.
Então vamos começar. Inicie o procedimento cultivando Nicotiana ANA até que tenham cerca de sete semanas de idade. Quatro a cinco dias antes de iniciar.
O ensaio de imunidade induzida por PAM ou PTI. Poda as plantas para remover todos os ramos axilares e flores. Tente remover os ramos axilares logo após seu surgimento para tornar as plantas mais manejáveis.
Após preparar as plantas, prossiga com o cultivo das bactérias. Este procedimento utiliza bactérias não patogênicas para indução da imunidade vegetal antes de uma segunda inoculação com bactérias desafio; inicie o crescimento de todas as bactérias utilizadas no ensaio. Ao mesmo tempo, utilize estoces bacterianos de glicerol congelados de Pseudomonas para cada estoque bacteriano de Pseudomonas.
Espalhe uma pequena quantidade de bactérias no centro de uma placa de KBM contendo o antibiótico apropriado e incube a placa a 30 graus Celsius por cerca de 18 a 24 horas. Para o agrobactéria, use uma placa fresca previamente preparada para iniciar um cultivo líquido em dois mililitros de lb. Incube durante a noite a 30 graus Celsius com agitação no dia seguinte.
Adicione 150 a 200 microlitros de meio KBM líquido às placas das bactérias *Pseudomonas*. Espalhe as bactérias por toda a placa. Utilizando um espalhador estéril.
Coloque as placas novamente no incubador por mais 20 a 24 horas. Quatro agrobactérias. Inicie um cultivo secundário em cerca de cinco a 10 mililitros de LB contendo 20 micromolares de acetosyringona.
Cultive a cultura durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Após o preparo das bactérias, prossiga com o preparo das plantas para o ensaio no dia anterior à realização do ensaio de IPR. Após o preparo das bactérias, transfira as plantas para um ambiente com temperatura entre 22 e 24 graus Celsius, umidade relativa de aproximadamente 35 a 40% e luz constante.
Em seguida, use uma caneta preta grossa para marcar círculos nas folhas. Escolha folhas bem expandidas e evite folhas mais velhas ou folhas que estejam duras ou espessas ao tato. Evite marcar as porções inferiores da folha.
Os círculos têm pelo menos 1,5 centímetros de diâmetro, e podem ser marcados de dois a quatro círculos por folha. Os círculos devem estar bem espaçados e, preferencialmente, não devem cruzar uma veia grande. Inicie o ensaio de ITP colhendo as bactérias utilizadas na indução do ITP.
A espécie de pseudomonas utilizada deverá ter formado um gramado bacteriano indicativo de bom crescimento. Colete-as da placa raspando com um palito estéril longo e re suspenda em cerca de 20 a 25 mililitros de solução de cloreto de magnésio 10 milimolar para centrífuga de agrobactérium.
A cultura para coletar as células e ressuspender em cerca de 20 a 25 mililitros de cloreto de magnésio 10 milimolar mais 10 milimolar de MES, pH 5,6; repita a centrifugação e, novamente, ressuspender em cerca de 20 a 25 mililitros da solução de cloreto de magnésio mais MES. Agora que as bactérias indutoras de pseudomonas e agrobacterium estão ressuspensas.
Meça a densidade óptica das três culturas em um comprimento de onda de 600 nanômetros. Ajuste as ODS diluindo as células com cloreto de magnésio para a pseudomonas e MES mais cloreto de magnésio para a agrobacterium. Os valores finais de OD exigidos encontram-se no protocolo escrito em anexo.
Um volume total de 25 mililitros de cultura bacteriana é suficiente para inocular cerca de 40 a 50 pontos. Agora, inicie o ensaio infiltrando os indutores de PTI nos círculos previamente marcados nas folhas usando uma seringa de um mililitro sem agulha. Anote a ordem na qual as plantas foram infiltradas e o horário exato em que a infiltração foi iniciada após a indução.
Prossiga para a inoculação de desafio várias horas após a inoculação de indução. Colete as cepas bacterianas necessárias para a inoculação de desafio conforme mostrado anteriormente para as cepas de pseudomonas indutoras. Novamente, meça a DO e ajuste a concentração das culturas de acordo com o protocolo GR fornecido.
Inicie a inoculação de desafio sete horas após a infiltração do indutor. Utilize as seguintes combinações de indutor e desafiador. Escolha um ponto na periferia do primeiro círculo de inoculação como centro do segundo círculo de inoculação.
Realize a infiltração de desafio na mesma ordem das plantas utilizada na indução. Se houver múltiplos pontos em uma folha, certifique-se de que as infiltrações não se sobrepõem. Por fim, plaque diluições seriadas de todas as culturas utilizadas no ensaio em placas de KBM ou LB contendo os antibióticos apropriados.
Dois dias após a inoculação de desafio, pode-se começar a avaliar a resposta de imunidade induzida por padrões (PTI). Dois dias após as inoculações de indução e desafio, observe o aparecimento de morte celular devido à imunidade acionada por efetores (ETI) nas áreas que foram desafiadas com PST DC 3000. A morte celular dentro da região sobreposta de infiltração indica uma quebra da PTI e deve ser pontuada como um fenótipo positivo. Quatro a cinco dias após as inoculações de indução e desafio, observe o aparecimento de morte celular devido à doença nas áreas desafiadas com o mutante DC 3000 hopQ1 ou PS back high novamente. Procure por quebra da PTI, indicada pela morte celular devido à doença na área sobreposta de infiltração. Continue observando as plantas até que aquelas que não apresentam comprometimento da PTI comecem a mostrar morte celular na região sobreposta de infiltração.
Plantas silenciadas para FLS dois apresentam comprometimento da PTI dois dias após inoculação com a combinação PFDC. A morte celular é observada na área de sobreposição, indicando a quebra do controle da PTI em plantas que não foram silenciadas para nenhum gene. Também foram inoculadas com a combinação PFDC e examinadas dois dias após a realização do ensaio; a morte celular devido ao desafio é observada fora, mas não dentro, da área de sobreposição, devido a uma resposta normal de PTI.
Acabamos de mostrar como realizar um ensaio baseado na morte celular para imunidade induzida por PAMPs, ou PTI, durante este procedimento. É importante lembrar de manter as plantas nas condições ambientais que recomendamos. Níveis mais altos de umidade afetariam negativamente as plantas e fariam o ensaio progredir mais rapidamente.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio baseado na morte celular para imunidade induzida por PAM (PTI) em plantas de Nicotiana benthamiana. O procedimento envolve o preparo de plantas e bactérias, seguido por uma série de inoculações para avaliar a resposta PTI.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Imunologia Vegetal
- Ensaios de Morte Celular
- Interações Patógeno-Planta
Contexto
- A imunidade induzida por PAM (PTI) é um mecanismo de defesa crítico em plantas.
- Nicotiana benthamiana é comumente utilizada para estudar a imunidade vegetal.
- Compreender a PTI pode auxiliar no desenvolvimento de variedades de plantas resistentes a doenças.
- Ensaios de morte celular são essenciais para avaliar respostas imunológicas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método para avaliar a imunidade induzida por padrões (PTI) em Nicotiana benthamiana.
- Investigar o papel de genes específicos na resposta de PTI.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores em imunologia vegetal.
Métodos Utilizados
- Preparação de plantas de Nicotiana benthamiana mediante poda e marcação de folhas.
- Cultivo de bactérias não patogênicas para induzir a PTI.
- Infiltração de culturas bacterianas em áreas foliares previamente marcadas.
- Avaliação das respostas de morte celular após inoculações de desafio.
Resultados Principais
- A indução bem-sucedida de PTI foi observada por meio de ensaios de morte celular.
- A morte celular em áreas sobrepostas indicou uma quebra da PTI.
- As plantas controle exibiram respostas normais de PTI, sem morte celular nas áreas sobrepostas.
- Plantas silenciadas para genes específicos apresentaram respostas de PTI comprometidas.
Conclusões
- O ensaio descrito avalia efetivamente a PTI em Nicotiana benthamiana.
- Compreender os mecanismos da PTI pode orientar estratégias de melhoramento vegetal.
- Este método pode ser adaptado para diversos estudos na imunidade vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio permite a redução de riscos mecanicistas em vias imunológicas de plantas ao vincular quantitativamente o reconhecimento de PAMPs a respostas defensivas downstream. Ele apoia a validação de alvos na descoberta de agroquímicos, fornecendo uma leitura reprodutível para compostos que modulam a PTI. O método aumenta a confiança preditiva na triagem de estágio inicial para moléculas que potencializam ou suprimem a imunidade vegetal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa o eixo de sinalização FLS2-flg22 para validar receptores de reconhecimento de padrão como alvos terapêuticos.
- Valor Operacional: Utiliza um fenótipo de morte celular para confirmar funcionalmente a competência ou falha da PTI em modelos de perturbação genética ou química.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas e com resolução espacial (morte celular sobreposta versus não sobreposta) para distinguir a eficácia da PTI da ETI ou da suscetibilidade à doença.
- Valor Operacional: Padronizado em Nicotiana benthamiana, um sistema de expressão transitória escalonável e adequado a fluxos de trabalho de agroinfiltração de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Conecta o início molecular (ligação PAMP-PRR) a resultados em nível de organismo (contenção da morte celular), permitindo a avaliação da continuidade da via.
- Valor Operacional: Facilita o alinhamento entre biólogos moleculares e fitopatologistas por meio de um ponto final fenotípico compartilhado.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta desde o engajamento do alvo (ligação PAMP-PRR) até a validação funcional (resposta imune) e triagem fenotípica (triagem de biblioteca de compostos para imunomoduladores).
- Biologia da Descoberta: Testa se um gene, proteína ou molécula pequena modula a primeira saída detectável do sinal de PRR.
- Triagem: Fornece um resultado binário, compatível com imagem (presença/ausência de morte celular na zona de sobreposição), passível de pontuação automatizada.
- Análises: Permite a comparação da intensidade da PTI entre genótipos ou tratamentos por meio da quantificação espacial das respostas de defesa.
- Pesquisa Translacional: Conecta ensaios imunológicos realizados em laboratório a resultados relevantes no campo, modelando como o sinal inicial afeta a resistência a doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma plug-and-play para testar diversos PAMPs, efetores ou cepas microbianas em um formato fenotípico comum.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar a ativação do receptor a uma consequência imunológica definida.
- Valor Operacional: Requer apenas equipamentos básicos de infiltração e microscopia, permitindo ampla adoção entre equipes de descoberta e translacionais.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/interromper na otimização de compostos agroquímicos ao prever a capacidade de priming imunológico relevante para o campo.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos imunomoduladores com base na fidelidade mecanicista à PTI nativa.
Considerações sobre a Implementação
- Experiência em crescimento de plantas, cultivo bacteriano e técnicas de infiltração foliar.
- Acesso a câmaras de crescimento com ambiente controlado, com umidade e iluminação precisas.
- Protocolos padronizados para cepas bacterianas e ajuste de densidade óptica para entrega reprodutível de PAMPs.
- Considerações de adaptação para diferentes espécies vegetais ou efetores PAMP para além do flg22-FLS2.
- Limitação prática: a sensibilidade do ensaio a variáveis ambientais exige controle rigoroso das condições de crescimento.
