Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

O objetivo geral deste procedimento é identificar o sinal de localização de plasmodesmata em proteínas-alvo. O método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre as conexões intercelulares em plantas, ao identificar os sinais essenciais que direcionam proteínas aos plasmodesmata, o que por sua vez facilita o transporte de grandes moléculas de célula a célula. A principal vantagem desta técnica é que o procedimento é confiável e pode ser facilmente adaptado para a descoberta de sequências de sinais de localização de plasmodesmata na maioria das proteínas direcionadas aos plasmodesmata.

A demonstração em vídeo deste método é essencial, pois as etapas de plantio, filtração e preparação para observação confocal são difíceis de aprender por meio de publicações tradicionais baseadas em impressos. Plante sementes de Nicotiana benthamiana em solo úmido e com alta densidade. Durante o crescimento, mantenha-as em câmara ambiental controlada a 20 a 25 graus Celsius e sob 16 horas de luz por dia, com intensidade de aproximadamente 75 micromoles de fótons por metro quadrado por segundo.

Após o diâmetro do u. fil atingir meio centímetro, transfira cuidadosamente as mudas para vasos maiores e continue seu crescimento na mesma câmara e nas mesmas condições. Mantenha as plantas até que atinjam o estágio de quatro a oito folhas dentro de quatro semanas.

Neste momento, as folhas maiores devem ter de quatro a seis centímetros de diâmetro. Para facilitar a identificação e análise, escolha um sistema de expressão e marque fluorescentemente cada proteína expressa conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. Prepare um plasmídeo baseado em pPZP-RCS2 conforme descrito e adicione um micrograma dele a uma cultura de 100 microlitros de células competentes de Agrobacterium tumefaciens.

Incube as células no gelo por 30 minutos. Em seguida, congele rapidamente as células em nitrogênio líquido por um minuto. Depois, aqueça as células a 28 graus Celsius por 15 minutos e adicione um mililitro de meio LB à mistura de células competentes.

Após adicionar o meio LB, coloque as células novamente a 28 graus Celsius por duas horas. Em seguida, centrifugue as células a 3.000 ×g por um minuto. Re-suspenda o pellet celular em 0,2 mililitros de meio LB e plaque em placas de ágar LB com antibiótico seletivo.

Cultive as células nas placas a 28 graus Celsius por 48 horas até que colônias individuais fiquem visíveis. Em seguida, escolha e plaque várias colônias individuais em placas frescas de ágar LB e cultive as células a 28 graus Celsius por 48 horas. Depois, retire uma pequena quantidade de bactérias de cada placa para análise e utilize a PCR de colônia para confirmar a presença das construções binárias específicas de interesse.

Adicione cada colônia de agrobactéria com o construto de interesse a cinco mililitros de meio LB suplementado com os antibióticos apropriados. Incube as células durante a noite a 28 graus Celsius. Em seguida, centrifugue as células a 3.000 × g. Re-suspenda o precipitado em um OD600 de 0,5 em tampão de agroinfiltração.

Incube a suspensão por duas horas à temperatura ambiente e, em seguida, carregue o inóculo em uma seringa plástica de um mililitro. Segurando uma folha totalmente madura de N. benthamiana com o dedo enluvado na face adaxial, pressione a ponta da seringa contra a epiderme inferior da folha. Em seguida, introduza lentamente o agrobactéria no meio de infiltração injetando o meio.

Mantenha a planta infiltrada até o momento da observação. Use uma lâmina para cortar cada folha em fragmentos entre as nervuras 24 a 48 horas após a infiltração. Coloque as fatias de folha sobre a lâmina do microscópio com a superfície abaxial da folha voltada para cima.

Em seguida, coloque uma gota de água sobre o fragmento da folha e cubra com a lamínula. Imobilize a lamínula com pequenos pedaços de fita adesiva em cada lado. Transfira a lâmina para sob um microscópio confocal a laser e utilize uma objetiva de 10X para identificar as células com o melhor sinal.

Em seguida, utilize uma lente objetiva de 63X para registrar imagens para observações mais detalhadas. Além disso, use os filtros de fluorescência apropriados para excitar as proteínas fluorescentes expressas. Mantenha todas as configurações utilizadas na aquisição de imagens para assegurar a consistência entre os experimentos.

Em média, analise de 100 a 120 células para cada condição experimental. Diagnostique a localização das proteínas testadas utilizando as imagens do microscópio confocal. Essas imagens ilustram os padrões característicos de localização pontuada periférica nos plasmodesmos observados para a proteína de movimentação do TMV em sua forma completa fundida à molécula marcadora CFP, bem como para o sinal de localização nos plasmodesmos identificado fundido ao CFP, e também para a proteína de localização nos plasmodesmos coexpressa, PDCB1 fundida à DsRed.

Em condições de controle, o direcionamento aos plasmodesmata da proteína de movimentação completa do TMV fundida à CFP e do sinal de localização na proteína de movimentação do TMV fundido à CFP aparece conforme mostrado aqui, com a localização subcelular da CFP e a localização nucleocitoplasmática do marcador DsRed2. Quando o quarto aminoácido, valina, é mutado para alanina, o direcionamento aos plasmodesmata tanto pela proteína de movimentação completa do TMV quanto pelo sinal de localização identificado na proteína de movimentação do TMV é perdido. Isso indica que esse resíduo é importante para a estrutura ou função do sinal de localização nos plasmodesmata.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 50 horas se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as plantas em condição muito saudável e na fase foliar adequada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão, não apenas de como identificar o sinal de localização proteica em plasmodesmas, mas também de como identificar outros sinais específicos em proteínas vegetais.