Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

O objetivo geral deste procedimento é identificar o sinal de localização de plasmodesmos em proteínas-alvo. O método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo das conexões intercelulares das plantas, identificando o pensamento crítico em sinais que direcionam proteínas para os plasmodesmos, o que, por sua vez, facilita o transporte de célula para célula de grandes moléculas. A principal vantagem desta técnica é que o procedimento é confiável e pode ser facilmente adaptado para a descoberta de sequências de sinal de localização de plasmodesmos na maioria das proteínas direcionadas a plasmodesmos.

A demonstração em vídeo desse método é crítica, pois a filtragem do plantio e a preparação para as etapas de observação confocal são difíceis de aprender por meio de publicações impressas típicas. Plante sementes de Nicotiana benthamiana em solo úmido e em alta densidade. Durante o crescimento, mantenha-os em uma câmara ambiental controlada a 20 a 25 graus Celsius e sob 16 horas de luz por dia, que contém cerca de 75 micromoles de fótons por metro quadrado por segundo.

Depois que o diâmetro do u. fil atingir meio centímetro, transfira cuidadosamente as mudas para vasos maiores e continue seu crescimento na mesma câmara nas mesmas condições. Mantenha as plantas até que cresçam até o estágio de quatro a oito folhas dentro de quatro semanas.

Neste ponto, as folhas maiores devem ter de quatro a seis centímetros de diâmetro. Para facilitar a identificação e análise, escolha um sistema de expressão e marque fluorescentemente cada proteína expressa conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Preparar um plasmídeo à base de pPZP-RCS2 tal como descrito e adicionar um micrograma do mesmo a uma cultura de 100 microlitros de células competentes de Agrobacterium tumefaciens.

Incube as células no gelo por 30 minutos. Em seguida, congele rapidamente as células em nitrogênio líquido por um minuto. Em seguida, aqueça as células a 28 graus Celsius por 15 minutos e, em seguida, adicione um mililitro de meio LB à mistura de células competente.

Depois de adicionar o meio LB, coloque as células de volta a 28 graus Celsius por duas horas. Em seguida, gire as células a 3.000 vezes G por um minuto. Ressuspenda o pellet celular em 0,2 mililitros de meio LB e coloque-os em placas de ágar LB seletivo para antibióticos.

Cultive as células nas placas a 28 graus Celsius por 48 horas até que as colônias individuais sejam visíveis. Em seguida, pegue e coloque várias colônias individuais em placas de ágar LB frescas e cultive as células a 28 graus Celsius por 48 horas. Em seguida, pegue uma pequena quantidade de bactérias de cada placa para análise e use Colony PCR para confirmar a presença das construções binárias específicas de interesse.

Adicione cada colônia de agrobacterium com a construção de interesse a cinco mililitros de meio LB suplementado com os antibióticos apropriados. Cultive as células durante a noite a 28 graus Celsius. Em seguida, centrifugue as células a 3.000 vezes G.Resuspenda o pellet a um OD600 de 0,5 em tampão de agroinfiltração.

Incubar a suspensão durante duas horas à temperatura ambiente e, em seguida, colocar o inóculo numa seringa de plástico de um mililitro. Segurando uma folha de N.Benthamiana totalmente madura com um dedo enluvado na face adaxial, pressione o bico da seringa contra a epiderme inferior da folha. Em seguida, introduza lentamente a agrobactéria no meio de infiltração injetando o meio.

Mantenha a planta infiltrada até que seja observada. Use uma lâmina para cortar cada folha em fragmentos entre as nervuras 24 a 48 horas após a infiltração. Coloque as fatias de folha na lâmina do objeto com a superfície da folha abaxial voltada para cima.

Em seguida, coloque uma gota de água sobre a fatia de folha e cubra-a com a lamínula. Imobilize a lamínula com pequenos pedaços de fita adesiva de cada lado. Transfira uma lâmina para baixo de um microscópio confocal de varredura a laser e use uma lente subjetiva de 10X para identificar as células com o melhor sinal.

Em seguida, use uma lente subjetiva de 63X para gravar imagens para observações mais detalhadas. Além disso, use as fluorescentes apropriadas para excitar as proteínas fluorescentes expressas. Mantenha todas as configurações usadas para aquisição de imagens para manter a consistência entre os experimentos.

Em média, examine de 100 a 120 células para cada condição experimental. Diagnostique a localização das proteínas testadas usando as imagens do microscópio confocal. Essas imagens ilustram os padrões característicos de localização de plasmodesmos pontilhados periféricos observados para a proteína de movimento TMV de comprimento total fundida à molécula de carga CFP e para o sinal de localização de plasmodesmos identificado fundido ao CFP, bem como para a proteína de localização de plasmodesmos co-expressa, PDCB1 fundido a DsRed.

Sob condições de controle, o direcionamento de plasmodesmos da proteína de movimento TMV de comprimento total fundida ao CFP e o sinal de localização na proteína de movimento do TMV fundida ao CFP, aparece como mostrado aqui com a localização subcelular do CFP e a localização nucleocitoplasmática do marcador DsRed2. Quando o quarto aminoácido, a valina, é mutado em alanina, o direcionamento de plasmodesmos tanto pela proteína de movimento do TMV de comprimento total quanto pelo sinal de localização identificado na proteína de movimento do TMV é perdido. Isso indica que esse resíduo é importante para a estrutura ou função do sinal de localização dos plasmodesmos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 50 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter as plantas em condições muito saudáveis e as plantas estão no estágio certo de folhas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão, não apenas de como identificar o sinal da proteína de localização de plasmodesmos, mas também de como identificar outros sinais específicos em proteínas vegetais.