Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

A determinação do teor de lignina e da composição das paredes celulares das plantas começa com o material vegetal seco, que é submetido a várias extrações. O material resultante consiste apenas em paredes celulares e depois é dividido para determinar o conteúdo de lignina. O material da parede é submetido à hidrólise por brometo de acetila e os monoals solubilizados são quantificados por espectrometria UV para a determinação da composição da lignina.

O material da parede é hidrolisado por citólise. Os componentes da lignina solubilizada são então derivados de seus derivados salinos trimetil voláteis, que podem ser separados e quantificados usando cromatografia gasosa em conjunto com espectrometria de massa. A determinação da composição do polissacarídeo da matriz e do teor de celulose é demonstrada em outro vídeo intitulado Análise Composicional Abrangente das Paredes Celulares Vegetais, parte Dois Carboidratos.

Olá, sou Marcus Pauley, chefe da instalação Wall Analytical no Centro de Pesquisa de Bioenergia dos Grandes Lagos aqui na Michigan State University. Eu sou Cliff Foster, gerente da instalação analítica da parede celular. Mostraremos o procedimento sobre como determinar o conteúdo e a composição de amostras de biomassa vegetal.

As plantas convertem a energia luminosa do sol em energia química, como a biomassa. A biomassa vegetal consiste principalmente de paredes celulares, uma rede complexa de uma variedade de polímeros que envolvem todas as células vegetais. Aqui determinamos a composição dos materiais da parede celular vegetal para avaliar o potencial de transformação dessas lignina Cellose X, que são um recurso renovável altamente abundante em biocombustíveis.

Hoje vamos nos concentrar no polifenol lignina em outro vídeo intitulado Análise Composicional Abrangente das Paredes Celulares Vegetais, parte dois carboidratos. Vamos nos concentrar na análise de polissacarídeos. Para iniciar este procedimento, adicione três esferas de aço inoxidável de 5,5 milímetros a um tubo de tampa de rosca de dois mililitros e cerca de 60 a 70 miligramas de ar ou material vegetal liofilizado.

O material pode ser moído em um pó fino usando a parede do olho, um robô de moagem e distribuição. A parede do olho pega o tubo e o agita por 30 segundos, onde, devido às bolas de metal, o material é moído em um pó fino, depois o solo, mas o pó vegetal compacto é afrouxado em um procedimento alternativo não robótico de baixo rendimento. Facilitar um retro é apresentado na parte dois, adicione 1,5 M de etanol aquoso a 70% ao vórtice do material moído completamente e centrifugue à temperatura ambiente.

Este tratamento solubiliza a maioria das proteínas e organelas celulares, aspira o sobrenadante e adiciona um volume a um volume. Solução de metanol de clorofórmio para o pellet insolúvel em álcool agite completamente para girar novamente o pellet e a centrífuga. O clorofórmio metanol extrai os compostos hidrofóbicos, como lipídios, após centrifugação, aspira o sobrenadante e ressuspende o pellet e 500 microlitros de acetona.

Para secar a amostra, evapore o solvente com uma corrente de ar a 35 graus Celsius até secar, as amostras secas podem ser armazenadas em temperatura ambiente até processamento posterior. Para iniciar a remoção do amido da amostra reus, suspenda o pellet e 1,5 mils de acetato de sódio 0,1 molar pH cinco tampe os tubos e aqueça-os em um bloco de aquecimento para gelatinizar o amido. Depois de resfriar a suspensão no gelo, adicione a mistura de enzimas degradadoras de amido, tampe o tubo e incube completamente a suspensão durante a noite.

No agitador a 37 graus Celsius, um agitador rotativo garante a mistura adequada. Após a incubação durante a noite, termine a digestão aquecendo em um bloco de aquecimento a 100 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, centrifugue e descarte o sobrenadante, que contém um amido solubibilizado.

Lave o pellet restante três vezes usando 1,5 mils de água de cada vez por vórtice, centrifugação e decantação, conforme demonstrado anteriormente. Finalmente, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de acetona e evapore o solvente com uma corrente de ar a 35 graus Celsius até secar. As amostras secas contendo parede celular ou perna isolada, sem celulose estão prontas para análise posterior e podem ser armazenadas em temperatura ambiente.

Comece pesando de um a 1,5 miligramas de material de parede celular preparado. O material pode ser pesado manualmente ou de forma automatizada com a parede do olho, conforme demonstrado na segunda parte. Enxágue as paredes do tubo com 250 microlitros de acetona para coletar o material da parede celular no fundo do tubo e evapore a acetona muito suavemente sob fluxo de ar.

Depois que a acetona evaporar, adicione suavemente 100 microlitros de brometo de acetila a 25% de volume a volume recém-feito em ácido acético glacial ao longo das duas paredes. Para evitar respingos, um brometo sutil decompõe o polímero de lignina em seus monos acetilados. Em seguida, tampe o balão volumétrico e aqueça a 50 graus Celsius por duas horas.

Aqueça por mais uma hora com quatro mensagens de texto a cada 15 minutos e, finalmente, deixe esfriar no gelo Em temperatura ambiente, após o resfriamento do frasco, adicione 400 microlitros de hidróxido de sódio de dois molares e 70 microlitros de vórtice de cloridrato de hidroxilamina de 0,5 molar recém-preparado, os frascos volumétricos. Em seguida, neutralize a solução enchendo o frasco volumétrico exatamente até a marca de dois mililitros com tampa de ácido acético glacial e inverta várias vezes para misturar 200 microlitros da solução contendo os monolals hidrolisados e solubilizados em uma placa de 96 poços específica para UV e leia a placa em um leitor de placas de poço a 280 nanômetros. Leia a placa pelo menos três vezes e calcule a média da absorbância, pois as partículas podem causar uma ligeira variação nos valores de absorbância.

Determine a porcentagem de uma lignina solúvel em brometo sutil ou A BSL usando o coeficiente de planta apropriado com a fórmula apresentada no protocolo escrito. A lignina é uma rede de polifenóis que consiste principalmente em três subunidades, unidades P hidroxifenol, gua ACell e rolinho primavera devido a determinar a composição da lignina no material vegetal. Comece transferindo aproximadamente dois miligramas de material da parede celular para um tubo de vidro com tampa de rosca para citólise.

Em seguida, prepare-se para preparar a solução de trifluoreto de etilo a 2,5% de boro e tiol a 10% de etano em dioxano. Como o dioxano é muito perigoso, não retire nenhuma amostra ou equipamento do capô. Lembre-se de trabalhar com muito cuidado e usar um balão cheio de gás nitrogênio para deslocar o volume perdido no frasco de dioxano com nitrogênio.

Preparar a solução misturando os seguintes volumes por amostra: 175 microlitros de dioxano, 20 microlitros de ETSH, cinco microlitros de BF, três. Após a mistura, adicione 200 microlitros da solução a cada amostra. Purgue o headspace do frasco com gás nitrogênio e tampa.

Proceda imediatamente ao aquecimento das amostras a 100 graus Celsius por quatro horas com uma mistura suave a cada hora. Theo ace lise reação no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione 150 microlitros de bicarbonato de sódio 0,4 molar para neutralizar e vórtice.

Para a limpeza dos produtos de degradação da lignina, adicione um mil de água e 0,5 mils de vórtice de acetato e deixe as fases separadas. A camada de acetato de etila estará na parte superior e a água na parte inferior. Transfira 150 microlitros da camada superior de acetato de Ethel contendo os componentes de lignina para um tubo de dois mil, certificando-se de que nenhuma água seja transferida.

Após a transferência da camada superior de acetato de Ethel, evaporar o solvente usando um concentrador com ar. Adicione 200 microlitros de acetona e evapore. Repita o tratamento com acetona duas vezes para remover o excesso de água.

Em seguida, derivar os componentes da lignina para seus derivados voláteis de trimetil Cy Lane. Adicione 500 microlitros de acetato de etila, 20 microlitros de purina e 100 microlitros de acetamida trimetil cil NO biss a cada tubo. Incube por duas horas a 25 graus Celsius.

Ao final das duas horas, transfira 100 microlitros da reação para um frasco de GC MS e adicione 100 microlitros de acetona. Analise as amostras por GC equipado com um espectrômetro de massa quádruplo ou detector de ionização de chama. Para coluna e detalhes da corrida, consulte o protocolo escrito que acompanha.

Aqui estão alguns resultados representativos da análise de lignina usando madeira de álamo como material vegetal. De acordo com esta análise, 22% do material do choupo consiste no polifenol lignina. A composição dos componentes da lignina foi analisada por GCMS.

Os picos são identificados por tempos de retenção relativos utilizando o padrão interno tetracoano ou por ícones característicos do espectro de massa de 2 99 MZ, 2 69 MZ e 2 39 MZ para os monómeros sg e h, respectivamente. A composição dos componentes da lignina é quantificada definindo a área total do pico para 100%A análise composicional mostra que esta amostra em particular contém principalmente unidades de string ou S. No entanto, as unidades Goya, aol ou G também são abundantes.

Obviamente, a quantidade e a composição da unidade mono lial podem variar dependendo do tecido e da espécie vegetal. Acabamos de mostrar como determinar o teor de lignina e a composição do material vegetal para a análise de polissacarídeos. Transforme-se na parte dois.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.