Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte II: Os hidratos de carbono

A determinação da composição do polissacarídeo da matriz e do teor de celulose cristalina das paredes celulares vegetais começa com o material vegetal seco, que é submetido a várias extrações. O material resultante consiste apenas em paredes celulares e, em seguida, é dividido para determinar a composição do polissacarídeo da matriz. O material da parede é tratado com um ácido fraco para hidrolisar polissacarídeos não cristalinos, que são principalmente as hemoceluloses em seus monossacarídeos.

Os monossacarídeos são então derivados em seus acetatos aldólicos voláteis correspondentes, que são então analisados e quantificados por cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massa para a determinação da celulose cristalina. As paredes de conteúdo são tratadas com o reagente gráfico, uma mistura de ácidos que retiram os componentes não cristalinos da parede. A celulose cristalina restante é degradada em seu monômero glicose, que pode ser analisado, colo metricamente.

A determinação do conteúdo e composição da lignina é demonstrada em outra publicação em vídeo J intitulada Análise Composicional Abrangente das Paredes Celulares das Plantas, parte Um Lignina. Olá, sou Marcus Pauley, chefe da instalação analítica Wall no Centro de Pesquisa de Bioenergia dos Grandes Lagos aqui na Michigan State University. Eu sou Cliff Foster, gerente da instalação Cell Wall Analytical.

Hoje mostraremos como determinar a composição dos polissacarídeos presentes no material da parede celular vegetal que é a celulose em várias celuloses Homo. Aqui no Centro de Pesquisa de Bioenergia dos Grandes Lagos, desenvolvemos tecnologia para converter esses açúcares em biocombustíveis. Para identificar uma matéria-prima vegetal ideal, primeiro precisamos avaliar o tipo e a abundância de açúcares presentes nessa biomassa.

Em outro vídeo intitulado Análise Composicional Abrangente de Paredes Celulares Vegetais, parte um Lignina, vamos nos concentrar na análise de polifenóis. Então vamos começar. Comece este procedimento isolando as paredes celulares.

Moa cerca de 60 a 70 miligramas de material vegetal seco com bolas de aço inoxidável de 5,5 milímetros em um tubo de tampa de rosca SAR TED de dois mil. Usando um moinho REM como uma alternativa de alto rendimento, use um robô de moagem e distribuição denominado parede do olho, conforme descrito na primeira parte. Quando a retificação estiver concluída, remova as esferas de aço.

Continue a isolar as paredes celulares e remover o amido residual, conforme mostrado na primeira parte e descrito no protocolo escrito que acompanha. Pesar dois miligramas de material da parede celular do amido DS num tubo de dois moinhos. Uma maneira de alto rendimento de realizar essa tarefa é o robô da parede do olho.

O robô pega um tubo contendo material vegetal moído e faz um buraco no fundo do tubo. O tubo perfurado é então colocado em um alimentador VI. Um tubo vazio é colocado em uma balança e deslocado sob o alimentador VI através do material de vibração que percola através do orifício no tubo superior carregado para o tubo inferior vazio até que a quantidade desejada de material seja acumulada.

Adicione 100 microgramas de acetol como padrão interno. Enxágue as paredes do tubo com acetona para coletar o material da parede celular no fundo do tubo e evapore a acetona muito suavemente sob o fluxo de ar. Em seguida, execute a hidrólise ácida fraca.

Adicione cuidadosamente 250 microlitros de ácido tricloroacético de dois molares ou TFA a cada amostra, certificando-se de que nenhum material seja respingado nas paredes do tubo. Tampe bem os tubos e incube a 121 graus Celsius em um bloco de aquecimento por 90 minutos. Em seguida, resfrie os blocos de aquecimento e as amostras no gelo e centrifugue os tubos a 10.000 RPM por 10 minutos.

Transfira 100 microlitros do sobrenadante ácido contendo os açúcares solubilizados do polissacarídeo da matriz para frascos com tampa de rosca, certificando-se de não perturbar o material do pellet. O pellet pode ser usado para o ensaio de celulose cristalina. Evapore o TFA em um tubo de vidro sob uma corrente de ar suave em um dispositivo de evaporação.

Adicione 300 microlitros de dois propanol para remover o excesso de vórtice ácido e evapore a 25 graus Celsius. Repita por um total de três vezes. Para permitir a identificação dos monossacarídeos por cromatografia em fase gasosa, efectuar uma derivitização com acetato de aldol.

Primeiro, reduza os monossacarídeos aos seus correspondentes aldóis de anel aberto, que são então acetilados. Consulte o protocolo escrito que acompanha para obter instruções detalhadas. Cada etapa do procedimento segue o protocolo mostrado anteriormente, adição de evaporação de incubação de reagente sob uma corrente de ar, seguida pela remoção do excesso de reagente por várias etapas de lavagem.

Nas etapas finais, os acetatos aldólicos são extraídos. Primeiro, adicione 500 microlitros de acetato de etila e agite levemente. Em seguida, adicione dois mils de água, tampe os tubos e o vórtice, centrifugue os tubos a 2000 RPM por cinco minutos para obter camadas separadas claras com acetato de etila na parte superior contendo os acetatos de Al Dettol e água na pipeta inferior 50 microlitros de camada de acetato de etila em frascos de GCMS com inserções diluídas pela adição de 100 microlitros de acetona ao frasco de GC e o frasco de GC pode ser armazenado a quatro graus Celsius.

Se a análise do GCMS não prosseguir imediatamente, injete as amostras em um fotógrafo de croma de gás equipado com um espectrômetro de massa quádruplo. Para coluna e detalhes da corrida, consulte o protocolo escrito que acompanha. O material de partida para determinar o teor de celulose cristalina pode ser material de parede celular isolado ou material de parede já tratado com o TFA ácido fraco, imediatamente após o tratamento ácido ou na forma seca armazenável.

Depois de remover o excesso de TFA com iso propanol como mostrado anteriormente, adicione ao pellet de TFA nos dois M sars para tubo um M de reagente de degra ascendente composto de ácido acético, ácido nítrico e água, adicione uma proporção de oito para um a dois volumes. Tampe o tubo firmemente e aqueça em um bloco de aquecimento a 100 graus Celsius por 30 minutos. Como resultado deste tratamento, apenas a celulose cristalina permanece no pellet.

Todos os outros polissacarídeos são amostras frias hidrolisadas no bloco em gelo à temperatura ambiente ou mais fria. Em seguida, centrifugar as amostras a 10 000 rpm durante 15 minutos após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante garantindo que o pellet não seja perturbado e que nenhum material do pellet seja removido. Para isso, deixe aproximadamente 150 microlitros do sobrenadante no tubo, lave o pellet várias vezes com água.

Em seguida, faça uma hidrólise com o ácido sulfúrico concentrado para hidrolisar completamente o cristal e o pellet de celulose em glicose. Comece adicionando 175 microlitros de ácido sulfúrico a 72% ao tubo de sarta e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação inicial, vórtice a amostra e incube por mais 15 minutos.

Em seguida, adicione 825 microlitros de água e vórtice e centrifugue as amostras a 10.000 RPM por cinco minutos. Pode haver algum material marrom e solúvel, principalmente lignina permanecendo no tubo enquanto a glicose está no sobrenadante. O teor de glicose do sobrenadante é analisado usando o ensaio de histona colormétrica.

Este ensaio é realizado em uma placa de microtitulação de poliestireno de 96 poços. Repare uma curva padrão de glicose em duplicata seguindo as instruções do protocolo escrito que o acompanha. Prepare as amostras combinando 10 microlitros de cada amostra, supernat e 90 microlitros de água em poços separados da mesma placa de microtitulação do acabamento padrão, adicionando 200 microlitros de reagente recém-preparado e jogado.

Em seguida, aqueça a placa por 30 minutos a 80 graus Celsius em um forno com dissipador de calor de alumínio. Observe que as amostras contendo glicose mudam de amarelo para verde azulado quando o aquecimento está completo. Deixe o prato esfriar até a temperatura ambiente e agite bem.

Leia a absorção a 625 nanômetros usando um leitor de placa de microtitulação. O teor de glicose, o bloco de construção da celulose, é calculado com base na absorbância em comparação com a curva padrão estabelecida na mesma placa. Aqui estão alguns resultados representativos da análise de polissacarídeos de um pedaço de madeira de choupo.

Os picos do cromatograma de gás são identificados por perfis de massa e/ou tempos de retenção de padrões. Os monossacarídeos são quantificados com base em curvas padrão. A análise de açúcares dos polissacarídeos da matriz mostra uma alta abundância de xilose representando hemicelulose xam, mas outros açúcares também estão presentes.

De acordo com a análise, 40% do material do choupo consiste em cristal e celulose. Observe que esses conteúdos e composições podem variar de planta para planta ou entre diferentes anatomias de plantas. Acabamos de mostrar como determinar o conteúdo de polissacarídeos e a análise composicional da biomassa lignano celulósica para a análise da lignina polifenol.

Sintonize a primeira parte. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.