Name: A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a testar redundância funcional de genes em embriões de zebrafish usando morfolinos específicos. Este método revela mecanismos compensatórios entre genes durante a especificação de linhagens celulares.

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Agradecemos a membros do laboratório de Evans pela sua ajuda na preparação desta apresentação. O morpholinos usados ​​aqui foram originalmente validados pelo Dr. Audrey Holtzinger. TE é suportado por concessões do National Institutes of Health (HL064282 e HL056182). Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Instituto de Animal Care e do Comitê de Uso, do Weill Cornell Medical College.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

No experimento descrito aqui, combinamos duas morpholinos, cada qual por si só gerar uma gama de fenótipos distintos, e encontrou um fenótipo totalmente diferente quando foram co-injetados juntos. É claro, precisávamos de uma justificação para fazer esta experiência, em primeiro lugar. Nós suspeitamos que os dois genes pode compensar o outro para uma função mais cedo, nesta especificação caso cardíaca. Isso ocorre porque os genes são altamente relacionados (e capazes de se ligar às seqüências de DNA mesmo) e são express...

<table><tbody><tr><td>Tanques e divisórias para criação de peixes</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Redes para peixes</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água do sistema</td><td></td><td></td><td>60 mg de Instant Ocean&amp;#8221; por litro de dH2O</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 100 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de agulhas para micropipeta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro de 3,5&quot;</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>Micromoinho</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>Ocular de microscópio com grade</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>Micrômetro</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Esptula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Balança</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Placas descartáveis para pesagem</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ondas convencional</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>Proveta graduada</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador automático</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lavagem com etanol 70%</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>Botijão de N2</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt; morfolino do sítio de splice</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>gata5 ATG Blocker</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt; Long Isoform ATG Blocker</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur descartável</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metanosulfonato</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta fina</td><td>Dumont</td><td></td><td>Tamanho 55</td></tr><tr><td>Lâminas de fundo cavado</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

a abordagem inversa genética para teste de redundância funcional durante a embriogênese

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

A função do gene durante a embriogênese é normalmente definida por perda de função experimentos, por exemplo, mutagênese alvo (knockout) no mouse. No modelo peixe-zebra, eficazes técnicas de genética reversa têm sido desenvolvidos usando microinjeção de morpholinos gene antisense específicos. Morpholinos alvo um mRNA através da base de emparelhamento específica e função do gene bloco transitoriamente pela tradução inibir ou splicing por vários dias durante a embriogênese (knockdown). No entanto, em vertebrados, como mouse ou peixe-zebra, algumas funções do gene pode ser obscurecida por estas abordagens, devido à presença de outro gene que compensa a perda. Isto é especialmente verdade para as famílias de genes que contém genes irmã que são co-expressos nos mesmos tecidos em desenvolvimento. Em peixes-zebra, a remuneração funcional pode ser testada de uma forma relativamente alto rendimento, por co-injeção de morpholinos que knockdown alvo de ambos os genes simultaneamente. Da mesma forma, usando morpholinos, uma interação genética entre dois genes pode ser demonstrado pelo knockdown de ambos os genes juntos no sub-threshold níveis. Por exemplo, morpholinos pode ser ajustada de tal forma que nem knockdown indivíduo gera um fenótipo. Se, nessas condições, co-injeção de ambos morpholinos causa um fenótipo, uma interação genético é mostrada. Aqui demonstramos como mostrar redundância funcional no contexto de dois fatores de transcrição GATA relacionados. Fatores GATA são essenciais para a especificação de células progenitoras cardíacas, mas isso só é revelada pela perda de ambos os Gata5 e Gata6. Mostramos como a realização de experimentos microinjeção, validar o morpholinos, e avaliar o fenótipo compensado do coração.

A função do gene pode ser obscurecida na perda de função experimentos se houver compensação por outro gene. O modelo de zebrafish fornece um relativamente alto rendimento significa revelar redundância funcional como em embriões vivos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

A função gênica durante a embriogênese é tipicamente definida por experimentos de perda de função, por exemplo, por mutagênese direcionada (knockout) no camundongo. Em ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar se dois genes são funcionalmente redundantes na especificação de uma linhagem celular definida. Isso é realizado primeiramente definindo o fenótipo de perda de função de cada gene individual por meio de morphos específicos para o gene, injetados em embriões de peixe-zebra em desenvolvimento. O segundo passo do procedimento consiste em desenvolver um ensaio para quantificar a especificação ou diferenciação da linhagem celular.Por exemplo, utilizando uma linhagem de peixes repórter, como mostraremos aqui. O terceiro passo do procedimento é combinar dois morph FENO para direcionar a perda de função de ambos os genes simultaneamente. O passo final do procedimento é avaliar o fenótipo causado pela dupla inibição.No fim, podem ser obtidos resultados que demonstram perda ou ganho de função para células de uma linhagem específica por meio da análise do repórter de linhagem ou da avaliação da expressão de marcadores específicos da linhagem. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a combinação de genes nulos no modelo de camundongo, é que dois ou mesmo três genes podem ser alvejados no modelo de peixe simples

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método de genética reversa adaptável para peixe-zebra para avaliar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento e homeostase fisiológica, como a regeneração do tecido usando injeções intraventricular de morpholinos gene-específicos.

Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

Descrevemos um sistema de capas de oócitos e animais de Xenopus para a clonagem de expressão de genes capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente, e discutimos técnicas para a análise subsequente de tais genes. Este sistema é útil na identificação funcional de uma ampla gama de produtos gênicos.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

Este artigo de vídeo detalha uma simples em metodologia in vivo que pode ser utilizado para caracterizar de forma eficiente e sistematicamente componentes de vias de sinalização complexas e redes reguladoras em muitos embriões de invertebrados.

O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões<em&gt; Na Vivo</em&gt; Modelos de desenvolvimento para estudar células de células-complexo de sinalização de rede Interações

Apresentamos um protocolo de tela simples supressor em fissão fermento. Este método é eficiente, livre de mutagênico e seletiva para as mutações que ocorrem frequentemente em um único locus genômico.  O protocolo é apropriado para isolar supressores que aliviar defeitos de crescimento em cultura líquida que são causados por uma mutação ou uma droga.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

O teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos. Aqui, apresentamos um filme que mostra os procedimentos detalhados de como realizar o teste.

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Indução neural é o primeiro passo na formação do cérebro. É um mecanismo pelo qual o nó de Hensen (organizador), instrui tecido adjacente a adotar um destino neural, ou seja, dar origem ao sistema nervoso. Este vídeo demonstra um ensaio para a indução neural no embrião de galinha.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Aprenda a testar redundância funcional de genes em embriões de zebrafish usando morfolinos específicos. Este método revela mecanismos compensatórios entre genes durante a especificação de linhagens celulares.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

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