A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

O objetivo geral deste procedimento é determinar se dois genes são funcionalmente redundantes para a especificação de uma linhagem celular definida. Isso é feito definindo primeiro o fenótipo de perda de função de cada gene individual usando morfos específicos do gene injetados em embriões de peixe-zebra em desenvolvimento. A segunda etapa do procedimento é desenvolver um ensaio para quantificar a especificação ou diferenciação da linhagem celular.

Por exemplo, usando uma cepa de peixe repórter, como mostraremos aqui. A terceira etapa do procedimento é combinar dois FENOs morfológicos para atingir a perda de função de ambos os genes simultaneamente. A etapa final do procedimento é avaliar o fenótipo causado pelo knockdown duplo.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram perda ou ganho de função para células de uma linhagem específica por meio do exame do repórter da linhagem ou da análise da expressão do marcador específico da linhagem. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a combinação de nocautes no modelo de camundongo, é que dois ou até três genes podem ser direcionados no modelo de peixe simplesmente combinando morfos validados em um único experimento. Mais de 100 embriões podem ser injetados e fenótipos avaliados ao longo de vários dias.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave. Na biologia do desenvolvimento, como a definição das vias transcricionais que controlam o destino celular, as principais vias regulatórias são frequentemente representadas por pequenas famílias de genes relacionados que são funcionalmente redundantes. Seu papel, portanto, não é evidente nos estudos de nocaute em camundongos devido à compensação de Sister Genes.

Embora este modelo possa fornecer informações sobre a embriogênese do peixe-zebra, os resultados podem ser aplicados a outros sistemas, como camundongos, uma vez que os mesmos programas genéticos são tipicamente bem conservados ao longo da evolução. Prepare as placas de microinjeção antes de injetar embriões. Despeje aproximadamente 12 mililitros de 2%agros na água do sistema, que é a água limpa retirada diretamente do sistema do tanque de peixes para a tampa invertida de uma placa de Petri de 100 milímetros.

Coloque duas lâminas de microscópio em ângulos de aproximadamente 45 graus nos dois lados da tampa. Quando o agros solidificar, puxe suavemente as lâminas para longe da tampa, criando calhas onde os embriões descansarão durante a injeção morfo fo, nenhum caule é mantido em temperatura ambiente a uma concentração de um milimolar e água destilada destilada estéril Antes da injeção. Incube os estoques de morphos a 65 graus Celsius por cinco minutos para garantir que estejam completamente em solução.

Deixe os caldos esfriarem até a temperatura ambiente. Cada morfo recém-projetado deve ser empiricamente validado quanto à atividade e tolerância embrionária. Em tubos de microcentrífuga, comece com uma a duas diluições em série do morfo estoque em água destilada e deionizada, produzindo concentrações de trabalho de um milimolar, 0,5 milimolar, 0,25 milimolar e 0,125 milimolar.

Sob um escopo de dissecação, use a sucção para carregar uma agulha de injeção calibrada que foi conectada ao micromanipulador e posicionada corretamente. Carregue a agulha com aproximadamente um microlitro da solução morpho de menor concentração. Use uma pipeta de transferência para mover embriões fertilizados de uma célula para as calhas da placa de microinjeção.

Use a pipeta para remover o excesso de água da placa para que os embriões caiam no fundo do cocho. Posicione a placa de injeção sob o microscópio, desça a agulha através do córion e entre na gema. Injete cada embrião antes de remover a agulha e reposicionar a placa de injeção para acessar o próximo embrião.

Ao aprender a injetar, pode ser útil usar um corante vital para visualizar a injeção na célula, como mostrado aqui, transferir os embriões de volta para uma placa de Petri de 100 milímetros com o sistema de cultivo de água a 28,5 graus Celsius. Expulse qualquer solução de morfo restante da agulha e encha-a com o próximo morfo de concentração mais alta para injetar o próximo lote de embriões em um estágio apropriado de desenvolvimento. Examine os embriões em busca de fenótipos em cada concentração morfológica injetada.

A dose limite para cada morfo é a dose mais baixa na qual existe um fenótipo confiável definido. Várias rodadas de titulação podem ser necessárias para definir o limite impreciso. Procurar uma interação genética entre dois genes distintos.

Preparar uma mistura de dois morfos de interesse, cada um com a respectiva concentração limiar. É importante ter em mente que os embriões podem não tolerar mais de 20 nanogramas de morfo total por injeção. Injete os embriões da mesma maneira que antes.

Manter os volumes de injeção constantes entre os grupos experimental e de controlo, que devem incluir conjuntos injectados com cada morfo isoladamente ao microscópio de dissecação. Monitore os embriões injetados imediatamente após a injeção e várias vezes ao longo do dia, use uma pipeta de transferência para remover quaisquer embriões mortos ou moribundos. Uma vez que estes podem comprometer a viabilidade das morfinas restantes com uma pipeta de transferência move-se, embriões sedados ou eutanasiados a qualquer momento.

Aponte para um slide de depressão para observação. Para fotografia. Use uma pinça afiada para remover o corion, se necessário.

Estabilize o embrião em uma gota de embriões de tela de 3% de metilcelulose para um fenótipo distinto, exclusivo para a combinação de morfos, em oposição a uma maior penetrância do fenótipo de morfinas simples. Aqui estão vários embriões do tipo selvagem quando injetados com morfos no limiar. Para gata cinco, o fenótipo típico é cardio bífida ou dois corações, porque os progenitores não conseguiram se fundir na linha média.

Observe os cardiomiócitos positivos para GFP indicados pelas setas. O fenótipo de seis morfinas inclui corações deformados que não se enrolam adequadamente. Esses embriões também desenvolvem cardiomiócitos positivos para GFP.

No entanto, os embriões injetados com uma combinação de gata cinco e gata seis morfos mostrados aqui. Exibir perda total do desenvolvimento de cardiomiócitos, indicando que gata cinco ou gata seis devem ser expressos para que os cardiomiócitos se desenvolvam. Os dois genes são funcionalmente redundantes para a especificação de cardiomiócitos.

Ao tentar este procedimento, é importante primeiro validar totalmente seus morfos e ter a maior certeza possível de que eles representam um verdadeiro knockdown de um único alvo de gene após este procedimento. Outros métodos, como a combinação de alelos nulos condicionais de camundongos, podem ser realizados para mostrar que os mesmos genes funcionam. Da mesma forma em mamíferos.

Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar se dois genes são funcionalmente redundantes durante a embriogênese.