Name: Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações e sinalização moleculares de plantas/microorganismos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda um sistema hidropônico de co-cultivo para estudar interações planta-microorganismo e sinalização molecular usando Arabidopsis thaliana e Agrobacterium tumefaciens. Este método permite análises simultâneas de respostas recíprocas em ambiente controlado que imita condições naturais.

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Gostaríamos de agradecer Brian Weselowski e Alexander W. Eastman por sua ajuda e discussão útil. Também gostaríamos de agradecer aos Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui e Greg Thorn por sua ajuda, discussões úteis e leitura crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pela Agricultura e Agroalimentar Canadá, Growing Forward-AgriFlex (RBPI número 2555) e Growing Forward II projeto número 1670, conduzido pelos autores como parte de suas funções. Este estudo também foi parcialmente financiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (CRSNG) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 concedido a ZC Yuan.

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Os autores não têm nada a revelar.

Dada a natureza gradual da secreção de raízes, a concentração de produtos químicos indutores de virulência produzidos em planta e seus efeitos sobre interações dinâmicas de plantas e micróbios ocorrem em gradientes espaciais e temporais. Neste sistema de co-cultivo hidropônico, não é suplementada nenhuma fitohormona sintética ou química que induz virulência microbiana ou defesas de plantas. Em contraste, usando abordagens convencionais, a adição de produtos químicos sintéticos, como a acetossiringona, cria um a...

Os micróbios associados à planta desempenham papéis importantes no ciclismo biogeoquimico, na biorremediação, na mitigação das alterações climáticas, no crescimento e na saúde das plantas e na tolerância das plantas aos estresses bióticos e abióticos. Os microorganismos interagem com as plantas diretamente através do contato da parede celular da planta e indiretamente através de secreção química e sinalização 1 , 2 , 3 . Como organismos sésseis, as plantas desenvolveram mecanismos diretos e indiretos para resistir à infecção por agentes patogênicos. As defesas diretas incluem defesas estruturais e a expressão de proteínas de defesa, enquanto que as defesas indiretas incluem a produção secundária de metabólitos das plantas e a atração de organismos antagônicos aos patógenos invasores 4 , 5 . Os exsudados de raiz derivados de plantas, secreções, mucilagens, mucigel e lisados ​​alteram as propriedades físico-químicas da rizosfera para atrair ou repelirMicróbios em relação aos seus anfitriões 6 . A composição química da secreção de raízes é específica da espécie, servindo assim como um filtro seletivo que permite que certos microrganismos capazes de reconhecer esses compostos florescerem na rizósfera 6 . Assim, espécies microbianas compatíveis podem ser estimuladas para ativar e melhorar suas associações, quer para benefício ou prejuízo do hospedeiro da planta 1 . Compreender as interações planta-microbio na rizósfera é fundamental para melhorar a produtividade da planta e o funcionamento do ecossistema, uma vez que a maioria da exposição microbiana e química ocorre na estrutura radicular e na interface solo-ar 2 , 6 , 7 , 8 . No entanto, o exame das interações subterrâneas de plantas e micróbios e respostas recíprocas tem sido um desafio devido à sua intrigante<html> Natureza complexa e dinâmica e falta de modelos experimentais adequados com estrutura radicular natural e morfologia da planta sob condições de crescimento bem controláveis. Como um dos agentes farmacêuticos mais bem estudados, Agrobacterium infecta uma grande variedade de plantas com importância agrícola e horticultural, incluindo cereja, maçã, pera, uva e rosa 9 . Agrobacterium é um organismo modelo importante para a compreensão das interações planta-patógeno e é uma ferramenta poderosa na transformação de plantas e engenharia de plantas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 . As interacções Molecular Plant- Agrobacterium foram bem estudadas há várias décadas e a compreensão atual da patogenicidade de Agrobacterium é extensa 9 ,F. &quot;&gt; 11 , 15 , 16. A patogenicidade de Agrobacterium é em grande parte atribuída às suas capacidades evoluídas de percepção de sinais derivados de plantas, resultando na modulação fina de seu programa de virulência e comunicação célula a célula, o chamado sensor de quorum 17 . O programa Agrobacterium virulence é regulado por vários sinais disponíveis na rizosfera e envolve dois conjuntos de sistemas de 2 componentes, o sistema ChvG / I eo sistema VirA / G. As condições ácidas na rizósfera ativam a transcrição de chvG / I , virA / G , E vários outros genes envolvidos na patogenicidade de Agrobacterium , incluindo virE0 , virE1 , virH1 , virH2 e genes do sistema de secreção de tipo VI (T6SS) 18. Compostos fenólicos derivados de plantas, incluindo a aceossiringona (4&#39;-hidroxi-3 &#39;, 5 &#39;-dimetoxiacetofenona), ative o VSistema IrA / G de 2 componentes através de mecanismos de sinalização de fosforilação 19 . VirA / G ativa então todo o regulador vir , resultando na transferência e integração de um fragmento de DNA bacteriano de ~ 20 kb chamado DNA de transferência (DNA-T) do plasmídeo indutor de tumor (Ti) para o núcleo da planta 16 . T-DNA carrega genes responsáveis ​​pela síntese dos hormônios vegetais ácido indol-3-acético (IAA) ( iaaM e iaaH ) e citoquinina ( ipt ), e uma vez expressa em células vegetais, produzem-se grandes quantidades dessas fitohormonas. Isso resulta em proliferação anormal de tecidos e desenvolvimento de tumores vegetais, conhecida como doença coronária, que é um problema crônico e ressurgente para as plantas 9 , 11 , 20 . IAA também atua coletivamente com ácido salicílico e ácido gamma-amino butírico para reprimir a virulência de Agrobacterium ou para reduzir Agrobacteriu<html> M quorum sensing (QS) 17 , 21 , 22 . Para contrariar essa repressão, o T-DNA também contém genes para a biossíntese de opina, que ativa o Agrobacterium quorum detectando para promover a patogenicidade de Agrobacterium e também serve como fonte de nutrientes para o patógeno 22 , 23 . Apesar de uma compreensão geral e profunda das interações de plantas de Agrobacterium e da transferência de T-DNA resultante para o hospedeiro da planta, os complexos eventos de sinalização na fase inicial de interação são menos bem compreendidos. Isto é parcialmente devido às limitações das abordagens convencionais para investigar a sinalização das plantas de Agrobacterium . As culturas em suspensão de células vegetais e os ferimentos artificiais específicos do local são comumente usados ​​para estudar interações moleculares de plantas e micróbios 24 ,. ef &quot;&gt; 26, 27 No entanto, as suspensões de células não possuem morfologia da planta normal, em particular, as células em suspensão planta não tem estruturas de raiz e exsudatos de raízes, que são muito importantes para a activação de quimiotaxia microbiana e virulência 28, 29 A manutenção da morfologia da planta. E a estrutura da raiz foi abordada por feridas artificiais, o que facilita a infecção específica do local, resultando na detecção de genes induzidos por defesa da planta em tecido de plantas infectadas diretamente 30 , 31. Contudo, o ferimento artificial é significativamente diferente da infecção por patógenos na natureza , Particularmente como ferimento leva ao acúmulo de ácido jasmônico (JA), que interfere sistematicamente com a sinalização e defesa de plantas naturais 26. Além disso, os produtos químicos sintéticos são tipicamente usados ​​para induzir artificialmente as respostas do hospedeiro da plantaOu virulência de patógenos. Embora seja possível a suplementação de compostos químicos que refletem as concentrações em planta , essa suplementação não explica gradualmente a difusão de exsudatos radiculares na rizósfera circundante, o que gera um gradiente quimiotático detectado pelos micróbios 28 , 32 . Dadas as limitações das abordagens convencionais para estudar as interações planta-microbio, a precisão e a profundidade dos dados obtidos podem ser impedidas e restritivas e o conhecimento gerado a partir das abordagens convencionais pode não se traduz diretamente na planta . Muitos aspectos da sinalização das plantas - Agrobacterium ainda não são totalmente compreendidos, particularmente no estágio inicial das interações, quando os sintomas da doença ainda não se desenvolveram. Para alterar as limitações das abordagens convencionais, este trabalho apresenta um c hidroponico barato, bem controlável e flexívelSistema de ocultivação que permite aos pesquisadores obter informações mais aprofundadas sobre as vias complexas de sinalização e resposta no estágio inicial das interações de plantas-micróbios moleculares. O hidroponia tem sido amplamente utilizado para estudar nutrientes de plantas, exsudatos radiculares, condições de crescimento e os efeitos da toxicidade metálica nas plantas 33 , 34 . Existem várias vantagens dos modelos hidropônicos, incluindo os pequenos requisitos espaciais, a acessibilidade de vários tecidos vegetais, o controle rigoroso das condições nutrientes / ambientais e o controle de pragas / doenças. Os sistemas hidropônicos também são menos limitantes para o crescimento das plantas em comparação com as técnicas de revestimento em ágar / fitoagulação, que geralmente restringem o crescimento após 2-3 semanas. Importante, a manutenção de estruturas de plantas inteiras facilita a secreção de raízes naturais necessárias para a quimiotaxia microbiana e indução de virulência 8 , 29 . O sistema descriA cama aqui é mais simples e menos intensiva em mão-de-obra do que as alternativas 33 , 34 . Ele usa menos peças e não requer ferramentas além das tesouras padrão. Ele usa malha de metal (em oposição ao nylon 33 ) como um forte suporte para o crescimento da planta e um método simples de aeração sob condições estéreis através de agitação para suportar o crescimento microbiano. Além disso, o sistema pode usar malhas metálicas de vários tamanhos para suportar o crescimento da planta, que acomoda diversas espécies de plantas sem restringir a largura de suas raízes. No sistema de cocultivação hidropônica apresentado aqui, as plantas são cultivadas em um sistema hidropônico estéril onde as raízes das plantas secretam compostos orgânicos que suportam o crescimento de bactérias inoculadas. Neste sistema de cocultivação, não são suplementados produtos químicos artificiais, como hormonas de plantas, elicitores de defesa ou produtos químicos indutores de virulência, que refletem a célula natural- assinalando a homeostase durante as interações planta-micróbio. Com este sistema de cocultivação hidropônica, foi possível determinar simultaneamente a expressão gênica no tecido da raiz de Col-0 de Arabidopsis thaliana após a infecção por Agrobacterium , bem como a ativação de genes de Agrobacterium após a cocultivação com Arabidopsis . Demonstrou-se ainda que este sistema é adequado para estudar a ligação de Agrobacterium às raízes das plantas, bem como o perfil secreto da raiz da planta, após a cocultivação (infecção) com Agrobacterium ( Figura 1 ). <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral do sistema de cocultivação hidropônica, com análises de amostras. As plantas são cultivadas em cima da malha (brotos acima da malha), com as raízes imersas em meio hidropônico que é então inoculado com bactérias fOu coculture. Os tecidos vegetais e as bactérias são então separados para extrações e análises simultâneas. Esta figura foi modificada a partir da referência 35 .

<table><tbody><tr><td>sementes de plantas (Arabidopsis thaliana Col-0)</td><td>Arabidopsis Biological Resource Center</td><td>CS7000</td><td></td></tr><tr><td>https://abrc.osu.edu/order-stocks bactérias (Agrobacterium tumefaciens C58)</td><td>Universidade de Washington</td><td>N/A</td><td></td></tr> bactérias <tr><td>rotuladas</td><td>internamente</td><td></td><td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>vórtice</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga</td><td>(Vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>(Vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de Sódio a 5%</td><td>(Vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água Duplamente Destilada</td><td>(Vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>(Vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta&nbsp;</td><td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>etanol 70%</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Murashige e Skoog (MS) sais basais</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MES</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mistura de vitaminas B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri profundas</td> <td>(várias)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>malha de aço inoxidável</td><td>Ferrier Wire Goods Company Ltd</td><td>N / A</td><td>grau: 304; contagem de malha: 40 &vezes; 40; diâmetro do fio: 0,01</td></tr><tr><td>fita micropore, 1 "</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>câmara de crescimento diurno</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tanques de vidro cilíndricos, 100 &ampvezes; 80 mm&nbsp;</td><td>Pirex</td><td>3250</td><td>outros tamanhos podem ser usados, caso em que o conteúdo líquido pode precisar de ajuste</td></tr><tr><td>capa de fluxo</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>forcepts</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>extrato de levedura</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>triptona</td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MgSO 4 </td> <td>(vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agitador incubadora</td><td>(vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>espectrofotômetro</td><td>(vários)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>(vários)</td>agitador(vários)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tesoura(</td><td>vários)</td><td></td><td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>microscópio de fluorescência</td><td>(vários)</td><td></td><td>opcional, depende de downstream analisa</td></tr><tr><td>lâminas de microscópio e lamínulas</td> <td>(várias)</td><td></td> <td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>esmalte</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>Kit de extração de RNA bacteriano</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>kit de extração de RNA de planta (RNeasy Plant Mini Kit)</td> <td>Qiagen</td><td>74903 ou 74904</td><td>opcional, depende do material e do equipamento das análises a jusante</td></tr><tr><td>para qRT-PCR</td> <td>(vários)</td><td></td> opcional, depende do material e do equipamento das <td>análises a jusante</td></tr><tr><td>para a análise do microarray</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende das análises a jusante</td></tr><tr><td>nitrogênio líquido</td> <td>(vários)</td><td></td> opcional, depende do almofariz e do pilão das <td>análises a jusante</td></tr> <tr><td></td><td>(vários)</td><td></td><td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtro de poros</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>50 mL tubos cônicos</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>liofilizador</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>tubos de ensaio seláveis</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende de análises a jusante</td></tr><tr><td>acetato de etila</td> <td>(vários)</td><td></td><td>opcional, depende das análises a jusante</td></tr><tr><td>gás nitrogênio</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende das análises a jusante</td></tr><tr><td>material e equipamento para HPLC</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende das análises a jusante</td></tr><tr><td>material e equipamento para ESI-TOF-MS</td> <td>(vários)</td><td></td> <td>opcional, depende das análises a jusante</td></tr></tbody></table>

um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

Um projeto experimental que imita as interações planta-microbio natural é muito importante para delinear os complexos processos de sinalização de plantas e micróbios. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Fornece um excelente sistema modelo para estudar a patogênese bacteriana e as interações das plantas. Estudos prévios das interações de plantas e antibacterianos dependeram em grande parte das culturas de suspensão de células vegetais, do ferimento artificial de plantas ou da indução artificial de fatores de virulência microbiana ou defesas de plantas por produtos químicos sintéticos. No entanto, esses métodos são distintos da sinalização natural in planta , onde plantas e micróbios reconhecem e respondem de maneiras espaciais e temporais. Este trabalho apresenta um sistema de cocultivação hidropônica onde as plantas intactas são suportadas por telas de malha metálica e coculadas com Agrobacterium . Neste sistema de cocultivação, nenhuma fitohormona sintética ou química que induz micr.A virulência obial ou a defesa da planta são complementadas. O sistema de cocultivação hidropônica parece muito parecido com as interações planta-micróbio natural e sinalização da homeostase na planta . As raízes das plantas podem ser separadas do meio contendo Agrobacterium , e a sinalização e as respostas dos hospedeiros da planta e dos micróbios que interagem podem ser investigadas simultaneamente e sistematicamente. Em qualquer ponto / intervalo de tempo dado, os tecidos ou bactérias da planta podem ser colhidos separadamente para várias análises &quot;ôticas&quot;, demonstrando o poder e a eficácia deste sistema. O sistema de co-cultura hidropónica pode ser facilmente adaptado para estudar: 1) a sinalização recíproca dos diversos sistemas de planta e microorganismos, 2) a sinalização entre uma planta hospedeira e várias espécies microbianas (ou seja consórcio microbiano ou microbiomas), 3) como nutrientes e produtos químicos estão implicados Na sinalização de microbios vegetais e 4) como os micróbios interagem com os hospedeiros da planta e contribuem para a tolerância das plantas ao biotico oEstresses abióticos.

Crescimento no sistema de co-cultivo hidropônico A curva de crescimento de A. tumefaciens C58 demonstrou uma fase de atraso significativo no inicial 16 h de co-cultura, seguido por um crescimento muito estável quando co-cultivadas com A. thaliana Col-0, até uma OD máxima de 600 de cerca de 0,9 a partir de 48 horas pós-inoculação. Em contraste, essencialmente nenhum crescimento bacteriano foi observado...

O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

O objetivo geral deste sistema é estudar as interações e respostas recíprocas de sinalização entre plantas e microrganismos associados, ou as respostas das plantas a produtos químicos ou fatores abióticos, em uma configuração experimental simples que imita de perto o ambiente natural. Este vídeo mostra a cocultura de plantas com a bactéria Agrobacterium tumefaciens. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre interações microbianas em plantas, resposta ao estresse microbiano ou das plantas e sinalização molecular, incluindo sinalizações complexas já em estágios iniciais das interações microbianas das plantas.A principal vantagem desta técnica é que ela ajuda a compreender a sinalização e a resposta na interação microbiana de uma planta, em uma configuração simples que inclui a simulação do ambiente natural. Embora este método possa ser usado para obter informações sobre as interações da planta com uma única espécie microbiana, também pode ser empregado para estudar as interações da planta com múltiplas espécies microbianas ou com fatores abióticos. Tivemos a ideia para este método ao buscar compreender a homeostase da sinalização celular durante interações planta-microbe que simulam de perto situações naturais.Para iniciar o experimento, as sementes devem ser esterilizadas. Para Arabidopsis thaliana, combine aproximadamente 200 sementes com 500 microlitros de água deionizada em um tubo de microcentrífuga e agite o tubo em velocidade alta. Centrifugue o tubo a 9000 x g por 30 segundos em uma microcentrífuga de bancada.Usando uma pipeta, remova o sobrenadante aquoso. Em seguida, adicione 300 microlitros de hipoclorito de sódio a 2% às sementes e agite em vórtex. Deixe a mistura decantar à temperatura ambiente.Após um minuto, centrifugue as sementes. Com a pipeta, remova a solução de hipoclorito de sódio. Em seguida, adicione 500 microlitros de água estéril e deionizada às sementes e vortexe a mistura.Após centrifugar o tubo, remova a água. Adicione 500 microlitros de etanol 70% às sementes e vortexe a mistura. Após deixar as sementes sedimentarem por um minuto, centrifugue o tubo.Remova o etanol 70% usando uma pipeta. Lave as sementes cinco vezes com 500 microlitros de água estéril desionizada. Em seguida, re-suspenda as sementes esterilizadas em 500 microlitros de água estéril ultra pura.Despeje 25 mililitros de meio Murashige e Skoog, ou meio MS, com concentração reduzida à metade e 04% de ágar fito, em cada placa de Petri estéril e funda. Para cada placa de Petri, recorte um quadrado de malha de aço inoxidável medindo 90 milímetros por 90 milímetros. Dobre levemente os cantos de cada malha quadrada, apenas o suficiente para que a malha se encaixe dentro da placa de Petri.Dobre as bordas em um ângulo de 90 graus em relação à parte principal da malha, para que a malha possa ser sustentada pelas bordas, deixando espaço suficiente abaixo para o desenvolvimento das raízes. Coloque os quadrados de malha recortados em um béquer e cubra-os com papel alumínio. Esterilize os quadrados de malha em autoclave utilizando um ciclo seco de 30 minutos.Uma vez que o meio tenha solidificado nas placas de Petri e a malha esteja estéril, coloque cada quadrado da malha sobre o meio sólido com os cantos dobrados voltados para baixo. Pressione a malha para que os cantos penetrem no meio e a maior parte da malha toque a superfície superior do meio. Em seguida, utilize uma pipeta estéril de 200 microlitros para aspirar as sementes individuais de A thaliana previamente esterilizadas na superfície e transferir suavemente cada semente sobre a malha.Coloque as sementes de forma que fiquem espaçadas de acordo com a espécie da planta e as necessidades experimentais. Tampe as placas de Petri com suas tampas e coloque fita cirúrgica porosa ao redor das bordas das placas. Envolva as sementes em papel alumínio.Realize a estratificação das sementes colocando todo o recipiente de Petri. Após dois dias, cultive as sementes no recipiente de Petri a 22 a 24 graus Celsius com um período fotoperiódico de 16 horas por 10 a 14 dias. Em uma câmara de fluxo esterilizada, adicione 18 mililitros de meio MS líquido autoclavado em frascos de vidro cilíndricos estéreis com tampas estéreis.Em seguida, utilize pin&ccedil;as est&eacute;reis para transferir suavemente cada quadrado de malha com pl&acirc;ntulas de 10 a 14 dias de idade da placa de Petri com meio semiss&oacute;lido para um tanque cil&iacute;ndrico hidrop&ocirc;nico. As pl&acirc;ntulas mostradas aqui s&atilde;o de alfafa. Feche as tampas dos tanques utilizando fita cir&uacute;rgica porosa.Em seguida, cultive as plântulas a 22 a 24 graus Celsius com um fotoperíodo de 16 horas e agitação a 50 rpm. Antes da inoculação, examine cuidadosamente o tanque com as plântulas em busca de qualquer contaminação potencial. O meio nos tanques não contaminados deve estar límpido e transparente.Se os tanques estiverem turvos devido à contaminação, descarte-os e numere os demais tanques. Retire uma amostra de 20 microlitros do meio hidropônico de cada tanque numerado e aplique-a em uma placa de Petri contendo caldo Luria ou ágar LB. Incube a placa a 28 graus Celsius por 28 horas.Inocule imediatamente cada tanque hidropônico numerado com 50 microlitros da suspensão de agrobacterium tumefaciens em cada tanque hidropônico numerado. Co-cultive as plântulas e a bactéria A tumefaciens a 22 a 24 graus Celsius com um período fotoperiódico de 16 horas e agitação a 50 rpm. Examine a placa de LB com colônias após 12 e 28 horas de incubação para verificar a esterilidade do meio de crescimento hidropônico.Se houver alguma contaminação, não utilize o tanque numerado correspondente inoculado com bactérias para ensaios subsequentes. Em seguida, separe as raízes da suspensão bacteriana levantando a placa de malha. Se for utilizar as raízes para análises posteriores, corte-as, enxágue rapidamente em água destilada duplamente fervida e seque em papel filtro esterilizado.Se estiver usando folha ou outro tecido, corte o tecido. Para análise de transcritos vegetais, as raízes ou brotos devem ser imediatamente depositados em nitrogênio líquido. Para análise de transcritos bacterianos, transfira 1,5 mililitros da cultura do tanque de co-cultivo e pelote as células por centrifugação.Após um co-cultivo apropriado, use tesoura estéril para separar as raízes secundárias individuais, os ramos laterais da raiz principal. Em seguida, lave as raízes em água duplamente destilada para remover materiais fracamente ligados. Mergulhe cada raiz em 30 microlitros de água sobre uma lâmina de microscópio e cubra com uma lamínula de vidro.Selar as bordas da lamínula com esmalte para proteger as raízes contra desidratação. Em seguida, visualizar a adesão de A tumefaciens às raízes de A thaliana por microscopia de fluorescência. Após um co-cultivo apropriado, separar as plantas do meio hidropônico.Sterilize os 18 mililitros do meio hidropônico passando-o por um filtro com poros de 0,2 mícrons para tubos cônico de 50 mililitros. Congele as amostras a 80 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, afrouxe as tampas dos tubos cônico de 50 mililitros e coloque-os em uma máquina de liofilização por 36 horas.Por fim, prossiga para armazenar ou processar as amostras para análise por CLAE e detecção de compostos. Sem nutrientes fornecidos artificialmente, A tumefaciens c58 cresceu no sistema de co-cultivo. Em contraste, essencialmente nenhum crescimento bacteriano foi observado na cultura controle sem A thaliana.Os sistemas de co-cultivo hidropônico podem ser utilizados para estudar a adesão de bactérias à estrutura da raiz, conforme observado nesta visualização microscópica, na qual bactérias marcadas com fluorescência vermelha PCherry foram localizadas na estrutura da raiz da planta com formato típico semelhante a rochas ou filamentoso. Os perfis de expressão gênica de plantas e microrganismos interagentes podem ser determinados por qRT-PCR. Após oito horas de co-cultivo, células de oito tumefaciens revelaram uma up-regulação na expressão de genes de virulência.Ao mesmo tempo, as raízes de A thaliana revelaram expressão gênica diferencial em resposta ao co-cultivo. Após 72 horas de co-cultivo, 35 compostos foram aumentados e 76 compostos foram reduzidos no secretoma das plantas inoculadas em comparação com o controle. Esta técnica abre caminho para que pesquisadores estudem as interações planta-microorganismo e explorem as respostas recíprocas entre planta e microrganismo ou parceiros do microbioma, ou as respostas da planta a fatores abióticos em uma configuração simples que imita de perto o ambiente natural.Depois de assistir a isso com você, esperamos que seja capaz de montar um sistema de co-cultivo microbiano vegetal em hidroponia para estudar plantas moleculares, interações microbianas e as respostas de sinalização em um ambiente mais natural e controlável.

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Biology

Biologia

Fonte: Nathoo, N., et al. Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações moleculares e sinalização planta/micróbio. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra um sistema de co-cultivo hidropônico para estudar as interações planta-bactéria em condições estéreis. As mudas das plantas são transferidas para um meio de crescimento ácido estéril, incubadas e inspecionadas quanto à contaminação antes da inoculação com Agrobacterium. As bactérias ativadas se...

Um sistema de co-cultivo para estudar as respostas moleculares de hospedeiros vegetais e bactérias em interação

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Aqui, apresentamos um protocolo fácil de seguir para estabelecer um sistema hidropônico bem-sucedido para estudos de nutrição de plantas. Este protocolo foi extensivamente testado em Arabidopsis e pode ser facilmente adaptado a outras espécies de plantas para estudar necessidades nutricionais específicas ou o efeito de elementos não essenciais no crescimento e desenvolvimento das plantas.

Hidroponia: um sistema versátil para estudar nutrientes de alocação e de plantas As respostas a disponibilidade de nutrientes e exposição a elementos tóxicos

Este artigo descreve protocolos detalhados para fabricação de ecossistema de dispositivos (EcoFABs) que permitem que os estudos de plantas e as interações planta-micróbio em condições de laboratório altamente controlado.

Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio

Um sistema hidropónico simples, versátil e baixo custo em vitro foi otimizado com sucesso, possibilitando experiências em grande escala, sob condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em uma solução e sua eficiente absorção pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicas e fisiológicas.

Um flexível baixo custo sistema hidropônico para avaliar as respostas de planta para pequenas moléculas em condições estéreis

Aqui nós descrevemos um ensaio hidropônico do crescimento de planta para quantificar a presença da espécie e para visualizar a distribuição espacial das bactérias durante a colonização inicial de raizes de planta e após sua transferência em ambientes diferentes do crescimento.

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.

Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

Apresentamos um protocolo para um sistema experimental semihidropônico à base de vidro que suporta o crescimento de uma variedade de plantas filogeneticamente distintas com ou sem micróbios. O sistema é compatível com diferentes meios de crescimento e permite a amostragem não destrutiva de exsudato radicular para análise a jusante.

Um Sistema de Jarra de Vidro Versátil para Perfil de Exsudato de Raiz Semihidropônico

Este protocolo descreve como usar o Sistema Ômico de Cultura de Microlitros de Célula Única (célula MISS) para realizar isolamento, cultivo e colheita monoclonal microbiana. A célula MISS alcança um fluxo de trabalho integrado baseado na tecnologia microfluídica de gotículas, que oferece excelente monodispersão de gotículas, alto cultivo paralelo e detecção de biomassa de alto rendimento.

Cultivo e colheita monoclonal microbiana automatizada e de alto rendimento usando o sistema ômico de cultura de gotículas de microlitro de célula única

Aprenda um sistema hidropônico de co-cultivo para estudar interações planta-microorganismo e sinalização molecular usando Arabidopsis thaliana e Agrobacterium tumefaciens. Este método permite análises simultâneas de respostas recíprocas em ambiente controlado que imita condições naturais.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações e sinalização moleculares de plantas/microorganismos (Vídeo) | JoVE Journal

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

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