Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações e sinalização moleculares de plantas/microorganismos

O objetivo geral deste sistema é estudar a interação de sinalização recíproca e as respostas entre a planta e os microparceiros ou as respostas da planta a produtos químicos ou fatores abióticos em uma configuração simplesmente experimental que imita de perto o ambiente natural. Este vídeo mostra o co-cultivo de plantas com a bactéria Agrobacterium tumefaciens. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nas interações microbianas das plantas, na resposta microbiana ou ao estresse das plantas e na sinalização molecular, incluindo sinalização complexa, mesmo em um estágio inicial das interações microbianas de uma planta.

A principal vantagem dessa técnica é que ela ajuda a entender a sinalização da natureza e a resposta das interações microbianas de uma planta, em uma configuração simples que inclui a imitação do ambiente natural. Embora esse método possa ser usado para fornecer informações sobre as interações das plantas com uma única espécie microbiana, ele também pode ser usado para estudar as interações das plantas com várias espécies microbianas ou com fatores abióticos. Tivemos a ideia desse método enquanto procurávamos a homeostase da sinalização celular durante as interações entre micróbios e plantas que imitam de perto as situações naturais.

Para iniciar o experimento, as sementes devem ser esterilizadas. Para Arabidopsis thaliana, combine aproximadamente 200 sementes com 500 microlitros de água deionizada em um tubo de microcentrífuga e faça um vórtice do tubo em alta velocidade. Centrifugue o tubo a 9000 x g por 30 segundos em uma microcentrífuga de mesa.

Usando uma pipeta, remova o sobrenadante de água. Em seguida, adicione 300 microlitros de hipoclorito de sódio a 2% às sementes e faça um vórtice. Deixe a mistura repousar em temperatura ambiente.

Após um minuto, centrifugue as sementes. Com a pipeta, remova a solução de hipoclorito de sódio. Em seguida, adicione 500 microlitros de água deionizada estéril às sementes e vortex a mistura.

Depois de centrifugar o tubo, remova a água. Adicione 500 microlitros de etanol a 70% às sementes e vortex a mistura. Depois de deixar as sementes assentarem por um minuto, centrifugue o tubo.

Remova o etanol 70% usando uma pipeta. Lave as sementes cinco vezes com 500 microlitros de água deionizada estéril. Em seguida, ressuspenda as sementes esterilizadas em 500 microlitros de água estéril e ultrapura.

Despeje 25 mililitros de Murashige e Skoog de meia força, ou meio MS com ágar 04% de fito em cada placa de Petri estéril e profunda. Para cada placa de Petri, corte um quadrado de 90 milímetros por 90 milímetros de malha de aço inoxidável. Dobre os cantos de cada malha quadrada apenas o suficiente para que a malha caiba dentro da placa de Petri.

Dobre os cantos em um ângulo de 90 graus em relação à maior parte da malha para permitir que a malha seja apoiada pelos cantos, deixando espaço suficiente abaixo para o desenvolvimento da raiz. Coloque os quadrados de malha cortados em um copo e cubra-os com papel alumínio. Esterilize os quadrados de malha em autoclavagem usando um ciclo de secagem de 30 minutos.

Uma vez que o meio tenha solidificado nas placas de Petri e a malha esteja estéril, coloque cada quadrado de malha em cima do meio sólido com os cantos dobrados voltados para baixo. Empurre a malha para que os cantos penetrem no meio e a maior parte da malha toque a superfície superior do meio. Em seguida, use uma pipeta estéril de 200 microlitros para retirar as sementes individuais de A thaliana esterilizadas na superfície e transfira suavemente cada semente para o topo da malha.

Coloque as sementes de forma que fiquem espaçadas de acordo com a espécie de planta e as necessidades experimentais. Sele as placas de Petri com tampas e coloque fita cirúrgica porosa ao redor das bordas das placas. Embrulhe as sementes em papel alumínio.

Estratificar as sementes colocando toda a placa de Petri. Após dois dias, cultive as sementes na placa de Petri a 22 a 24 graus Celsius com um período fotográfico de 16 horas por 10 a 14 dias. Em uma coifa esterilizada, despeje 18 mililitros de meio MS líquido autoclavado em tanques de vidro cilíndricos estéreis com tampas estéreis.

Em seguida, use uma pinça estéril para transferir suavemente cada quadrado de malha com mudas de 10 a 14 dias da placa de Petri de meio semi-sólido para um tanque cilíndrico hidropônico. As mudas mostradas aqui são alfafa. Sele as tampas nos tanques usando fita cirúrgica porosa.

Em seguida, cultive as mudas a 22 a 24 graus Celsius com um período fotográfico de 16 horas e agitando a 50 rpm. Antes da inoculação, examine cuidadosamente o tanque com mudas para verificar se há qualquer contaminação potencial. O meio nos tanques não contaminados deve ser claro e transparente.

Se os tanques estiverem turvos com contaminação, descarte-os e numere o restante dos tanques. Amostra de 20 microlitros de meio hidropônico de cada tanque numerado e localize-o em uma placa de Petri com caldo Luria ou ágar LB. Incube o prato a 28 graus Celsius por 28 horas.

Inocule imediatamente cada tanque hidropônico numerado com 50 microlitros da suspensão de agrobacterium tumefacians em cada tanque hidropônico numerado. Co-cultive as mudas e a bactéria A tumefacians a 22 a 24 graus Celsius com um período fotográfico de 16 horas e agitando a 50 rpm. Examinar a placa LB manchada após 12 e 28 horas de incubação para verificar a esterilidade do meio de cultura hidropónico.

Se houver alguma contaminação, não use o tanque numerado correspondente inoculado com bactérias para outros ensaios a jusante. Em seguida, separe as raízes da suspensão bacteriana levantando a placa de malha. Se estiver usando raízes para análises subsequentes, corte as raízes, enxágue-as rapidamente em água bidestilada e seque em papel de filtro esterilizado.

Se estiver usando folha ou outro tecido, corte o tecido. Para análise de transcritos de plantas, as raízes ou brotos devem ser imediatamente depositados em nitrogênio líquido. Para análise de transcrição bacteriana, transfira 1,5 mililitros da cultura do tanque de co-cultivo e pelete as células por centrifugação.

Após um co-cultivo apropriado, use uma tesoura estéril para separar as raízes secundárias individuais, os ramos laterais da raiz principal. Em seguida, enxágue as raízes em água bidestilada para remover o material frouxamente ligado. Mergulhe cada raiz em 30 microlitros de água em uma lâmina de microscópio e cubra-a com uma lamínula de vidro.

Sele as bordas da lamínula com esmalte para proteger as raízes da desidratação. Em seguida, visualize a ligação de A tumefacians às raízes de A thaliana por microscopia de fluorescência. Após um co-cultivo adequado, separe as plantas do meio hidropônico.

Esterilize os 18 mililitros de meio hidropônico passando-os por um filtro de poros de 0,2 mícron em tubos cônicos de 50 mililitros. Congele as amostras a 80 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, afrouxe as tampas dos tubos cônicos de 50 mililitros e coloque-os em uma liofilização por 36 horas.

Por fim, prossiga para armazenar ou processar as amostras para análise de HPLC e detecção de compostos. Sem nutrientes fornecidos artificialmente, A tumefacians c58 cresceu no sistema de co-cultivo. Por outro lado, essencialmente nenhum crescimento bacteriano foi observado na cultura de controle sem A thaliana.

Os sistemas de co-cultivo hidropônico podem ser usados para estudar a fixação de bactérias à estrutura radicular, como visto nesta visualização microscópica, onde bactérias marcadas com fluorescência vermelha foram localizadas na estrutura radicular da planta com uma forma típica de rocha ou filamenta. Os perfis de expressão gênica de postes de plantas e micróbios em interação podem ser verificados via QRTPCR. Após oito horas de co-cultivo, oito células tumefacianos revelaram regulação da expressão de genes de virulência.

Ao mesmo tempo, as raízes de A thaliana revelaram expressão gênica diferencial em resposta ao co-cultivo. Após 72 horas de co-cultivo, 35 compostos foram aumentados e 76 compostos foram diminuídos no secretoma das plantas inoculadas em comparação com o controle. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem as interações planta-micróbio e explorarem as respostas recíprocas entre planta e micróbio ou micróbio parceiros do bioma, ou respostas das plantas a fatores abióticos em uma configuração simples que imita de perto o ambiente natural.

Depois de assistir isso com você, esperamos que você seja capaz de configurar um sistema de co-cultivo microbiano de plantas em hidroponia para estudar plantas moleculares, interações microbianas e as respostas de sinalização em um ambiente mais natural e gerenciável.