Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

O objetivo geral deste procedimento é administrar oligonucleotídeos morfolidos por meio de injeções ventriculares em larvas de peixe-zebra, silenciando genes para avaliar suas funções durante a regeneração. Isso é realizado primeiramente anestesiando a larva e posicionando-a em um sulco do molde de agarose. Em seguida, a agulha de injeção é inserida no ventrículo cardíaco.

Em seguida, a solução de morfo é injetada quatro a seis vezes no ventrículo com intervalos ponderados entre os pulsos para permitir a limpeza do coração. Por fim, a nadadeira caudal é amputada e deixada regenerar por três dias. Em última instância, o efeito sobre a regeneração da nadadeira pode então ser avaliado mediante a medição da área regenerada da nadadeira utilizando a ferramenta de rastreamento de linhas do software de código aberto Fiji ImageJ.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como transgênese ou mutagênese, é que ela permite o silenciamento gênico por minos em tecidos larvais que não são adequados para injeções diretas. Usando capilares de vidro com diâmetro de 0,75 milímetro, coloque um no puxador de agulhas e puxe a agulha com os seguintes parâmetros; com pinça de relojoeiro e sob um estereoscópio com ocular micrométrica, quebre o capilar puxado para produzir uma agulha com diâmetro de 20 micrômetros. Em seguida, use um torno com uma roda de lixa de borracha acoplada para afiar a agulha e produzir um bisel de 20 micrômetros. Prepare o estoque de morpho dissolvendo o Morpho liofilizado em um XPBS para uma concentração final de 7,5 milimolar.

Misture a solução de injeção de Morpho combinando 2,5 microlitros da solução estoque de Morpho com 2,8 microlitros da solução estoque de endo Porter a um milimolar, obtendo uma concentração final de 3,5 milimolar de morph e 0,5 milimolar de endo porter, para realizar as injeções. Use uma micropipeta com ponteira de 10 microlitros para carregar a agulha de vidro biselada com cinco microlitros da solução de Morpho. Em seguida, insira a agulha de vidro no suporte de agulha do micromanipulador conectado à bomba pneumática pico.

Ajuste o ângulo das injeções para aproximadamente 45 graus, de modo que a agulha precise ser movida apenas em uma direção planar. Em seguida, configure os valores do microinjetor da seguinte forma: uma pressão de retenção de 20 libras por polegada quadrada, ou PSI, uma pressão de ejeção de 15 PSIA, um intervalo de temporização de 100 milissegundos e um valor de período de 1,9, o que corresponde a 10,9 milissegundos. Prepare 20 mililitros de ágar derretido a 1,5% em XPBS e despeje em uma placa de Petri de 10 centímetros.

Em seguida, coloque um molde de injeção ranhurado nos aros aquecidos para formar sulcos no gel endurecido e anestesiar as larvas. Coloque-as em 100 mililitros de água de aquário com 20 miligramas por litro de trican. Após cessarem a resposta ao toque, utilize uma pipeta plástica Pasteur para transferir cuidadosamente a larva para um sulco do molde de aros úmido, de modo que o lado ventral esteja voltado para a parede vertical do sulco no aros.

Posicione a placa com os embriões sob o microscópio estereoscópico de modo que o ventrículo fique voltado para longe da agulha de injeção. Em seguida, abaixe a agulha e insira-a aproximadamente um a dois micrômetros no ventrículo cardíaco, tomando cuidado para não inseri-la muito profundamente.

Em seguida, injete um pulso de três nanolitros da solução Morpho no ventrículo e aguarde para permitir a limpeza do coração antes de repetir com mais cinco pulsos. Após a injeção, remova a agulha e coloque-a em uma placa de Petri contendo um XPBS para evitar secagem. Em seguida, utilizando uma pipeta de transferência cheia com meio E três, transfira cuidadosamente as larvas de volta para uma placa de Petri contendo meio E três fresco para garantir a captação e manutenção do morpholino nas células. Repita as injeções a cada 12 a 24 horas durante toda a duração do experimento para avaliar os efeitos das injeções.

Após anestesiar os peixes, coloque-os sobre uma placa plana e úmida revestida com meio E3 antes de utilizar um microscópio estéreo com campo claro e fluorescência para obtê-los. Analise as imagens quanto à regeneração utilizando o software gratuito Fiji ImageJ, empregando a ferramenta de rastreamento de linha para determinar a quantidade de crescimento regenerativo ocorrido. Primeiro, calibre as imagens arrastando e soltando um arquivo na janela principal do Fiji no menu principal.

Defina a escala para todas as imagens clicando em analisar no menu suspenso. Clique em definir escala, depois ative a opção global marcando a caixa de seleção. Agora arraste e solte a imagem novamente para medir a quantidade de crescimento regenerativo na barra de ferramentas.

Escolha a ferramenta de seleção manual e circule a área a ser medida. Por fim, pressione Ctrl M. Isso abrirá uma nova janela de resultados mostrando o valor da área circulada em pixels quadrados. Como visto aqui, minutos após a injeção, a solução morpho endo porter se distribui pela vasculatura até diferentes tecidos, como o dobramento da nadadeira e o cérebro, por pelo menos 12 horas ou mais.

Para avaliar a regeneração de estruturas distais da nadadeira larval, foram removidas as seguintes partes: a ponta distal da prega da nadadeira e da medula espinhal, a região distal sem cordão, o músculo distal do tronco (que não é visível aqui) e as células pigmentadas, que são difíceis de atingir por injeção direta, mas parecem incorporar o morpho após injeções ventriculares seriadas. Assim, este método promove de forma relativamente simples a entrega do morpho a tecidos difíceis de serem alvejados individualmente, permitindo a avaliação da função gênica em diversos tecidos da nadadeira em regeneração ao mesmo tempo. Para analisar a importância de genes específicos envolvidos na regeneração, a nadadeira larval é parcialmente amputada e todos os tecidos que incorporaram o morpho são ressecados.

A dobra da nadadeira larval regenera sua estrutura em poucos dias após a amputação, conforme demonstrado. Aqui, o morfolito tem como alvo genes necessários para a regeneração, perturbando a resposta regenerativa em comparação com controles não injetados e controles de morfolito incompatível. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de regeneração explorarem os mecanismos moleculares envolvidos na regeneração da nadadeira de peixe-zebra.