Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

O objetivo geral deste procedimento é fornecer oligonucleotídeos morfo-enológicos por meio de injeções ventriculares na larva, nadadeira mimada e derrubar genes para avaliar sua função durante a regeneração. Isso é feito primeiro anestesiando a larva e colocando-a em uma ranhura do molde aros. Em seguida, a agulha de injeção é inserida no ventrículo cardíaco.

Em seguida, a solução morfo é injetada quatro a seis vezes no ventrículo com intervalos de ponderação entre os pulsos para permitir a limpeza do coração. Finalmente, a barbatana de mimo é amputada e deixada regenerar por três dias. Em última análise, o efeito na regeneração da barbatana pode ser avaliado medindo a área regenerada da barbatana usando a ferramenta de rastreamento de linha do software de código aberto Fiji image J.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como transgênese ou mutagênese, é que ela permite o knockdown de genes por minos em tecidos larvais que não são adequados para injeções diretas Usando capilares de vidro com um diâmetro de 0,75 milímetros, coloque um em um extrator de agulha e puxe a agulha com os seguintes parâmetros com pinças de relojoeiro, e sob um estereoscópio com uma ocular micrométrica, quebre o capilar puxado para produzir uma agulha de 20 micrômetros de diâmetro. Em seguida, use um torno com uma roda giratória de borracha para afiar a agulha e produzir um chanfro de 20 micrômetros. Prepare o morfo dissolvendo o morfo liofilizado em um XPBS até uma concentração final de 7,5 milimolares.

Misture a solução de injeção Morpho combinando 2,5 microlitros de solução estoque Morpho com 2,8 microlitros de uma solução estoque endo de Porter milimolar para uma concentração final de 3,5 millimolar morph e 0,5 milimolar endo porter para realizar injeções. Use uma micropipeta com ponta de 10 microlitros para carregar a agulha de vidro chanfrada com cinco microlitros de solução morfológica. Em seguida, insira a agulha de vidro no porta-agulha do micro manipulador conectado à bomba pneumática pico.

Ajuste o ângulo das injeções para aproximadamente 45 graus para que a agulha só precise ser movida em uma direção plana. Em seguida, defina os valores do microinjetor da seguinte forma, uma pressão de retenção de 20 libras por polegada quadrada ou PSI, uma pressão de ejeção de 15 PSIA, faixa de 100 milissegundos de gating e um valor de período de 1.9, que corresponde a 10.9 milissegundos. Prepare 20 mililitros de 1,5%aros derretido em um XPBS e despeje em uma placa de Petri de 10 centímetros.

Em seguida, coloque um molde de injeção ranhurado no aros quente para formar sulcos no gel endurecido para anestesiar as larvas. Coloque-os em 100 mililitros de água do aquário com 20 miligramas por litro de tricano. Depois que eles pararem de responder ao toque, use uma pipeta pastoral de plástico para transferir cuidadosamente a larva para uma ranhura do molde aros úmido, de modo que o lado ventral fique voltado para a parede vertical de aros da ranhura.

Coloque a placa aros sob o microscópio estéreo de modo que o ventrículo fique voltado para longe da agulha de injeção. Em seguida, abaixe a agulha e insira-a aproximadamente um a dois micrômetros no ventrículo cardíaco. Tomando cuidado para não inseri-lo muito profundamente.

Em seguida, injete um pulso de três nanolitros de solução Morpho no ventrículo e peso para permitir a limpeza do coração antes de repetir com mais cinco pulsos após a injeção, remova a agulha e coloque-a em uma placa de Petri contendo um XPBS para evitar o ressecamento. Em seguida, usando uma pipeta de transferência cheia de meio E três, transfira cuidadosamente as larvas de volta para uma placa de Petri contendo meio E três fresco para garantir a absorção e manutenção do morfo nas células. Repita as injeções a cada 12 a 24 horas durante o experimento para avaliar as injeções.

Depois de anestesiar os peixes, coloque-os em uma placa plana e úmida coberta com meio E três antes de usar um microscópio estéreo com campo claro e fluorescência para obter imagens deles. Analise imagens para regeneração usando o software gratuito Fiji Image J para usar a ferramenta de rastreamento de linha para determinar a quantidade de crescimento regenerativo que ocorreu. Primeiro, calibre as imagens arrastando e soltando um arquivo na janela principal de Fiji no menu principal.

Defina a escala para todas as imagens clicando em analisar no menu suspenso. Clique em definir escala e, em seguida, ative a opção global clicando na caixa de seleção. Agora arraste e solte a imagem novamente para medir a quantidade de crescimento regenerativo na barra de ferramentas.

Escolha a ferramenta de seleções à mão livre e circunde a área a ser medida. Por fim, pressione Ctrl M.Isso abrirá uma nova janela de resultados mostrando o valor da área circundada em pixels quadrados. Como visto aqui minutos após a injeção, a solução morfo endoportre se distribui por toda a vasculatura em diferentes tecidos, como a dobra da barbatana e o cérebro, por pelo menos 12 ou mais horas.

Para avaliar a regeneração das estruturas da nadadeira larval distal, foram removidos os seguintes: a ponta distal da dobra da nadadeira e da medula espinhal, o músculo distal sem cordão, o músculo distal do tronco, que não é visível aqui, e as células pigmentares, que são difíceis de atingir por injeção direta, mas parecem incorporar o morfo após injeções ventriculares seriadas. Assim, este método promove com relativa facilidade a entrega de morfo a tecidos que são difíceis de atingir individualmente e permite a avaliação da função gênica em vários tecidos da nadadeira em regeneração ao mesmo tempo. Para analisar a importância de genes específicos envolvidos na regeneração, a barbatana larval é parcialmente amputada e todos os tecidos que incorporaram o morfo são ressecados.

A dobra da barbatana larval regenera sua estrutura dentro de alguns dias após a amputação, conforme demonstrado. Aqui, morpho tem como alvo os genes necessários para a regeneração, perturbou a resposta de regeneração em comparação com os controles de controle morfo injetados e incompatíveis após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da regeneração explorarem os mecanismos moleculares envolvidos na regeneração da barbatana do peixe-zebra.