Preparação de amostras de tumor embebidas em parafina fixadas em formalina: um protocolo para preservar amostras de tecido e citologia de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)

- Para começar, obtenha amostras de tumor de pulmão como amostras de tecido ou como amostras de citologia de lavagens brônquicas - uma lavagem salina contendo células do interior das vias aéreas. Para preparar amostras de tecido, transfira o tecido pulmonar recém-dissecado para um de incorporação. Fixe e preserve o tecido com a concentração adequada de formalina.

Para preparar amostras de citologia, primeiro trate as lavagens brônquicas com DL-ditiotreitol para homogeneização. Centrifugue e remova o sobrenadante. Em seguida, trate com uma solução mucolítica para liquefazer o muco e separar as células. Centrifugue para peletizar as células e fixá-las com formalina. Trate as células com um reagente de preparação de bloco celular adequado para concentrar a amostra enquanto trabalha com pequenos volumes de pellets.

Transfira o pellet para um de embutir. Processe ambos os tipos de amostra desidratando-os por meio de uma série de banhos de álcool graduados. Remova o álcool usando um agente de limpeza apropriado, seguido de infiltração de cera. Incorpore o em cera de parafina líquida e deixe-o solidificar. Isso forma uma camada ao redor do tecido, mantendo a amostra no lugar.

Use um micrótomo para obter seções em fatias finas. Coloque as seções em lâminas de vidro carregadas positivamente para facilitar a adesão. Seque e manche para observar as lâminas ao microscópio. No protocolo a seguir, demonstramos técnicas de preparação de amostras de tecido tumoral pulmonar e amostras de citologia.

Para começar, fixe o tecido tumoral em formalina tamponada neutra a 10% em um e incorpore o em parafina, conforme descrito no protocolo de texto. Incorpore o tecido infiltrado dentro de um molde preenchido com parafina derretida. Deixe os tecidos permanecerem no molde até que a parafina se solidifique. Depois disso, use um micrótomo para seccionar o tecido embebido em parafina com uma espessura de três micrômetros.

Transfira a fita de parafina para uma lâmina de microscópio de vidro carregada positivamente. Em seguida, seque a lâmina por uma hora a 37 graus Celsius. Primeiro, colete as lavagens brônquicas em uma solução conservante. Transfira as lavagens para um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione dois gramas de DL-ditiotreitol e vortex o tubo por 30 minutos. Em seguida, centrifugue a 250 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Remova o sobrenadante e adicione 10 mililitros de uma solução mucolítica. Agitar a amostra em velocidade média durante 20 minutos e centrifugar a 250 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois disso, remova o sobrenadante e deposite o pellet celular em um tubo de coleta contendo 10% de formalina tamponada neutra.

Adicione quatro gotas de um agente de preparação de bloco celular. Transfira o pellet celular para um. Fixe o pellet celular para inclusão e seccionamento de parafina usando o processo descrito anteriormente para preparar amostras de tecido tumoral.