Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.

O experimento do chip é usado para monitorar mudanças dinâmicas nas modificações histológicas que ocorrem durante o STAT one, alterações na expressão gênica ativada na ocupação de fatores de transcrição, complexos modificadores de histonas e a própria maquinaria de transcrição também podem ser analisadas dessa maneira. Para iniciar o ensaio, as células são induzidas com interferon gama para ativar o STAT um, sinalizando a reticulação das células com formaldeído e coletando-as segue, procede ao isolamento do núcleo e do sonicate, que corta a cromatina em aproximadamente 200 a 1000 fragmentos de pares de bases. Em seguida, adicione um anticorpo que tenha como alvo a proteína ou a modificação histológica de interesse e, em seguida, precipite os imunocomplexos.

Os imunocomplexos são lavados, as ligações cruzadas são invertidas e o DNA é purificado. As alterações nas modificações histológicas ou no recrutamento de proteínas para áreas específicas de um gene podem ser determinadas com base na análise quantitativa de PCR em tempo real do DNA imunoprecipitado. Olá, meu nome é Lauren Borow, do laboratório da Dra. Melissa Hendrickson e do Departamento de Biologia da Universidade da Virgínia.

Hoje vamos mostrar um procedimento para imunoprecipitação da cromatina. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar modificações histológicas dinâmicas que ocorrem durante a transcrição a jusante da sinalização STAT one. Então vamos começar.

Um dia antes de iniciar este procedimento, cultive a célula de modo que um número suficiente esteja disponível para as duas células FTGH usadas aqui. Prepare uma placa de cultura de tecidos de 15 centímetros com fluência de 80%co para cada ensaio de chip. Em cada experimento incluir um controle de IgG negativo, um controle de anticorpo de pan-histona positivo e duplicatas.

Para iniciar este procedimento, remova o meio de cultura. Substitua-o por 20 mililitros de DMEM suplementado com 10% de soro cósmico de bezerro e contendo interferon gama a cinco nanogramas por mililitro. Além disso, substitua a mídia nas placas não induzidas por 20 mililitros de 10% C-C-S-D-M-E-M.

Em seguida, trabalhe em uma hotte. Incline a placa de cultura de tecidos de 15 centímetros e adicione 540 microlitros de uma solução de formaldeído a 37% a 20 mililitros de mídia. Em seguida, balance o prato para espalhá-lo uniformemente.

Deixe a reticulação perceber os 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione glicina a 125 milimolares na concentração final para interromper a reação de reticulação. Aspire a vácuo o meio e lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS gelado usando um raspador de células, colete as células em cerca de sete mililitros de PBS e combine as células que foram tratadas de forma idêntica a partir de seis placas de 15 centímetros em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo.

Por fim, centrifugar as células coletadas a 1.800 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius e aspirar o PBS. Se parar aqui, encaixe, congele a paleta de células e armazene a 80 graus Celsius negativos após a reticulação. O próximo passo é preparar a cromatina.

Comece adicionando um DTT milimolar e inibidores de protease completos ao tampão de inchaço resfriado no gelo. Resus suspende o pellet de seis placas, puxa quatro mililitros do tampão de inchaço e transfere para um tubo cônico de 15 mililitros. Usar mais ou menos buffer pode alterar a eficiência da dança.

Incube a suspensão celular no gelo por 10 minutos. Quando a incubação no gelo estiver concluída, transfira a suspensão para um infortúnio pré-resfriado de 15 mililitros e dance. 20 golpes com PEs A após a dança transferem as células de volta para um tubo cônico de 15 mililitros em centrífuga de gelo a 2.500 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartam o sobrenadante que sai da pelota nuclear.

Adicione inibidores de protease completos ao tampão de sonicação resfriado em gelo. Seis placas rendem cerca de 200 microlitros de pellet nuclear Resus. Suspenda o pellet em 15 volumes de pellets ou três mililitros do tampão de sonicação.

Usar um volume diferente para essa quantidade de células pode alterar a eficiência da sonicação. A eficiência da sonicação deve ser determinada de antemão para o ator do seu laboratório. Aqui é usado um sonicate Miss Sonic 3000 equipado com o microchip.

Sonicar a suspensão dos núcleos no gelo durante 10 ciclos durante 20 segundos ligado e 40 segundos desligado a uma amplitude de oito. Isso normalmente resulta em fragmentos de cromatina com tamanho médio de 200 a 1000 pares de bases quando a sonicação está completa. Transferir o material sonicado para um tubo de centrifugação SS 34 e centrifugar a 13 000 RPM durante 20 minutos a quatro graus Celsius.

Em um rotor SS 34 para detritos de células de pelotas, que geralmente é uma pequena quantidade. Transferir cuidadosamente o supinato para um tubo cónico de 15 mililitros sobre gelo. Prossiga para o chip para diminuir o plano de fundo de eventos de associação não específicos.

Primeiro, pré-limpe a preparação da cromatina adicionando 360 microlitros de pasta de grânulo de DNA de esperma de salmão A ou G e balançando por quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Centrifugue a 1000 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius para pellet as esferas agrícolas. Em seguida, transfira o natural supino pré-limpo para outro tubo cônico de 15 mililitros no gelo.

Em seguida, meça a absorbância de 260 nanômetros ou as unidades A 260 da cromatina. Diluir 10 microlitros de cromatina em 190 microlitros de água bidestilada Para o branco, combine 10 microlitros de tampão de sonicação com 190 microlitros de água bidestilada

Ajustar o volume da amostra com tampão de sonicação para quatro unidades A 260. Guarde 75 microlitros da cromatina pré-limpa em quatro a duas unidades de 60 como amostra de entrada e armazene a menos 20 graus Celsius até que esteja pronto para reverter as ligações cruzadas. Lembre-se de que esta etapa é crucial para a análise de dados.

Portanto, não deixe de pegar a alíquota de entrada e dispensar a preparação de cromatina restante em alíquotas de um mililitro em microtubos de lixo de 1,7 mililitro no gelo. Se parar aqui, estalo. Congele a cromatina preparada em gelo seco e armazene a 80 graus Celsius negativos.

No entanto, como a cromatina armazenada pode se degradar, é melhor continuar com o ip. Agora adicione os anticorpos de grau de chip aos conjuntos de amostras induzidas e não induzidas. Em duplicado.

Normalmente, um a dois microgramas de anticorpo funcionam bem, mas a quantidade deve ser determinada empiricamente de antemão. Adicione dois microgramas de IgG e 15 microlitros de anticorpo pan-histona H três como controles negativos e positivos para conjuntos de amostras induzidas e não induzidas. Além disso, agite todos os tubos durante a noite a quatro graus Celsius antes de prosseguir com o isolamento dos imunocomplexos após a incubação noturna com os anticorpos.

Adicione 60 microlitros de proteína A de DNA de esperma de salmão ou pasta de grânulo de proteína giro a todos os tubos. Foguete quatro graus Celsius por pelo menos 60 minutos. Para ligar os imunocomplexos às contas.

Pellet os imunocomplexos ligados aos grânulos agros por micro suavemente a 2000 RPM por três minutos a quatro graus Celsius aspirar o sobrenadante. Em seguida, execute uma série de lavagens de tampão, começando com uma lavagem com baixo teor de sal seguida por uma lavagem com alto teor de sal. Em seguida, lavagem com cloreto de lítio.

E, finalmente, duas lavagens TE para cada um dos tampões de lavagem. Adicione PMSF imediatamente antes de usar, lave com um mililitro de tampão por 10 minutos com balanço a quatro graus Celsius, micro por três minutos a 2000 RPM a quatro graus Celsius e aspire o sobrenadante mantendo as amostras resfriadas no gelo. Depois de remover a lavagem final do tampão de chá, adicione 500 microlitros de tampão Lucian recém-preparado ao vórtice de grânulos para misturar os grânulos de aros no tampão Lucian e aqueça por 30 minutos a 65 graus Celsius.

Vórtice a cada 10 minutos enquanto as amostras estão eluídas, descongele as amostras de entrada e adicione 500 microlitros de tampão de eluição a cada uma. Inclua esses exemplos em todas as etapas futuras. Uma vez que as amostras terminem a microfusão de incubação de 65 graus Celsius por 30 segundos a 2000 RPM e transfira o EENT para um novo tubo de microfuge.

Finalmente, inverta a reticulação. Adicione cloreto de sódio de cinco molares a uma concentração final de 200 milimolares a todas as amostras e incubadora de vórtice a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas até a noite. Uma vez que as ligações cruzadas dos imunocomplexos são revertidas, o DNA ligado pode ser recuperado quando a incubação a 65 graus Celsius estiver completa.

Amostras de micro fuga por 30 segundos. Para coletar a condensação nas tampas, adicione um microlitro de RNAs A a cada tubo e incube em temperatura ambiente por 15 minutos após o tratamento de RNAs em cada tubo a 10 microlitros de EDTA 0,5 molar, 40 microlitros de cloreto de tris 0,5 molo pH 6,5 e dois microlitros de proteinase K ou um total de 52 microlitros de uma mistura master e incube a 45 graus Celsius por 60 minutos. Extrair as amostras com clorofórmio fenol, álcool iso aile e, em seguida, com clorofórmio ISO A my alcohol.

Em seguida, para precipitar o DNA, adicione dois microlitros de glicogênio e 0,1 volume de acetato de sódio de três molares. pH 5,2 a cada amostra e vórtice, adicione 2,5 volumes de vórtice de etanol a 100% e incube a menos 20 graus Celsius durante a noite. Recupere as amostras e o micro refugo a 13.000 RPM por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Lave os pellets de glicogênio de DNA com um mililitro de etanol a 70% e ar. Seque os pellets ou use uma centrífuga a vácuo de velocidade. Não seque demais o DNA, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão TE e quantifique não mais do que um microlitro em tempo real.

PCR mostrado aqui são os resultados de um experimento de chip seguindo a dinâmica de H três K 36 ME três. Durante a indução de gamainterferon do IRF, um anticorpo do gene H três K 36 ME três foi usado para puxar para baixo a cromatina coletada de duas células FTGH induzidas com interferon gama por 30 minutos, 1,5 horas e cinco horas com IgG como controle negativo. A ocupação do STAT um também foi determinada nesses momentos, assim como a ocupação da RNA polimerase dois.

A ocupação de histonas através do locus do gene IRF um foi determinada para as condições não induzidas e induzidas usando o anticorpo pan histona três, que também serve como controle positivo. A queda em torno de menos cinco pares de bases é devido à depleção do nucleossomo encontrada nos locais de início da transcrição. Acabamos de mostrar o procedimento para imunoprecipitação da cromatina.

Este ensaio é útil para observar as modificações da cromatina que ocorrem durante a transcrição do gene ativado. Ao fazer este procedimento, é importante elaborar o procedimento de cisalhamento de sua cromatina com seu ator antes de iniciar um experimento com chips. Lembre-se também de coletar suas amostras de entrada.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.