Name: Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Aprenda a realizar cromatina imunoprecipitação para analisar modificações dinâmicas de histonas durante a expressão gênica ativada em células humanas. Este método permite monitorar alterações na ocupação de fatores de transcrição.

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Este trabalho é apoiado pela Universidade de Virginia, a Universidade de Virginia Cancer Center e The Thomas F. Miller e Kate Jeffress Memorial Trust. Agradecemos ao James E. Darnell Lab (Rockefeller University), a Robert Ross Lab (Fordham University) para linhas de celular.

PLANEJAMENTO Um dia antes de um experimento ChIP está prevista, as células devem ser cultivadas para que um número suficiente disponível. Suponha que cada ensaio ChIP exigirá ~ 1-1,5 x 10 7 células. Sempre planeje fazer ambos os controles negativo (IgG) e positivo (anticorpo pan histona) e as experiências duplicadas. Dica - Para as células 2FTGH, cada ensaio ChIP requer cerca de 15 centímetros um prato de cultura de tecidos em 80% confluência. PARTE 1: PREPARE cromatina e PERFORM ChIP <ol><li> Remova a mídia de cultura e induzir as células para os tempos necessários com 20 mL de 10% cósmica soro bovino (CCS) / DMEM contendo IFN-gama a 5 ng / mL. Substituir os meios de comunicação sobre as placas uninduced com 20 mL de 10% CCS / DMEM também. </li><li> Em uma capela, adicione 540 mL de formaldeído 37% para 20 mL dos meios de comunicação (1% concentração final) no prato de 15 cm. Dica - placa Tilt e adicione o formaldeído para o pool de mídia - em seguida, placa de rock a se espalhar uniformemente. </li><li> Permitir reticulação para prosseguir por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar glicina a 0,125 M concentração final para parar de reticulação. </li><li> Vácuo aspirar a mídia e lavar as células uma vez com 10 mL de fosfato de gelo frio solução salina tamponada (PBS). </li><li> Coletar células com um raspador de células em ~ 7 mL PBS e combinar células (de 6 placas) que foram tratados de forma idêntica em 50 mL do tubo cônico no gelo. </li><li> Centrifugação (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrífuga) a 1800 rpm a 4 ° C por 5 minutos e aspirar o PBS. Dica - Encaixe congelar o pellet celular se parando aqui e armazenar a -80 ° C. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 4 mL de buffer Inchaço (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Adicione 1 mM DTT, os inibidores da protease completa e frio no gelo antes de usar) e transferir para a 15 mL tubo cônico. Dica - Este volume tampão inchaço é apropriado para uma placa de 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 células). Buffer de mais ou menos pode mudar a eficiência douncing. </li><li> Incubar a suspensão de células no gelo por 10 minutos. </li><li> Transferência de suspensão para um pré-refrigerados 15 mL douncer (Wheaton) e Dounce 20 cursos com pilão A. </li><li> Transferência dounced células de volta para um tubo cônico de 15 mL no gelo. </li><li> Centrifugar a 2500 rpm por 5 minutos a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet nuclear (~ 200 mL de 6 placas) em 3 mL (15 volumes pellet) de tampão de sonicação (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, desoxicolato de sódio 0,1%, 0,1% SDS. Adicionar inibidores da protease completa e frio no gelo pouco antes de usar). Dica - Este volume tampão de sonicação é apropriado para uma placa de 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 células). Buffer de mais ou menos pode mudar a eficiência sonicação. </li><li> Sonicate núcleos suspensão em gelo por 10 ciclos (20 segundos on/40 segundos fora amplitude / configuração de 8) usando um sonicador Misonix 3000 equipado com o MICROTIP. Isso normalmente resulta em fragmentos de cromatina média 200-1000 bps em tamanho. Dica - Como sonicators irá variar, a eficiência sonicação deve ser determinada empiricamente. Para isso, tomar as alíquotas de 20 mL antes de sonicação e após cada ciclo de sonicação. Calor estas amostras a 65 ° C por 4 horas. Adicionar tampão de carregamento DNA e executar um padrão de 1% gel agarose / TBE para visualizar fragmentos de DNA). </li><li> Transferência sonicado material a um tubo de centrífuga SS34 e centrifugar por 20 minutos a 4 ° C a 13000 rpm em um rotor SS34 (Sorvall RC6 Além disso Centrífuga) para pellet o que é geralmente uma pequena quantidade de restos celulares. </li><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL no gelo. </li><li> Pré-claro pela adição de 360 ​​mL de esperma de salmão DNA / proteína A ou G agarose slurry contas e balanço a 4 ° C por pelo menos 30 minutos. Dica - Esta etapa diminui o ruído no ensaio que surge da não-específicos eventos de ligação. </li><li> Centrifugar a 1000 rpm a 4 ° C por 5 minutos para agregar as contas de agarose. </li><li> Transferência de pré-limpo sobrenadante para outro tubo cônico de 15 mL no gelo. </li><li> Medir o A260 unidades da cromatina pré-limpo e ajustar o volume com tampão de sonicação para quatro (4) A260 unidades (0,2 mg / mL assumindo uma unidade de A260 = 0,050 mg / ml) Dica - Para medir o A260 unidades, diluir 10 mL de pré-limpo cromatina em 190 mL DDW; espectrofotômetro em branco com 10 mL tampão de sonicação em DDW 190 mL. </li><li> Economize 75 mL da cromatina (em 4 A260 unidades) como a amostra de entrada e armazenar a 20 ° C até que esteja pronto para reverter ligações cruzadas. Dica - Este passo é crucial para a análise de dados. Não negligencie a tomar a alíquota de entrada. </li><li> Alíquota cromatina preparada para 1,7 mL em tubos de microcentrífuga ice como um alíquotas mL. Dica - Se parar aqui, snap congelar a cromatina preparada em gelo seco e armazenar a -80 ° C. NB: cromatina armazenados podem degradar, produzindo menos do que os melhores resultados, por isso evite se possível. </li><li> Adicionar os anticorpos ChIP-grade para as amostras induzido e uninduced conjuntos em duplicata. Adicionar IgG (2 mg) e anticorpo pan H3 Histone (15 mL), como os controles positivos e negativos para conjuntos induzido e uninduced amostras. Dica - A quantidade de anticorpos para o uso deve ser determinada empiricamente, ou ver a folha do fornecedor do produto para quantidades sugeridas. Tipicamente 1-2 mg de um anticorpo ChIP-grade funciona bem. O volume apropriado deve ser determinado empiricamente para anticorpos que são fornecidos como soro. </li><li> Rocha todos os tubos durante a noite a 4 ° C. </li></ol> PARTE 2: COLLECT imunocomplexos <ol><li> Adicionar 60 mL de esperma de salmão A ou proteína G DNA / Protein agarose slurry contas em todos os tubos. Proteína Use Uma dica para o coelho e anticorpos policlonais G proteína de anticorpos monoclonais de rato. </li><li> Rocha a 4 ° C durante pelo menos 60 minutos. </li><li> Pellet a imunocomplexos (contas de agarose) por microfuging delicadamente a 2000 rpm a 4 ° C por 3 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante. </li><li> Lavar os imunocomplexos com 1 mL de cada um dos Buffers Wash seguintes por 10 minutos com balanço a 4 ° C. Microcentrífuga por 3 minutos a 2000 rpm a 4 ° C entre cada lavagem e aspirar o sobrenadante. Manter as amostras refrigeradas em gelo. Adicionar PMSF pouco antes de usar. <ul><li> Lavar Sal baixo - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> Lavar Sal alta - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, desoxicolato de sódio 1%, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF </li><li> TE Wash - duas lavagens com tampão TE -10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF </li></ul></li><li> Remova o tampão de lavagem final, TE e para as contas, adicionar 500 mL de buffer de eluição (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, SDS 1%). Dica - O tampão de eluição deve ser preparada imediatamente. </li><li> Vortex para misturar contas agarose em tampão de eluição e calor durante 30 minutos a 65 ° C. Dica - vórtice cada tubo, pelo menos, a cada 10 minutos durante este 30 minutos. </li><li> Microcentrífuga por 30 segundos a 2000 rpm e transferir o eluente a um tubo de microcentrífuga novo. Dica - Durante a eluição, descongelar as amostras de entrada e adicionar 500 mL de buffer de eluição a cada um. Incluir essas amostras em todas as etapas daqui para frente. </li><li> Adicionar 5 M NaCl para uma concentração final de 200 mM para todas as amostras e vortex. </li><li> Incubar a 65 ° C durante a noite (ou pelo menos 4 horas). </li></ol> PARTE 3: ChIP'd purificar e DNA ENTRADA <ol><li> Microcentrífuga todas as amostras por 30 segundos para coletar condensação na tampa. </li><li> Adicionar 1μL de RNAse A (10 U / mL) a cada tubo e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. </li><li> Adicionar 10 mL 0,5 M EDTA, 40 mL 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 mL de Proteinase K (10 mg / mL) e incubar a 45 ° C por 60 minutos. Dica Prepare uma mistura mestre destes reagentes e adicionar 52 mL de cada tubo. </li><li> Fenol / clorofórmio / isoamílico extrato de álcool e, em seguida, clorofórmio / álcool isoamílico extrair amostras. </li><li> Adicione 2 mL de glicogênio (25 mcg / mL) e 0,1 volumes de acetato 3M pH 5,2 e Na vortex. </li><li> Adicionar 2,5 volumes de etanol 100% e vortex. </li><li> Incubar a 20 ° C durante a noite. </li></ol> PARTE 4: ChIP'd purificar e DNA ENTRADA CONTINUAÇÃO <ol><li> Amostras de microcentrífuga para um mínimo de 20 minutos a 13000 rpm a 4 ° C para precipitar o DNA / glicogênio pellets. </li><li> Lavar com DNA / glicogênio pellets com 1 ml de etanol 70%. </li><li> Ar seco a pellets ou rapidamente seco em centrífuga a vácuo DNA velocidade Savant. Dica - Não mais seco do DNA. </li><li> Ressuspender DNA / glicogênio pellets em 200 mL de buffer TE. </li><li> DNA (1 mL) está pronto para a quantificação através de PCR em tempo real. DNA loja restantes a 20 ° C. Dica - Usando mais de 1 mL de DNA pode inibir as reações PCR em tempo real, assim que a escala com cautela. </li></ol> Parte 5: resultados representativos: Amostras de DNA ChIP e de entrada são quantificados com o Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Rápido Real-Time PCR System) utilizando primers específicos para o locus do gene de interesse. Primers que seqüência alvo do genoma conhecido por ser enriquecido em falta ou nas modificações das histonas sendo analisadas podem ser usados ​​como controles positivos e negativos também. Os dados são apresentados como percentual de entrada. O procedimento chip deve ser totalmente repeated com três repetições biológicas para garantir mudanças relatadas em modificações das histonas são estatisticamente significativas. Existem várias questões importantes a considerar quando se usa PCR em tempo real para quantificar DNA, incluindo a concepção primer, eficiência da PCR, ea forma adequada para calcular o percentual de procedimentos de entrada e de normalização. Ao perfil de ocupação de modificação das histonas através de um gene, a eficiência da PCR deve ser consistente entre todos os pares de primers. O real-time PCR fabricante do sistema pode fornecer as informações e treinamento necessários. A Figura 1 mostra resultados representativos da cromatina durante immunoprecipitated STAT1 ativação do gene IRF1 9, desencadeada por IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ocupação de STAT1, RNA polimerase II e H3K36me3 é dinâmico durante STAT1 ativação do gene IRF1. (A, B, C) ​​chip com α-H3K36me3, α-STAT1 e α-Pol II da cromatina coletados a partir de células 2FTGH induzida com IFN-γ por 30 minutos (quadrados vermelhos), 1,5 horas (círculos azuis), 5 horas ( triângulos verdes) ou uninduced (diamantes negros). IgG é o controle negativo (cinza cruzes). (D) Pan H3 é o controle positivo e mostra a ocupação das histonas em todo o lugar no induzido (círculos azuis) e as condições uninduced (diamantes negros). O mergulho em torno de -5 pb é devido ao esgotamento nucleosome que é encontrado em locais de início da transcrição.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo descrito ChIP tem sido usado com sucesso em laboratório para ensaio de mais de vinte diferentes modificações das histonas. Além disso, têm caracterizado as mudanças na ocupação de fatores de transcrição, histonas modificando-enzimas, proteínas que reconhecem modificações das histonas eo RNA polimerase II maquinaria de transcrição, em vários IFN-γ genes induzidos. Temos também o procedimento utilizado para caracterizar as mudanças em modificações das histonas durante a diferenciação de células-tronco de um câ...

<table><tbody><tr><td>Formaldeído 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio/álcool isoamílico</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores Completos de Protease Mini</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Bezerro Cósmico</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gama</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sal de Ácido Desoxicólico de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histona H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/isoamílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de DNA de Esperma de Salmão/Proteína A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de DNA de Esperma de Salmão/Proteína G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polimerase II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

cromatina imunoprecipitação (chips) para a modificação do ensaio dinâmico histone na expressão dos genes ativados em células humanas

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Em resposta a uma variedade de ligantes extracelulares, o STAT (transdutor de sinal e ativador de transcrição) fatores de transcrição são rapidamente recrutados a partir de seu estado latente no citoplasma aos receptores da superfície celular, onde elas são ativadas por fosforilação de um resíduo de tirosina único 1. Eles, então, dimerizam e translocar para o núcleo de dirigir a transcrição de genes-alvo, afetando o crescimento, diferenciação homeostase, e da resposta imune. Não é de surpreender, dado o seu envolvimento generalizado nos processos celulares normais, desregulação da função STAT contribui para a doença humana, especialmente para cânceres 2 e doenças auto-imunes 3. Está bem estabelecido que a transcrição é regulada por alterações ao modelo de cromatina 4,5. Essas alterações incluem as atividades de ATP-dependente complexos, bem como modificações covalentes das histonas e metilação do DNA 6. , Pois a ativação STAT da expressão do gene é rápida e transitória, que requer mecanismos específicos para o modelo modular a cromatina em loci STAT-dependente gene. Para definir esses mecanismos, caracterizamos as modificações das histonas e as atividades enzimáticas que gerá-los em loci de genes que respondem a STAT sinalização. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina, um método que é valioso para o estudo de sinalização para STAT cromatina na expressão dos genes ativados.

Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

Em resposta a uma variedade de ligantes extracelulares, os fatores de transcrição STAT (transduzidor de sinal e ativador de transcrição) são rapidamente recrutados...

O experimento de chip é utilizado para monitorar alterações dinâmicas nas modificações de histonas que ocorrem durante a expressão gênica ativada por STAT1. Alterações na ocupação de fatores de transcrição, complexos modificadores de histonas e da própria maquinaria de transcrição também podem ser analisadas dessa forma. Para iniciar o ensaio, as células são induzidas com interferon gama para ativar a sinalização STAT1, seguido pelo reticulamento das células com formaldeído e sua coleta. Em seguida, prossegue-se com o isolamento de núcleos e sonicação, o que fragmenta a cromatina em segmentos de aproximadamente 200 a 1000 pares de bases. Na etapa seguinte, adiciona-se um anticorpo que reconhece a proteína ou modificação de histona de interesse e, então, precipitam-se os complexos imunológicos.Os complexos imunes são lavados, as ligações cruzadas são revertidas e o DNA é purificado. As alterações nas modificações histônicas ou o recrutamento de proteínas para áreas específicas de um gene podem ser determinados com base na análise de PCR quantitativa em tempo real do DNA imunoprecipitado. Olá, meu nome é Lauren Borow do laboratório da Dra. Melissa Hendrickson e do Departamento de Biologia da Universidade da Virgínia.Hoje vamos mostrar um procedimento para imunoprecipitação de cromatina. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar modificações histônicas dinâmicas que ocorrem durante a transcrição a jusante do sinal STAT1. Então, vamos começar.No dia anterior ao início deste procedimento, cultive as células para que uma quantidade suficiente esteja disponível para os dois tipos de células FTGH utilizados aqui. Prepare um prato de cultura tecidual de 15 centímetros com 80% de confluência para cada ensaio com chip. Em cada experimento, inclua um controle negativo de IgG, um controle positivo de anticorpo pan-histona e duplicatas.Para iniciar este procedimento, remova o meio de cultura. Substitua-o por 20 mililitros de DMEM suplementado com 10% de soro de bezerro cósmico e contendo interferon gama a cinco nanogramas por mililitro. Além disso, substitua o meio nos placas não induzidas por 20 mililitros de C-C-S-D-M-E-M 10%.A seguir, trabalhe em uma capela de exaustão. Incline a placa de cultura de tecidos de 15 centímetros e adicione 540 microlitros de uma solução de formaldeído 37% a 20 mililitros de meio. Em seguida, agite suavemente a placa para distribuir uniformemente.Deixe a reticulação ocorrer por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione glicina até uma concentração final de 125 milimolar para interromper a reação de reticulação. Aspire o meio sob vácuo e lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS gelado, utilizando uma espátula para células, colete as células em aproximadamente sete mililitros de PBS e combine as células tratadas de forma idêntica provenientes de seis placas de 15 centímetros em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo.Finalmente, centrifugue as células coletadas a 1.800 RPM durante cinco minutos a quatro graus Celsius e aspire o PBS. Se for interromper aqui, congele rapidamente a película celular e armazene a menos 80 graus Celsius após o reticulamento. O próximo passo é preparar a cromatina.Inicie adicionando DTT de um milimolar e inibidores completos de protease ao tampão de inchamento resfriado em gelo. Re-suspenda o pellet de seis placas em quatro mililitros do tampão de inchamento e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. O uso de mais ou menos tampão pode alterar a eficiência do inchamento.Incube a suspensão celular no gelo durante 10 minutos. Após a incubação no gelo, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros previamente refrigerado e homogenize. Realize 20 passagens com o homogeneizador tipo Dounce após a homogenização, transfira as células de volta para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue no gelo a 2.500 RPM durante cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante, mantendo o pellet nuclear.Adicione inibidores completos de protease ao tampão de sonicação resfriado em gelo. Seis placas rendem cerca de 200 microlitros de ressuspensão do pellet nuclear. Suspenda o pellet em 15 volumes do pellet ou três mililitros do tampão de sonicação.Usar um volume diferente para essa quantidade de células pode alterar a eficiência da sonicação. A eficiência da sonicação deve ser determinada previamente para o sonicador do seu laboratório. Aqui, utiliza-se um sonicator Miss Sonic 3000 equipado com o microchip.Sonicar a suspensão de núcleos em gelo durante 10 ciclos de 20 segundos ligado e 40 segundos desligado, com amplitude ajustada em oito. Isso geralmente resulta em fragmentos de cromatina com tamanho médio entre 200 e 1000 pares de bases ao final da sonicação. Transfira o material sonicado para um tubo de centrífuga SS 34 e centrifugue a 13.000 RPM por 20 minutos a quatro graus Celsius.Em um rotor SS 34, centrifugue para formar o pellet de detritos celulares, que geralmente é uma pequena quantidade. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo. Prossiga para a etapa de corte para reduzir o fundo proveniente de eventos de ligação não específicos.Primeiro, pré-limpe a preparação de cromatina adicionando 360 microlitros de suspensão de perlas de agarose A ou G com DNA de esperma de salmão e agite suavemente a 4 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Centrifugue a 1000 RPM durante cinco minutos a 4 graus Celsius para formar o pellet das perlas de agarose. Em seguida, transfira o sobrenadante pré-limpo para outro tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo.Em seguida, meça a absorbância em 260 nanômetros ou as unidades A 260 da cromatina. Dilua 10 microlitros de cromatina pré-tratada em 190 microlitros de água bidestilada. Para o branco, misture 10 microlitros de tampão de sonicação com 190 microlitros de água bidestilada.Ajuste o volume da amostra com o tampão de sonicação até quatro unidades A 260. Guarde 75 microlitros da cromatina pré-limpa em quatro unidades A 260 como amostra de entrada e armazene a menos 20 graus Celsius até o momento de reverter os cruzamentos. Lembre-se de que esta etapa é crucial para a análise dos dados.Portanto, não se esqueça de separar a alíquota de entrada e distribuir o restante da preparação de cromatina em alíquotas de um mililitro em tubos microfugas de 1,7 mililitro sobre gelo. Se for interromper por aqui, congele rapidamente o cromatina preparado em gelo seco e armazene a menos 80 graus Celsius.No entanto, como a cromatina armazenada pode degradar, é melhor prosseguir com o IP. Agora, adicione os anticorpos de grau ChIP aos conjuntos de amostras induzidas e não induzidas, em duplicata.Normalmente, um a dois microgramas de anticorpo funcionam bem, mas a quantidade deve ser determinada empiricamente previamente. Adicione dois microgramas de IgG e 15 microlitros de anticorpo pan histona H três como controles negativo e positivo aos conjuntos de amostras induzidas e não induzidas. Além disso, agite todos os tubos durante a noite a quatro graus Celsius antes de prosseguir para o isolamento dos complexos imunes após a incubação noturna com os anticorpos.Adicione 60 microlitros de DNA de esperma de salmão com proteína A ou suspensão de microesferas de proteína G a todos os tubos. Incube a quatro graus Celsius por pelo menos 60 minutos para ligar os complexos imunes às microesferas.Pelote os complexos imunes ligados às microesferas de agarose por centrifugação suave a 2000 RPM durante três minutos a quatro graus Celsius, aspirando o sobrenadante. Em seguida, realize uma série de lavagens com tampão, iniciando com uma lavagem de baixa salinidade, seguida por uma lavagem de alta salinidade. Depois, faça a lavagem com cloreto de lítio.E, finalmente, duas lavagens com TE para cada um dos tampões de lavagem. Adicione PMSF imediatamente antes do uso, lave com um mililitro de tampão por 10 minutos com agitação horizontal a quatro graus Celsius, centrifugue por três minutos a 2000 RPM a quatro graus Celsius e aspire o sobrenadante, mantendo as amostras resfriadas em gelo. Após a remoção da última lavagem com tampão TE, adicione 500 microlitros de tampão Lucian recém-preparado às microesferas, vortexe para misturar as microesferas de aros no tampão Lucian e aqueça por 30 minutos a 65 graus Celsius.Vortexie a cada 10 minutos enquanto as amostras estão sendo eluídas, descongele as amostras de entrada e adicione 500 microlitros de tampão de eluição a cada uma. Inclua essas amostras em todos os passos subsequentes. Assim que as amostras concluírem a incubação a 65 graus Celsius, microfusione a cada 30 segundos a 2000 RPM e transfira o EENT para um novo tubo de microcentrífuga.Por fim, reverta a reticulação. Adicione cloreto de sódio 5 molar a uma concentração final de 200 milimolares a todas as amostras e vortexe no incubador a 65 graus Celsius por pelo menos quatro horas até a noite toda. Uma vez que as ligações cruzadas dos complexos imunes sejam revertidas, o DNA ligado pode ser recuperado ao final da incubação a 65 graus Celsius.Centrifugue as amostras em microcentrífuga por 30 segundos. Para recolher a condensação nas tampas, adicione um microlitro de RNAsa a cada tubo e incube à temperatura ambiente por 15 minutos após a adição do tratamento com RNAsa a cada tubo contendo 10 microlitros de EDTA 0,5 molar, 40 microlitros de Tris cloreto 0,5 molar pH 6,5 e dois microlitros de proteinase K, totalizando 52 microlitros a partir de uma mistura-mestre, e incube a 45 graus Celsius por 60 minutos. Extraia as amostras com fenol-clorofórmio, álcool isoamílico, e depois com clorofórmio-álcool isoamílico.Em seguida, para precipitar o DNA, adicione dois microlitros de glicogênio e 0,1 volumes de acetato de sódio três molar, pH 5,2, a cada amostra e vortexie, adicione 2,5 volumes de etanol 100%, vortexie e incube a menos 20 graus Celsius durante a noite. Recupere as amostras e centrifugue a 13.000 RPM por 20 minutos a quatro graus Celsius.Lave os pellets de glicogênio de DNA com um mililitro de etanol 70% e ar. Seque os pellets ou use uma centrífuga a vácuo rápido. Não seque em excesso o DNA; reconstitua os pellets em 200 microlitros de tampão TE e quantifique não mais que um microlitro por tempo real.A PCR mostrada aqui representa os resultados de um experimento de chip que acompanhou a dinâmica de H3K36me3. Durante a indução por interferon gama do gene IRF1, foi utilizado um anticorpo contra H3K36me3 para imunoprecipitar a cromatina coletada de células FTGH submetidas à indução com interferon gama por 30 minutos, 1,5 hora e 5 horas, utilizando IgG como controle negativo. A ocupação de STAT1 também foi determinada nesses pontos temporais, assim como a ocupação da RNA polimerase II.A ocupação de histonas ao longo do locus do gene IRF1 foi determinada nas condições não induzida e induzida utilizando o anticorpo pan-histona H3, que também serve como controle positivo. A depressão em torno de menos cinco pares de bases deve-se ao esgotamento de nucleossomos encontrado nos locais de início da transcrição. Acabamos de mostrar a você o procedimento de imunoprecipitação de cromatina.Este ensaio é útil para observar modificações da cromatina que ocorrem durante a transcrição gênica ativada. Ao realizar este procedimento, é importante otimizar o procedimento de fragmentação da sua cromatina com seu assistente antes de iniciar um experimento de chip. Lembre-se também de coletar suas amostras de entrada.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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