Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um ensaio quantitativo de ligação ao DNA, útil para examinar interações proteína-DNA, descobrir reguladores transcricionais da expressão gênica e identificar novos agentes anti-tumorais. Isso é realizado primeiramente preparando uma placa de ensaio revestida com estreptavidina e um alvo de DNA BIOTINILADO apropriado. O segundo passo consiste em adicionar proteínas de extrato nuclear com ou sem inibidores potenciais e permitir que se liguem ao alvo de DNA.

Em seguida, os fatores de transcrição ligados são detectados com anticorpos primários e anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano (horse radish peroxidase). O passo final consiste em adicionar um substrato de peroxidase de rábano aos poços para induzir o desenvolvimento da coloração. Por fim, o desenvolvimento da coloração é medido com o espectrofotômetro.

Com o tempo, a quantidade de mudança de cor indicará o grau de ligação ao DNA e o efeito de inibidores potenciais da ligação ao DNA. A principal vantagem desta técnica em relação a outras, como o ensaio de mobilidade eletroforética em gel, é que se trata de um ensaio quantitativo de ligação de inibidores ao DNA. Para começar, prepare um número adequado de culturas celulares, consistindo em pelo menos três vezes 10 elevado a sete células para cada condição testada.

Aqui, estão sendo utilizadas células endoteliais de medula óssea humana, que expressam a proteína run X two. Quando as células atingirem 80% de confluência, trate-as com 0,2 microgramas por mililitro de no conazol para interromper o crescimento celular no limite do ciclo celular G two M.

Isso estabilizará a proteína run X dois e produzirá ligação máxima de DNA após 16 horas. Lisar as células e isolar a proteína conforme orientado no protocolo de texto complementar. Uma vez que a proteína tenha sido isolada, medir a concentração de proteína utilizando um ensaio BCA padrão.

Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius em alíquotas de 10 microlitros com concentrações entre dois e cinco miligramas por mililitro. Fixe uma placa de 96 poços com uma solução 0,1 molar de carbonato de sódio, adicionando 300 microlitros da mistura por poço. Prepare poços suficientes para que cada amostra seja analisada em triplicata.

Incube a placa por duas horas em uma plataforma agitadora à temperatura ambiente. Em seguida, lave a placa três vezes com 300 microlitros de tampão de lavagem contendo strep avid e incube com 100 microlitros de oligonucleotídeos bicatenários marcados com biotina a 1,25 nanomol por poço, durante duas horas, sob agitação. A seguir, lave as placas mais três vezes com o tampão de lavagem strep din.

Em seguida, adicione 100 microlitros por poço da mistura mestra contendo um tampão de ligação ao DNA, proteínas de ligação ao DNA na concentração de três a nove microgramas por poço e poli DIGC na concentração de um micrograma por poço. Em seguida, adicione a mistura mestra contendo qualquer inibidor potencial, como vitamina D3, ou a diluição apropriada do controle do solvente, como etanol, aos respectivos poços. Em seguida, cubra a placa e coloque-a sobre uma plataforma agitadora a quatro graus Celsius durante a noite, após a incubação com os extratos nucleares.

Lave a placa três vezes com o tampão de lavagem strep avid. Em seguida, adicione 90 microlitros por poço de um anticorpo monoclonal específico diluído a 0,2 nanogramas por microlitro em tampão de lavagem strep avid. Cubra a placa e incube-a à temperatura ambiente em uma plataforma oscilante durante uma hora.

Em seguida, enxágue novamente os poços com strep avid e tampão de lavagem e adicione 90 microlitros por poço da mistura de anticorpo secundário contendo cinco nanogramas por microlitro de anticorpo conjugado à HRP, purificado por afinidade e específico para fab, diluído no strep. AVID e tampão de lavagem. Incube o anticorpo secundário por 30 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma agitadora.

Em seguida, lave seis vezes com 300 microlitros por poço de tampão de lavagem Strp. A seguir, desenvolva os resultados adicionando 50 microlitros de um substrato de tetraetilbenzdina diretamente do frasco estoque a cada poço, para monitoramento contínuo das amostras. Coloque as amostras no espectrofotômetro e meça continuamente a absorbância em 635 nanômetros.

Para uma medição única, incube as amostras por 10 a 20 minutos à temperatura ambiente e no escuro. Durante esse período, os poços devem mudar de transparentes a diferentes graus de azul. Interrompa a reação adicionando 50 microlitros de ácido sulfúrico a cada um.

Em seguida, meça a absorbância de cada poço a 450 nanômetros utilizando um leitor de placas de 96 poços. O gráfico mostrado aqui é um exemplo de monitoramento contínuo do efeito da vitamina D biologicamente ativa três na ligação ao run X 2D NA. As concentrações testadas tiveram pouco efeito na ligação ao run X 2D NA.

Embora outros compostos de vitamina D três tenham demonstrado efeitos acentuados, o composto 5 2 2 1 9 7 5 testado aqui foi identificado utilizando o design assistido por computador de fármacos. Ao ser testado, o composto exibiu inibição dependente da dose da ligação de rux dois, de um nanomolar a 100 micromolares; 50% da ligação de renx 2D NA pôde ser inibida com apenas 0,01 micromolar do composto.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio de ligação ao DNA e testar potenciais inibidores da ligação ao DNA.