Name: Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprenda um ensaio quantitativo de ligação ao DNA para estudar interações proteína-DNA e identificar reguladores transcricionais. Este método utiliza placas revestidas com estreptavidina e DNA biotinilado para detectar fatores de transcrição como RUNX2 por colorimetria.

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A assistência técnica e instrumentação do Mecanismo de Universidade de Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core, especialmente os drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, é altamente apreciada. O trabalho responsável pelo desenvolvimento deste ensaio foi financiado em parte pelo NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, um VA Prémio de Mérito a AP, e pela Universidade de Maryland cigarro fundos de reembolso (CRF), desde a Marlene &amp; Stewart Centro de Câncer Greenebaum.

Vários passos são realizados antes do tempo e vários reagentes são preparados e armazenados antes do procedimento seguinte: (1) cultura de células e isolamento de proteína, (2) preparação de oligonucleótido, (3) a preparação de placas de 96 poços, (4) o extracto nuclear durante a noite de incubação. Processo requer dois dias, devido à incubação durante a noite das proteínas nucleares com os oligonucleótidos de ADN. 1. Preparação de Amortecedores 1.1 isolamento de proteínas Nuclear <ol><li> Tampão hipotónico: Para preparar 100 ml de tampão hipotónico, adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl 2), 333 ul (3 M KCl) a 98,3 ml de H 2 O. As concentrações finais: 10 mM de HEPES, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM de KCl. Para tampão hipotónico + NP40 (para utilização no passo 2.11): Adicionar 0,5 ml (10% NP40) de 9,5 ml de tampão hipotónico por último NP40 a 0,5%. </li><li> Baixo Sal Tampão: Para preparar 100 ml de tampão de sal baixo (para uso na etapa 2.15), adicionar 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl 2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 73 ml de H 2 O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM. </li><li> Tampão de sal elevado: Para preparar 100 ml de tampão de elevado teor de sal (para utilização no passo 2.15), adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 47 ml de H 2 O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, KCl 800 mM, EDTA 0,2 mM. </li><li> 10% de NP40 Detergente: 10 ml de NP40 a 90 ml de H2O </li><li> Os inibidores de protease e fosfatase [adicionado ao tampão hipotônico + NP40 (passo 2.11), ao buffer de sal baixo (passo 2.15), e tampão elevado de sal (passo 2.15) pouco antes de usar]: Adicionar 2,5 mL (1 M DTT) e 50 ul de inibidores de protease (100x) de 5 ml de cada tampão para uma concentração final de DTT 0,5 mM e inibidores de protease de 1x. A mistura da pasta de 100x inibidor de protease inclui:fluoreto de sódio (Ser / Thr, fosfatases ácidas), ortovanadato de sódio (Tyr, fosfatase alcalina), β-glicerofosfato (fosfatases Ser / Thr), pirofosfato de sódio (fosfatases Ser / Thr), Aprotinina (Ser proteases), Bestatina (amino-peptidases ), E64 (proteases de cisteína), leupeptina (proteases Ser / Cys), EDTA (metaloproteases). </li></ol> 1.2 Preparação das placas de ensaio <ol><li> Placa de solução de fixação: Para preparar 500 ml de solução, adiciona-se carbonato de sódio a 5,25 g para 500 ml de H2O, misturar bem e ajustar o pH a 9,7 para uma concentração final de carbonato de sódio 0,1 M. </li><li> Placa de solução de bloqueio: Para preparar estoque de poli dI / dC oligonucleótido, ressuspender 1 Unidade (~ 50 mg) de poli dI / dC em 1 ml de 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, contendo EDTA 1 mM para uma concentração de estoque de 50 mg / ul. Banco é diluída para 1 mg / mL antes da utilização. </li></ol> 1,3 buffers de lavagem e diluições de anticorpos NOTA: tampão de lavagem é Streptavidin<html> utilizada para lavar pratos, entre adições e para diluir os anticorpos primários e secundários. <ol><li> Para preparar 1 litro de tampão de lavagem de estreptavidina, adicionar 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), a 1 L de água filtrada Millipore estéril , pH 7,18. Armazenar a 4 ° C. As concentrações finais: 20 mM Tris / HCl, NaCl 150 mM, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20. </li></ol> 1.4 tampão de ligação ao DNA NOTA: Este tampão é armazenado a -20 ° C. <ol><li> Para preparar 15 ml de tampão de ligação de ADN, adicionar 180 ul (1 M de HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 mL (1 M DTT), 3,0 ml (60% de glicerol), 300 uL (50 ug / mL de poli dI / dC) diluída com água desionizada / destilada H 2 O (12 ml). As concentrações finais: 12 mM HEPES / pH 7,9, KCl 60 mM, EDTA 0,4 mM, DTT 0,5 mM, 12% de glicerol, 1 ug / mL de poli dI / dC. </li></ol> 2. Cultura de Células e Isolamento Proteína Nuclear t &quot;&gt; NOTA: A preparação requer cerca de 3 horas de estimulação de células dependerá de experiência O número de células utilizadas para cada experiência irá variar e todos os volumes de reflectir uma experiência típica usando 3 x 10 7 células / ponto Ajustar para acomodar volumes... o número de células realmente usado na experiência 6. <ol><li> Para preparar proteína nuclear para ensaios de ligação de DNA, células humanas de cultura que expressam RUNX2 (endotelial, osteossarcoma, células de câncer de mama) nos meios de comunicação apropriados 6. </li><li> Tratamento de células confluentes com nocodazole (0,2 ug / ml para 16 horas), para reter as células na fase G2 / M do ciclo celular 6 fronteira. Sob estas condições, a proteína é estabilizada RUNX2 e ADN ligação máxima é alcançada. Desta forma, a proteína nuclear suficiente disponível para ensaios múltiplos e inibidores podem ser comparados a partir da mesma preparação. </li><li> Para cada passo, pré-arrefecer a centrífuga a 4 ° C e preparar tampões e relaxar 20 min a 4 ° C antes da colheita de células.</li><li> Células Frio (4 ° C) e procedimentos de conduta no gelo. </li><li> Células centrifugar a 1.000 rpm por 5 min em 15 ml de polipropileno tubo de fundo redondo. </li><li> Wash 1x com PBS gelado (Ca 2 + e Mg 2 + livre). </li><li> Centrifugar novamente e descartar PBS sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão hipotónico, sem inibidores de protease, tendo o cuidado para ressuspender completamente o sedimento celular. </li><li> Transferir o conteúdo para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar imediatamente a 5.500 rpm para 5,5 min; desprezar o sobrenadante e manter o pellet celular. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão hipotónico contendo 0,5% de NP40. Adicionar protease e inibidores de fosfatase e DTT 0,5 mM (conforme descrito no passo 1.1.5). </li><li> Deixar a amostra repousar em gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante (contém as proteínas citosólicas). </li><li> Ressuspender o sedimento em 60 mL nuclear cada um baixo saltampão T (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) e tampão de elevado teor de sal (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) para um total de 120 ul. Adicionar 60 ul de tampão de baixa salinidade para o sedimento primeiro e ressuspender, em seguida, adicionar 60 ul de tampão de alto teor salino. Vortex a pelota para ajudar na re-suspensão. </li></ol> NOTA: Este passo ajuda a se livrar de algumas das proteínas da membrana nuclear e configurar para a etapa de lise: baixo teor de sal primeiro (ressuspender pellet, vortex), depois de alta de sal (vórtice) otimiza este passo. Manter extracto em gelo durante 30 min, com agitação em vórtex após os primeiros 10 min. <ol start="16"><li> Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min, manter-se o sobrenadante contendo a proteína nuclear. </li><li> Medir a concentração de proteína (tentar manter amostras de 2-5 mg / ml), da alíquota em quantidades adequadas (10 mL / tubo) e armazenar a -80 ° C. </li></ol> NOTA: rendimento estimado: 30 x 10 6 cells irá dar origem a 5 ug / mL de proteína em 120 pi. 5 x 10 6 células irá originar 2,2 ug / mL de proteína em 40 ul. 3. Preparação de Duplo Stranded Oligonucleotídeo <ol><li> Projete oligonucleotídeos complementares com sites meia compatíveis nas extremidades. Para RUNX2 estes são: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-biotina (sentido) e 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-biotina (antisense). </li></ol> NOTA: As experiências-piloto determinou que três sítios de ligação Runx2 e single-end biotina marcada produziu os resultados mais reprodutíveis. <ol start="2"><li> Preparar tampão de emparelhamento 5x: Adicionar 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 ul (1 M MgCl 2), 10 ul (1 M DTT) a 260 mL de H 2 O (600 mL final). </li><li> Para 200 pmol de cada oligo de cadeia simplesonucleotide (3 mL), adicionar 12 ul de tampão de emparelhamento 5x e 45 mL de H 2 O para um total de 60 uL (200 pmol/60 ul). </li><li> Aquece-se a 95 ° C durante 5-10 min num bloco de aquecimento. </li><li> Arrefecer até 65 ° C lentamente (ajustando a temperatura para 65 ° C, leva-se 15 minutos), depois arrefece-se até à temperatura ambiente lentamente ao desligar a energia do bloco de aquecimento (ou colocando em 50 ml de água a 65 ° C num copo com gelo, o que demora cerca de 15-20 minutos). </li></ol> 4. Preparação de placas de 96 poços NOTA: Não use proteínas do leite nos buffers de lavagem. <ol><li> Fix placa com solução de fixação (carbonato de sódio 0,1 M): adicionam-se 300 ul / poço. </li><li> Incubar durante 2 horas por balançar à temperatura ambiente (RT), ou sem balançar a 4 ° C (S / N). </li><li> Lavar 3x com tampão de lavagem de placa de estreptavidina (WB): adicionam-se 300 ul / poço de cada vez. </li><li> Adicionar oligonucleótido de cadeia dupla marcado com biotina (sítios de ligação de consenso por três nucleótidos) durante 2 h wom de balanço (1,25 nmol / poço, 100 uL / ​​poço). </li><li> Lavar 3x com frio WB: adicionar 300 mL / poço e depois inverta imediatamente a placa em uma pia e secar as bordas sobre uma toalha de papel após cada adição. </li></ol> NOTA: Não utilize pontas de pipeta para remover o líquido das placas, pois isso pode raspar avidina: biotina: complexos de DNA de poços. Faça isso para todos os passos de lavagem subsequentes. 5. Incubação com Extrato Nuclear NOTA: Não substituir salmão ou arenque DNA do esperma para o poli tampão de bloqueio dI / DC. Evite bloquear placas com proteínas do leite. Ambos estes agentes bloqueadores resultar em elevados valores de fundo. <ol><li> Incubar com fator de transcrição específico à base de extrato nuclear (90 mL / poço). Prepare uma mistura de mestre contendo extrato nuclear (proteína de ligação de DNA; 3-9 mg / poço) tampão + poli dI / DC (1 mg / mL a partir de um estoque de 50 mg / ul) em DNA 1x vinculativo. O volume é tão necessária para o número total depoços necessários (90 ul / poço). </li><li> Qualquer inibidor potencial, tais como a vitamina D3 (Figura 2) ou composto CADD 5.221.975 (Figura 3), ou a diluição apropriada do controlo de solvente, tal como etanol, é adicionado neste passo. </li><li> Coloque placa de balanço plataforma, O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x com WB: adicionar 300 uL / ​​poço </li></ol> 6. A adição de primário Anticorpo NOTA: diluições anticorpo primário deve ser preparado - armazenamento não é recomendado. <ol><li> Dilui-se o anticorpo monoclonal específico para RUNX2 (estoque 1 mg / mL) 1/5, 000, em tampão de lavagem de estreptavidina. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado. </li><li> Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. </li><li> Lavar 3x com WB; adicionar 300 l / poço. </li></ol> 7. A adição de um anticorpo secundário NOTA: diluições de anticorpos secundários podem ser stovermelho, a 4 ° C durante a noite, se necessário, no dia seguinte. <ol><li> Diluir F purificada por afinidade, anticorpo conjugado com HRP (7,1 mg / ml) de ab-específica para 1:1,400 em estreptavidina Tampão de lavagem: tampão de 3,5 ul antibody/5.0 ml de lavagem. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado. </li><li> Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. </li><li> Wash 6x com WB invertendo a placa em pia (300 mL / poço). </li></ol> 8. HRP Substrato e Desenvolvimento de Produto <ol><li> Adicionar 50 mL de substrato TMB por poço diretamente do frasco estoque. </li><li> Incubar 10-20 minutos à temperatura ambiente no escuro (parar método de reação) ou medir absorção direta (monitoramento cinética contínua). </li></ol> 9. Medição Reaction <ol><li> Pare método de reação: Para reação parada visual, verificar se há mudança de cor de claro a azul e parar de reação com ácido sulfúrico 50 mL. </li><li> Medir a absorvância a 450 nm como Biotrak II espectrofotômetro leitor de placa visível (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, EUA) ou um instrumento similar. </li><li> Método cinético contínuo monitoramento: Adicionar substrato após a última lavagem e apenas antes de colocar no espectrofotômetro (não pare a reacção). </li><li> Medir a absorvância a 635 nm com o Bio-Tek Synergy HT Multi-reação leitor de microplacas espectrofotômetro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, EUA) ou um instrumento similar. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li>
<li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497(2009).</li>
<li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TransLISA%2C+a+novel+quantitative%2C+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li>
<li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li>
<li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+%28cholecalciferol%29+prohormone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li>
<li>Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+P+%22Biotek+Instruments+Application+Note%22">Biotek Instruments Application Note</a>. , Biotek. 
	Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf">http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf</a> (2007).</li>
<li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21(2001).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+I+inhibitors%3A+chemistry%2C+biology%2C+and+interfacial+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li>
<li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Os ensaios de ligação de ADN são usadas para medir a capacidade de factores de transcrição que interagem com o ADN. Os ensaios para a ligação de ADN incluem deslocamento da mobilidade electroforética (EMSA) e 1 immuneprecipitation cromatina (ChIP) Ensaios baseados em 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 cavidades 4 tais como ensaios quimioluminescentes 2. A EMSA não é quantitativa e usa radioativo (32 P) oligonucleotídeos. Estas são incubadas com as prote...

Os ensaios de ligação a DNA têm utilidade na medição da capacidade dos factores de transcrição que interagem com o ADN. Ensaios para DNA de ligação incluem ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) que dependem de oligonucleotídeos radiolabeled 1 ou 2 ensaios de quimiluminescência. Ensaios de cromatina immuneprecipitation (ChIP) com base 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 poços 4 foram também descritas. No entanto, o EMSA é um ensaio quantitativo que não requer o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente. Quando as proteínas nucleares associar com as sequências de nucleótidos de promotores específicos, complexos de ligação são retardados em géis de poliacrilamida e o factor de transcrição específico pode ser validado com um anticorpo &quot;supershift&quot;. Nós desenvolvemos um ensaio quantitativo de ligação de ADN utilizando um formato de imunossorvente ligado a enzima (ELISA-D), o qual é capaz de medir a interacção de RUNX2 com sequências de ligação de ADN correspondentes aos elementos promotores definidos igenes alvo n Runx2. Utilização de um anticorpo anti-RUNX2 fornece especificidade para o ensaio e a ausência de marcação radioactiva distinguir este ensaio a partir do teste de deslocamento em gel tradicional 5. Detecção de complexos de ligação é possível com a utilização de um anticorpo secundário acoplado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato de HRP, tetrametilbenzidina (TMB) a um produto de cor para a análise espectrofotométrica. O ensaio aqui relatado pode incorporar a utilização de oligonucleótidos de ADN mutados como controlo e pode ser utilizada para detecção de inibidores competitivos ou não-competitivos da ligação de DNA. O rastreio de compostos anti-tumorais novos também é possível com este ensaio.

<table><tbody><tr><td>Poly dI/dC</td><td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td><td>US20539-5UN</td><td>1 U ~50mg</td></tr><tr><td>Anticorpo RUNX2</td><td>MBL International Corp., Woburn, MA</td><td>D130-3</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Anticorpo conjugado com peroxidase específico para Fab</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9917</td><td>7,1 mg/ml</td></tr><tr><td>TMB Substrato (tetrametilbenzidina)</td><td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td><td>X1189S</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>57995</td> Ácido sulfúrico <td>de fixação de placas</td></tr><tr><td></td><td>VWR, West Chester, PA</td><td>BDH-39922-1</td><td>Solução de parada</td></tr><tr><td>Placas de vários poços</td><td>Greiner Bio-One, Basel, Suíça</td><td>655996</td><td>Revestidas com Avidin, lados pretos</td></tr><tr><td>HALT</td><td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td><td>78440</td><td>Inibidores de protease e fosfatase</td></tr><tr><td>Produtos químicos</td><td>Vários fabricantes</td><td>Grau</td><td></td> de laboratório</tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Reagentes</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro: Biotrak II Leitor de placas visíveis</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td>Para uso com método de reação de parada</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro: Bio-Tek Synergy HT Leitor de microplacas de reação múltipla</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td><td></td><td>Para uso com monitoramento cinético contínuo</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Equipamento</forte></td></tr></tbody></table>

uma análise quantitativa para o estudo de proteína: dna interações, discover transcricionais reguladores de expressão gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Muitos ensaios de ligação de ADN, tais como ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), ensaios quimioluminescentes, imunoprecipitação da cromatina (ChIP) à base de ensaios e ensaios baseados em múltiplos poços são usadas para medir a actividade do factor de transcrição. No entanto, estes ensaios são não quantitativa, carecem de especificidade, pode envolver o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente, e pode não ser adaptável para a triagem de inibidores de ligação de ADN. Por outro lado, utilizando uma enzima ligada ao ensaio quantitativo de ligação de ADN imunossorvente (ELISA-D) de ensaio, que demonstram as interacções de proteínas nucleares com ADN, usando o factor de transcrição RUNX2 que dependem associação específica com as sequências de consenso de ligação de ADN presentes em biotina- oligonucleótidos marcados. Preparação de células, a extracção de proteínas nucleares, e concepção de oligonucleótidos de cadeia dupla são descritos. Placas de 96 poços revestidas com avidina foram fixados com tampão alcalino e incubadas com as proteínas nucleares, em tampão de bloqueio de nucleótidos. Folldevido a uma lavagem exaustiva das placas, o anticorpo primário específico e as incubações do anticorpo secundário é seguida pela adição de substrato de peroxidase de rábano e o desenvolvimento da reacção colorimétrica. Modo de reação Parar ou monitoramento contínuo cinética foram usados ​​para medir quantitativamente a interação de proteínas com o DNA. Discute-se controlos adequados de especificidade, incluindo o tratamento com a IgG não específica ou sem proteína ou o anticorpo primário. Aplicações do ensaio encontram-se descritos, incluindo a sua utilidade na triagem de drogas e de resultados positivos e negativos representativos são discutidos.

O método D-ELISA é altamente específico para a proteína de ligação de ADN designado enquanto, um oligonucleótido específico da sequência de cadeia dupla contendo três cópias do local de ligação de consenso RUNX2 (ACACCA) é usado. O anticorpo primário que reconhece o factor de proteína, também aumenta a especificidade. O anticorpo secundário contém covalentemente ligado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato transparente (tetrametil benzidina) para um produto corado para facilidade de detecção (F...

Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real.

Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um ensaio quantitativo de ligação ao DNA, útil para examinar interações proteína-DNA, descobrir reguladores transcricionais da expressão gênica e identificar novos agentes anti-tumorais. Isso é realizado primeiramente preparando uma placa de ensaio revestida com estreptavidina e um alvo de DNA BIOTINILADO apropriado. O segundo passo consiste em adicionar proteínas de extrato nuclear com ou sem inibidores potenciais e permitir que se liguem ao alvo de DNA.Em seguida, os fatores de transcrição ligados são detectados com anticorpos primários e anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano (horse radish peroxidase). O passo final consiste em adicionar um substrato de peroxidase de rábano aos poços para induzir o desenvolvimento da coloração. Por fim, o desenvolvimento da coloração é medido com o espectrofotômetro.Com o tempo, a quantidade de mudança de cor indicará o grau de ligação ao DNA e o efeito de inibidores potenciais da ligação ao DNA. A principal vantagem desta técnica em relação a outras, como o ensaio de mobilidade eletroforética em gel, é que se trata de um ensaio quantitativo de ligação de inibidores ao DNA. Para

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Biologia

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Este vídeo demonstra um ensaio in vivo em bactérias para estudar a interação de proteínas de ligação a RNA (RBPs) com RNA. As células bacterianas são transformadas com duas construções de plasmídeo - um plasmídeo de sítio de ligação que codifica um mRNA contendo um gene repórter fluorescente a jusante de um sítio de ligação de RBP - enquanto um plasmídeo RBP expressa as proteínas RBP sob o controle de um indutor. Após o aumento mediado por indutor na produção de RBP, os RBPs se ligam ao mRNA,...

Ensaio de repressão gênica repórter para estudar a regulação translacional de um gene alvo

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para examinar funcionalmente a transcrição e a atividade inibitória de agentes antibacterianos direcionados à transcrição bacteriana.

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

Aqui, um ensaio in vitro anticorpo-livre para a análise direta da atividade do metiltransferase no RNA transcrito sintético ou in vitro é descrito.

Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Aqui, apresentamos um método in vitro otimizado para descobrir, quantificar e validar interatores proteicos de sequências específicas de RNA, usando extrato proteico total de células humanas, esferas de estreptavidina revestidas com RNA biotinilado e análise por espectrometria de massas.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Aprenda um ensaio quantitativo de ligação ao DNA para estudar interações proteína-DNA e identificar reguladores transcricionais. Este método utiliza placas revestidas com estreptavidina e DNA biotinilado para detectar fatores de transcrição como RUNX2 por colorimetria.

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Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

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