Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um ensaio quantitativo de ligação ao DNA, que é útil no exame de interações de DNA de proteínas, na descoberta de reguladores transcricionais da expressão gênica e na identificação de novos agentes antitumorais. Isso é feito primeiro preparando uma placa de ensaio revestida com estreptavidina com um alvo de DNA BIOTINILADO apropriado. O segundo passo é adicionar proteínas de extrato nuclear com ou sem inibidores potenciais e permitir que elas se liguem ao alvo de DNA.

Em seguida, os fatores de transcrição ligados são detectados com anticorpos primários e anticorpos secundários acoplados à peroxidase de rabanete. A etapa final é adicionar um substrato de peroxidase de rabanete aos poços para provocar o desenvolvimento da cor. Em última análise, o desenvolvimento da cor é medido com o espectrofotômetro.

Com o tempo, a quantidade de mudança de cor indicará o grau de ligação ao DNA e o efeito de potenciais inibidores da ligação ao DNA. A principal vantagem desta técnica sobre outras técnicas, como o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética, é que ela é um ensaio quantitativo de ligação ao inibidor de DNA. Para começar, prepare um número adequado de culturas de células consistindo de pelo menos três vezes 10 a sete células para cada condição testada.

Aqui, estão sendo utilizadas células endoteliais da medula óssea humana, que expressam a proteína run X two. Uma vez que as células são 80% confluentes. Trate as células com 0,2 microgramas por mililitro, sem conazol para interromper o crescimento celular no limite do ciclo celular G dois M.

Isso estabilizará a proteína run X two e produzirá ligação máxima ao DNA após 16 horas. Ligue as células e isole a proteína conforme indicado no protocolo de texto que acompanha. Uma vez que a proteína tenha sido isolada, meça a concentração de proteína usando um ensaio padrão de BCA.

Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius em alíquotas de 10 microlitros com concentrações entre dois e cinco miligramas por mililitro. Fixe uma placa de 96 poços com uma solução molar de 0,1 de carbonato de sódio adicionando 300 microlitros da mistura por. Bem, prepare bem o suficiente para que cada amostra seja executada em triplicado.

Incube a placa por duas horas em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente. Em seguida, lave a placa três vezes com 300 microlitros de estreptococos ávidos e lave o tampão e incube com 100 microlitros de oligonucleotídeos de fita dupla marcados com biotina a 1,25 nanomoles por poço por duas horas enquanto balança. Em seguida, lave as placas três vezes adicionais com o tampão de lavagem din estreptocócico.

Em seguida, adicione 100 microlitros por poço da mistura principal contendo um tampão de ligação XDNA, proteínas de ligação ao DNA a três a nove microgramas por poço e poli DIGC a um micrograma por poço. Em seguida, adicione a mistura principal contendo qualquer inibidor potencial, como vitamina D três, ou a diluição apropriada do controle de solvente, como etanol, em seus respectivos poços. Em seguida, cubra a placa e coloque-a em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius durante a noite após a incubação com os extratos nucleares.

Lave a placa três vezes com o estreptococo ávido e lave o tampão. Em seguida, adicione 90 microlitros por poço de uma corrida X dois anticorpos monoclonais específicos diluídos a 0,2 nanogramas por microlitro e estreptococos ávidos e tampão de lavagem. Cubra a placa e incube-a em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço por uma hora.

Em seguida, enxágue os poços novamente com estreptococos ávidos e tampão de lavagem e adicione 90 microlitros por poço da mistura de anticorpos secundários contendo cinco nanogramas por microlitro de afinidade específica de fabricação purificado anticorpo conjugado HRP diluído no estreptococo. AVID e tampão de lavagem. Incubar o anticorpo secundário durante 30 minutos à temperatura ambiente numa plataforma de balanço.

Em seguida, lave-o seis vezes com 300 microlitros por poço de Strp e tampão de lavagem. Em seguida, desenvolva os resultados adicionando 50 microlitros de substrato de tetraetila benadina a cada poço diretamente do frasco de estoque para monitoramento contínuo das amostras. Colocar as amostras no espectrofotómetro e medir a absorvância a 635 nanómetros continuamente.

Para uma medição única, incube as amostras por 10 a 20 minutos em temperatura ambiente no escuro. Durante esse período, os poços devem mudar de claro para vários graus de azul. Pare a reação adicionando 50 microlitros de ácido sulfúrico a cada um.

Bem, então meça a absorbância de cada poço a 450 nanômetros usando um leitor de placas de 96 poços. O gráfico mostrado aqui é um exemplo de monitoramento contínuo do efeito da vitamina D três biologicamente ativa na ligação run X 2D NA. As concentrações testadas tiveram pouco efeito sobre a ligação run X 2D NA.

Embora outros compostos de vitamina D tenham demonstrado ter efeitos dramáticos. O composto 5 2 2 1 9 7 5 testado aqui foi identificado usando o design de medicamentos assistido por computador. Após o teste, o composto exibiu uma inibição dose-dependente da ligação rux dois de um nanomolar a 100 micromolar 50% da ligação renx 2D NA foi capaz de ser inibida com apenas 0,01 micromolar do composto.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como realizar o ensaio de ligação ao DNA e testar potenciais inibidores da ligação ao DNA.